本發(fā)明屬于生物微粒子檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種微粒子色度自動聚類分析系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

生物微粒子分析是二十一世紀(jì)興起的多學(xué)科交叉的新型檢測技術(shù)，利用熒光、生物素或其他方法標(biāo)記固定在生物芯片上的dna、rna、抗原、抗體等。通常微粒子(如細(xì)胞、細(xì)菌)直徑在微米級，可基于彩色微球激發(fā)熒光來完成微米級粒子的生物標(biāo)識。通過一次檢測可同時測定多種生物信息，具備高通量及并行檢測的優(yōu)勢，大大節(jié)省試劑和人工，提高了效率。隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)微粒子檢測設(shè)備也不斷出現(xiàn)，儀器和試劑的結(jié)合使得大量信息可以用儀器來判讀，通過軟件分析可以輕松解決。

然而，目前大多數(shù)生物微粒子分析設(shè)備很難實現(xiàn)真正意義上的高通量快速檢測，存在以下不足之處：(1)視場小。專利：(200510063208.9)提出了一種微陣列芯片檢測系統(tǒng)，其視場達(dá)到2mm。根本無法完成微板型生物芯片(384孔板)中每個孔標(biāo)記熒光信息的一次完全檢測，需要通過圖像拼接完成，檢測速度慢；(2)細(xì)胞檢測分辨率低，無法完成細(xì)胞信息的精細(xì)化檢測；(3)熒光成像光譜范圍較窄，熒光通道數(shù)少，檢測能力弱。專利：(201610262872.4)提出了一種激光誘導(dǎo)與ccd采集的生物芯片檢測方法，其采用固定激光器激發(fā)只能檢測對應(yīng)種類的熒光染料，如果需要檢測其它的熒光染料，則需要更換激光器，代價昂貴，并且激光器受激光離散性及中心頻率的限制，只能有幾種熒光染料能用，對完成細(xì)胞的高通量檢測有一定限制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具備大視場高分辨率寬光譜成像的微粒子色度自動聚類分析系統(tǒng)，以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種微粒子色度自動聚類分析系統(tǒng)，其特征在于：包括大面積彩色微粒子平面圖像采集系統(tǒng)，及微粒子色度聚類計數(shù)系統(tǒng)；所述大面積彩色微粒子平面圖像采集系統(tǒng)，包括大視場顯微系統(tǒng)、大靶面相機；大視場顯微系統(tǒng)和大靶面相機有機集成，所述大視場顯微系統(tǒng)將大面積彩色微粒子成像于大靶面相機的圖像傳感器，大靶面相機將圖像傳感器接收的光學(xué)信號轉(zhuǎn)換成計算機圖像，實現(xiàn)物方視場直徑6.36mm面積范圍內(nèi)所有彩色微粒子在對角線尺寸為32.36mm的大靶面相機上成像，系統(tǒng)光學(xué)分辨率達(dá)到3μm。微粒子色度聚類計數(shù)系統(tǒng)對前述圖像進(jìn)行微粒子圖像分割、色度識別并依據(jù)微粒子的色度進(jìn)行聚類統(tǒng)計，輸出大面積內(nèi)彩色微粒子的統(tǒng)計信息供分析使用。

所述的大面積彩色微粒子平面圖像采集系統(tǒng)，采集面積不小于1000000μm²，微粒子粒徑不大于100μm；所包括的大視場顯微系統(tǒng)，其物方視場不小于1000000μm²；所包括的大靶面相機成像靶面對角線尺寸不小于25400μm。

所述的大面積彩色微粒子平面圖像采集系統(tǒng)，還包括自動對焦機構(gòu)，達(dá)到彩色微粒子快速精確對焦成像效果。通過控制z軸電機帶動成像物鏡上下運動，改變物距實時成像，提取計算機圖像有效區(qū)域和對焦窗口，轉(zhuǎn)換成灰度圖像，再通過中值濾波去噪及圖像銳化增強處理；將對焦區(qū)域內(nèi)微粒子邊緣灰度梯度值作為清晰度計算評價函數(shù)；先用z軸電機大步長搜索得出整個行程內(nèi)對焦評價函數(shù)值的最大值，搜索清晰度是否為最大值，是，則確定最佳對焦范圍，再進(jìn)行小步長搜索，確定清晰度值是否最大，是，則完成對焦。

所述的大面積彩色微粒子平面圖像采集系統(tǒng)，還包括樣品自動掃描機構(gòu)，通過控制x/y軸電機運動，實現(xiàn)陣列式樣品檢測池的圖像掃描采集，達(dá)到微粒子高標(biāo)本快速檢測的效果。

陣列式樣品檢測池，包括2個以上的樣品檢測杯，每個樣品檢測杯容量不低于10μl，樣品檢測池內(nèi)所有樣品檢測杯的內(nèi)底部在同一平面。

所述微粒子色度聚類計算系統(tǒng)包括圖像空間轉(zhuǎn)換模塊，其將獲取的計算機圖像從rgb空間轉(zhuǎn)換到hsv空間；圖像預(yù)處理模塊，將獲取的計算機圖像進(jìn)行去除本底背景顏色，以及去除計算機圖像中邊緣區(qū)域亮度低的部分；微粒子檢測模塊，其用于檢測微粒子在計算機圖像中的位置；微粒子聚類模塊，其用于統(tǒng)計計算機圖像中微粒子連通區(qū)域的個數(shù)，并根據(jù)單個微粒子所占像素面積、連通區(qū)域的像素面積，計算每個連通區(qū)域中微粒子的個數(shù)，對已檢測到的微粒子進(jìn)行色度提取計算及聚類統(tǒng)計；輸出模塊，其用于對圖像中微粒子進(jìn)行統(tǒng)計結(jié)果顯示及保存。

所述圖像預(yù)處理模塊是利用獲取計算機圖像時所采用光源的h分量范圍對計算機圖像進(jìn)行顏色開窗操作，實現(xiàn)去除本底背景顏色；設(shè)置所采用光源的v分量上的亮度閾值，去除計算機圖像中邊緣區(qū)域亮度低的部分，保留所需的中間圖像。通過對中間圖像去噪及銳化處理，根據(jù)灰度、色度特征把微粒子從背景中分離出來。

所述微粒子檢測模塊采用距離變換，分水嶺分割算法和形態(tài)學(xué)分割相結(jié)合的方法，使得粘連微粒子能夠完全準(zhǔn)確的分割出來。

所述微粒子聚類模塊對于已檢測到的微粒子區(qū)域像素色度的均值，包括h分量和s分量，依據(jù)h分量和s分量數(shù)值分配組合對大面積范圍內(nèi)彩色微粒子進(jìn)行聚類統(tǒng)計。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明通過將大視場顯微系統(tǒng)、大靶面相機結(jié)合，實現(xiàn)超大視場高分辨率寬光譜成像；將樣品自動掃描機構(gòu)及自動對焦機構(gòu)與大視場顯微系統(tǒng)有機結(jié)合，實現(xiàn)快速高通量(高標(biāo)本數(shù))成像；基于微粒子色度聚類計數(shù)系統(tǒng)完成成像圖像中微粒子統(tǒng)計計算，實現(xiàn)高通量(高指標(biāo)數(shù))檢測。

附圖說明

圖1為本發(fā)明整體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明大視場顯微系統(tǒng)光路原理示意圖；

圖3為本發(fā)明大視場顯微系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖；

圖4為本發(fā)明放大成像模塊結(jié)構(gòu)圖；

圖5為本發(fā)明變束準(zhǔn)直模塊結(jié)構(gòu)圖；

圖6為本發(fā)明色度提取系統(tǒng)流程圖；

圖7為本發(fā)明數(shù)字圖像自動對焦處理流程圖。

附圖標(biāo)記：

1-密閉外殼；2-大視場顯微系統(tǒng)；20-大靶面相機；21-放大成像模塊；22-樣品自動掃描機構(gòu)；23-變束準(zhǔn)直模塊；24-分光模塊；25-led或半導(dǎo)體激光器；26-成像物鏡；27-自動對焦機構(gòu)；220-陣列式樣品檢測池；a217-濾光片；216-凸透鏡；215-凹凸透鏡；214-凸透鏡；213-凹凸透鏡；212-凸凹透鏡；211-凸凹透鏡；b210-濾光片；233-凹透鏡；232-凸透鏡；231-凹透鏡；230-凸透鏡。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

在以下實施例中，如圖1-6所示，微粒子色度自動聚類分析系統(tǒng)包括密閉外殼1、位于該外殼1內(nèi)的大面積彩色微粒子平面圖像采集系統(tǒng)及微粒子色度聚類計數(shù)系統(tǒng)；大面積彩色微粒子平面圖像采集系統(tǒng)，包括大視場顯微系統(tǒng)2，大靶面相機20；大視場顯微系統(tǒng)2將大面積彩色微粒子成像于大靶面相機20的圖像傳感器，大靶面相機20將圖像傳感器接收的光學(xué)信號轉(zhuǎn)換成計算機圖像；微粒子色度聚類計數(shù)系統(tǒng)對前述圖像進(jìn)行微粒子圖像分割、色度識別并依據(jù)微粒子的色度進(jìn)行聚類統(tǒng)計，輸出大面積內(nèi)彩色微粒子的統(tǒng)計信息供分析使用。

所述大視場顯微系統(tǒng)2包括led或半導(dǎo)體激光器、變束準(zhǔn)直模塊23、分光模塊24，所述變束準(zhǔn)直模塊23位于所述led或半導(dǎo)體激光器25與所述分光模塊24之間；包括位于所述分光模塊24上方的放大成像模塊21、位于所述分光模塊24下方的成像物鏡26；還包括大靶面相機20，其設(shè)于所述放大成像模塊21的最上方；樣品自動掃描機構(gòu)22，其位于所述成像物鏡26的最下方，用于自動完成陣列式樣品檢測池220的自動x/y方向掃描運動。

所述的大面積彩色微粒子平面圖像采集系統(tǒng)，采集面積不小于1000000μm²，微粒子粒徑不大于100μm；所包括的大視場顯微系統(tǒng)2，其物方視場不小于1000000μm²；所包括的大靶面相機20成像靶面對角線尺寸不小于25400μm。

所述大視場顯微系統(tǒng)將大面積彩色微粒子成像于大靶面相機的圖像傳感器，是指：將所述led或半導(dǎo)體激光器25水平布置，光束通過變束準(zhǔn)直模塊23耦合成較大均勻光斑；分光模塊24由激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片及呈45°布置的二向色鏡；所述光斑進(jìn)入分光模塊24，首先通過激發(fā)濾光片，再進(jìn)入呈45°布置的二向色鏡反射，反射光通過成像物鏡26照射在樣品自動掃描機構(gòu)22上的陣列式樣品檢測池220上，激發(fā)所述陣列式樣品檢測池220的微粒子產(chǎn)生特定波長的熒光信息，所述熒光信息通過上方成像物鏡26進(jìn)入呈45°布置的二向色鏡，再透射所述發(fā)射濾光片進(jìn)入放大成像模塊21，同時將陣列式樣品檢測池220中的熒光信息分別二次變倍成像在最上方的大靶面相機20上。

所述陣列式樣品檢測池220由384個樣品檢測杯組成，每次完成一個樣品檢測杯的熒光激發(fā)，每個樣品檢測杯中的熒光信息通過上方成像物鏡26進(jìn)入呈45°布置的二向色鏡，再透射所述發(fā)射濾光片進(jìn)入放大成像模塊21，放大成像模塊21可提高孔中熒光成像質(zhì)量實時校正熒光的球差、像差及色差，同時將每個樣品檢測杯中的熒光信息二次變倍成像在最上方的大靶面相機20上。基于數(shù)字圖像處理控制z軸對焦機構(gòu)，帶動成像物鏡上下運動完成精確對焦。通過電動載物平臺x/y二維方向自動掃描運動完成孔板樣品的384個樣品檢測杯中熒光信息自動快速檢測。

所述放大成像模塊21由8片鏡片組成，自光線入射方向依次為：濾光片a217、凸透鏡216、凹凸透鏡215、凸透鏡214、凹凸透鏡213、凸凹透鏡212、凸凹透鏡211、濾光片b210，各透鏡排列在一條中軸線上。顯微成像系統(tǒng)一方面實現(xiàn)對激發(fā)光的屏蔽，使得熒光信號能完全通過，提高成像信噪比；同時實時校正熒光成像出現(xiàn)球差、像差及色差缺陷，實現(xiàn)400-700nm波段光通過率高達(dá)98％，另外還具有二次變倍功能，實現(xiàn)有效放大倍率為1.11倍。

成像物鏡26放大倍率為4倍，數(shù)值孔徑na為0.16，具備平場復(fù)消色差功能，能校正球差、相差、慧差。

本發(fā)明的大視場顯微系統(tǒng)物方視場達(dá)到直徑6.36mm，光學(xué)分辨率3μm，系統(tǒng)有效放大倍率為4.44倍；一次掃描可完成384標(biāo)本檢測，每個標(biāo)本最多可實現(xiàn)36000種指標(biāo)檢測。通過樣品自動掃描機構(gòu)22實現(xiàn)陣列式樣品檢測池220的384個檢測杯中所有信息快速捕獲對準(zhǔn)，借助自動對焦機構(gòu)27完成每個檢測杯中微粒子圖像精確自動對焦，最后依靠放大成像模塊21完成成像，同時借助圖像處理軟件完成自動圖像處理及數(shù)據(jù)分析。

所述變束準(zhǔn)直模塊23由4片鏡片組成，自光束入射前至后依次為凹透鏡233、凸透鏡232、凹透鏡231、凸透鏡230，各透鏡排列在一條中軸線上，將半導(dǎo)體激光器或led輸出的光束擴大到直徑6.36mm，同時保證光斑亮度均勻。

大靶面相機20為行間轉(zhuǎn)移型，分辨率不低于4896×3264，像元大小為5.5μm×5.5μm，光譜響應(yīng)范圍為：400-1000nm，靶面尺寸為：26.93×17.95mm。

半導(dǎo)體激光器或led中心波長為390nm，半波寬度10nm，熒光素發(fā)射光譜范圍為440-700nm。

所述的大面積彩色微粒子平面圖像采集系統(tǒng)，還包括樣品自動掃描機構(gòu)27，通過控制x/y軸電機運動，實現(xiàn)陣列式樣品檢測池220中微粒子圖像掃描采集。

陣列式樣品檢測池，包括2個以上的樣品檢測杯，每個樣品檢測杯容量不低于10μl，樣品檢測池220內(nèi)所有樣品檢測杯的內(nèi)底部在同一平面。

所述微粒子色度聚類計算系統(tǒng)包括圖像空間轉(zhuǎn)換模塊，其將獲取的計算機圖像從rgb空間轉(zhuǎn)換到hsv空間；圖像預(yù)處理模塊，將獲取的計算機圖像進(jìn)行去除本底背景顏色，以及去除計算機圖像中邊緣區(qū)域亮度低的部分；微粒子檢測模塊，其用于檢測微粒子在計算機圖像中的位置；微粒子聚類模塊，其用于統(tǒng)計計算機圖像中微粒子連通區(qū)域的個數(shù)，并根據(jù)單個微粒子所占像素面積、連通區(qū)域的像素面積，計算每個連通區(qū)域中微粒子的個數(shù)，對已檢測到的微粒子進(jìn)行色度提取計算及聚類統(tǒng)計；輸出模塊，其用于對圖像中微粒子進(jìn)行統(tǒng)計結(jié)果顯示及保存。

所述圖像預(yù)處理模塊是利用獲取計算機圖像時所采用光源的h分量范圍對計算機圖像進(jìn)行顏色開窗操作，實現(xiàn)去除本底背景顏色；設(shè)置所采用光源的v分量上的亮度閾值，去除計算機圖像中邊緣區(qū)域亮度低的部分，保留所需的中間圖像。通過對中間圖像去噪及銳化處理，根據(jù)灰度、色度特征把微粒子從背景中分離出來。

所述微粒子檢測模塊采用距離變換，分水嶺分割算法和形態(tài)學(xué)分割相結(jié)合的方法，使得粘連微粒子能夠完全準(zhǔn)確的分割出來。

所述微粒子聚類模塊對于已檢測到的微粒子區(qū)域像素色度的均值，包括h分量和s分量，依據(jù)h分量和s分量數(shù)值分配組合對大面積范圍內(nèi)彩色微粒子進(jìn)行聚類統(tǒng)計。

如圖7所示，所述的大面積彩色微粒子平面圖像采集系統(tǒng)，還包括自動對焦機構(gòu)27，通過控制z軸電機帶動成像物鏡26上下運動，改變物距實時成像，提取計算機圖像有效區(qū)域和對焦窗口，轉(zhuǎn)換成灰度圖像，再通過中值濾波去噪及圖像銳化增強處理；將對焦區(qū)域內(nèi)微粒子邊緣灰度梯度值作為清晰度計算評價函數(shù)；先用z軸電機大步長搜索得出整個行程內(nèi)對焦評價函數(shù)值的最大值，搜索清晰度是否為最大值，是，則確定最佳對焦范圍，再進(jìn)行小步長搜索，確定清晰度值是否最大，是，則完成對焦。

自動對焦機構(gòu)27通過z軸電機帶動成像物鏡上下運動，行程為15mm，分辨率為0.2μm，基于數(shù)字圖像處理算法控制其完成精確對焦。

電動載物平臺22實現(xiàn)陣列式樣品檢測池220x/y二維運動，其主要由步進(jìn)電機、編碼器、極限傳感器、滾珠絲杠、交叉滾子導(dǎo)軌組成，x方向行程為120mm，y方向80mm，重復(fù)定位精度0.2mm。

大靶面相機獲得計算機圖像后首先提取圖像中有效區(qū)域，并在有效區(qū)域中選取中心及四個角區(qū)域為對焦區(qū)域，然后將圖像轉(zhuǎn)換灰度圖，采用中值濾波去噪，選取7x7矩形陣列像素點為窗口，通過從窗口取出各個像素灰度值按照升序排列，用中位數(shù)也就是中值取代領(lǐng)域像素值，消除圖像中的顆粒噪聲十分有效，在保護(hù)邊緣信息同時使得圖像更加平滑?；诶绽顾阕油瓿蓪箙^(qū)域圖像進(jìn)行銳化增強，使得區(qū)域內(nèi)微粒子細(xì)節(jié)及輪廓更加清晰。將區(qū)域內(nèi)微粒子邊緣灰度梯度值作為清晰度計算評價函數(shù)。先控制z軸電機帶動成像物鏡26大步長搜索得出整個行程內(nèi)對焦評價函數(shù)值的最大值，然后將步長調(diào)小，減小搜索范圍，提高搜索精度，在最大值附近重新搜索，這個過程反復(fù)進(jìn)行，直到得到最高精度的搜索值，最后完成每個樣品檢測杯的自動對焦。

本發(fā)明的上述實施例僅是為說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其他不同形式的變化和變動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。