本發(fā)明涉及防偽領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及核酸序列條型碼基板、防偽標(biāo)簽以及防偽方法。
背景技術(shù)：
偽劣商品一直以來是我國乃至全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展所面臨的一個嚴(yán)重問題。目前我國已經(jīng)進(jìn)入一個新的經(jīng)濟(jì)發(fā)展階段，保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)、鼓勵創(chuàng)新越來越成為我國需要著力解決的關(guān)鍵課題。這需要高效的防偽手段來為新創(chuàng)意、新產(chǎn)品保駕護(hù)航。dna防偽是各種防偽手段中的一種，它有如下優(yōu)勢：一、僅20個單位的序列長度，a、t、g、c四種堿基能夠產(chǎn)生天文數(shù)字級的組合。二、dna序列在世界上主要國家都是法律認(rèn)可的證據(jù)。三、dna鏈自然存在，但也可以通過人工剪切或完全人工合成產(chǎn)生各種序列。四、dna是生物分子，對人體沒有危害。五、dna在適當(dāng)?shù)谋４鏃l件下，可以長久保存。目前，dna防偽已經(jīng)成為各類防偽手段中日益受到關(guān)注的一種方法。目前國外的dna防偽公司主要有美國的applieddnasciences、加拿大的dnatechnologies及英國的hydnais等。國內(nèi)也有不少企業(yè)從事dna防偽的研發(fā)。目前dna防偽的主要策略有兩種：第一種是把特定dna序列應(yīng)用于物品表面(通常是商標(biāo))，檢測時通過物理方法獲得該序列后通過pcr或測序進(jìn)行驗證，這種方法的缺點(diǎn)是需要專門的dna檢測設(shè)備而且操作過程對一般人來說較為復(fù)雜，并且無法在現(xiàn)場進(jìn)行實時實地檢測；第二種方法是應(yīng)用dna熒光染料對防偽dna進(jìn)行熒光驗證，但這種方法不具有序列特異性，因此防偽可靠性不足。
目前，國內(nèi)dna防偽產(chǎn)業(yè)呈碎片化，有關(guān)dna防偽技術(shù)的公眾認(rèn)識度與接受度非常低，這與上述問題有密切關(guān)系。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出一種具有具備序列特異性、但又不對分子生物學(xué)設(shè)備及操作者的專業(yè)技能的有過多要求的核酸序列防偽方案。此外，本方案可以與目前已普遍應(yīng)用的條型碼或二維碼實現(xiàn)對接，這不但增加了防偽信息的維度(核酸序列序列+二維碼)，便暴力破解事實上成為不可能。而且，這可以實現(xiàn)防偽物品的區(qū)塊鏈管理與監(jiān)控，因此將會產(chǎn)生巨大的防偽效能與經(jīng)濟(jì)效益。
需要說明的是，為實現(xiàn)具有序列特異性、但又操作簡便的核酸序列防偽，本專利通過核酸雜交并產(chǎn)生熒光的方法來實現(xiàn)序列驗證。只有當(dāng)檢測核酸單鏈(以下稱探針)與靶核酸單鏈(以下稱靶序列)完全匹配時，特異熒光信號才能產(chǎn)生。一般的核酸雜交(southernblot、northernblot、熒光原位雜交(fish))需要至少50℃的雜交溫度，這可能會對一些商品造成損壞。本申請的防偽標(biāo)簽實現(xiàn)了25-37℃的特異性的核酸雜交，核酸單鏈長度限定在了14-25個堿基(2.8x108～1.1x1015種可能序列)的范圍。
在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種核酸序列條型碼基板。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述核酸序列條型碼基板包括：條型碼，所述條型碼包括至少兩種顏色區(qū)；靶序列，所述靶序列負(fù)載在所述二維碼的第一顏色區(qū)，以及非靶序列，所述靶序列負(fù)載在所述二維碼的第二顏色區(qū)。根據(jù)本發(fā)明實施例的條形碼基板，實現(xiàn)了條型碼或二維碼的對接，增加了防偽信息的維度(核酸序列+二維碼)，并且只有探針與稱靶序列完全匹配時，特異熒光信號才能產(chǎn)生，防偽可靠性高。
需要說明的是，本申請所指的核酸包括自然核酸如dna、rna外，還包括一些人工合成的核酸類似物如肽核酸(peptidenucleicacid,pna)、鎖核酸(lockednucleicacid,lna)以及帶化學(xué)修飾堿基的dna或rna。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述核酸序列條型碼基板還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述條型碼為二維碼或一維碼。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述二維碼為quickresponse碼、漢信碼或pdf417碼。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述靶序列的長度為14～25個堿基。有效實現(xiàn)了在25-37℃的特異性的核酸雜交，14-25個堿基所組成的靶序列限定出了2.8x108～1.1x1015種可能序列，這2.8x108～1.1x1015種可能序列的雜交需要用不同的雜交溫度，不適合的溫度導(dǎo)致雜交無法進(jìn)行，而使熒光及相關(guān)圖案無法生成，從而有效增加防偽安全性。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述基板為矩形(含正方形)，邊長為0.5-4cm之間。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述靶序列和非靶序列負(fù)載在所述二維碼的特定顏色區(qū)是通過打印實現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，通過dna微列陣(dnamicroarray)制備技術(shù)將核酸序列固定到基板的表面(具體地，基板表面用含二氧化硅的疏水劑處理，然后通過硅烷偶聯(lián)劑將核酸序列固定到基板上)。
在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了前面所述的核酸序列條型碼基板在制備防偽標(biāo)簽中的用途。根據(jù)本發(fā)明實施例的條形碼基板，實現(xiàn)了條型碼或二維碼的對接，用于制備防偽標(biāo)簽，增加了防偽信息的維度(核酸序列+二維碼)，并且只有探針與稱靶序列完全匹配時，特異熒光信號才能產(chǎn)生，防偽標(biāo)簽的可靠性高。
在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種防偽標(biāo)簽。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述標(biāo)簽包括前面所述的核酸序列條型碼基板。根據(jù)本發(fā)明實施例的防偽標(biāo)簽的可靠性高。
在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種防偽方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：將具有熒光標(biāo)記的探針與靶序列進(jìn)行雜交處理，所述靶序列設(shè)置于前面所述的dna條型碼基板，所述探針特異性識別所述靶序列；以及基于熒光信號，確定真?zhèn)危渲?，具有熒光信號，是真的指示，沒有熒光信號，是假的指示。上述方法不對分子生物學(xué)設(shè)備及操作者的專業(yè)技能的有過多要求，且防偽可信度顯著提高。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述防偽方法還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述熒光標(biāo)記為分子生物學(xué)常用的核酸標(biāo)記熒光染料、包括但不限于fitc(fluoresceinisothiocyanate)、6-fam(6-carboxyfluorescein)、hex(hexachloro-fluorescein)、texasred、tamra(carboxytetramethylrhodamine)、rox(6-carboxyl-x-rhodamine)、cy5(cyanine5)、cy3(cyanine3)、tet(tetrachlorofluorescin)。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述雜交是在25-37℃條件下進(jìn)行的。雜交條件溫和，避免了對不耐高溫材料的損害。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述雜交是在ssc緩沖溶液中進(jìn)行的。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述熒光標(biāo)記均需要特定波長光源激發(fā)。具體地，當(dāng)采用具有fitc標(biāo)記的探針與靶序列進(jìn)行雜交處理時，可以采用激發(fā)波長為495nm的紫外光源來產(chǎn)生待檢測熒光信號。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，熒光標(biāo)記所被激發(fā)的熒光信號是通過彩色信號設(shè)備識別的。彩色信號設(shè)備無特殊要求，只需要能識別有關(guān)彩色信號，并有能將其轉(zhuǎn)換成黑白信號的軟件即可。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述雜交是在37-55℃下進(jìn)行的。發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)，如果雜交序列存在一個或兩個錯配，雜交仍有可能發(fā)生，但較高的溫度可以限制此類雜交的發(fā)生，從而提高安全性。
附圖說明
圖1是根據(jù)本發(fā)明實施例的對預(yù)先打印有核酸靶序列單鏈的條型碼基板用匹配的dna熒光探針進(jìn)行雜交，以顯色得到彩色條型碼的示意圖。
具體實施方式
下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
為實現(xiàn)具有序列特異性、但又操作簡便的dna防偽，發(fā)明人通過核酸序列雜交并產(chǎn)生熒光的方法來實現(xiàn)序列驗證。只有當(dāng)檢測核酸序列單鏈(以下稱探針)與靶核酸序列單鏈(以下稱靶序列)完全匹配時，特異熒光信號才能產(chǎn)生。需要說明的是，一般的核酸雜交(southernblot、northernblot、熒光原位雜交(fish))需要至少50℃的雜交溫度，這可能會對一些商品造成損壞。發(fā)明人通過如下技術(shù)改進(jìn)，實現(xiàn)了25-37℃的特異性的dna-dna雜交。而有關(guān)改進(jìn)的關(guān)鍵是將dna單鏈長度限定在14-25個堿基(2.8x108～1.1x1015種可能序列)的范圍。
具體雜交步驟如下所述。
實施例1核酸序列條型碼基板的制備
目前多種二維碼在包括中國在內(nèi)的多個國家使用，這包括quickresponse(qr)碼、漢信碼等等。圖1為常見25x25qr二維碼，可以將每一灰色小塊轉(zhuǎn)化彩色熒光信號點(diǎn)，而白色小塊轉(zhuǎn)化成無熒光信號點(diǎn)。因此，通過將靶序列加入圖中灰色小塊位置，而非靶序列加入白色塊位置來產(chǎn)生一個二維矩陣，也就是dna二維碼基板(參考圖1)。具體的dna二維碼基板制備過程依照dna芯片的制備過程，從而將核酸靶序列“打印”至預(yù)定位置(本專利中，基板表面用含二氧化硅疏水劑修飾，然后通過硅烷偶聯(lián)劑將核酸序列固定到基板上)。
為進(jìn)一步增加安全性，可以制備雙色甚至更多顏色的二維碼基板。一個靶序列-探針組合對應(yīng)一種顏色。以實現(xiàn)與物品價值相匹配的安全級別。
需要說明的是，雖然以最通用的qr碼為例，但此本申請的方法適用于所有二維或一維條型碼方案(qr碼、漢信碼、colorcode、pdf417碼、及一維條型碼(barcode)等)。
實施例2核酸序列二維碼基板的雜交與熒光二維碼信號的生成(以二維qr碼為例)
雜交液：20xssc溶液(1.75％nacl、0.882％檸檬酸鈉、ph7.0)
探針：熒光標(biāo)記(fitc)的探針(200ng/ul)
雜交及雜交與熒光二維碼信號的生成過程如下所述：
1)打印靶dna的二維碼基板(大小約2x2cm)；
2)取200μl2xssc溶液作為雜交緩沖液，加入1ul探針，混合均勻后加液于基板之上，37℃避光雜交30分鐘，期間用一2.5x2.5cm塑料方盒蓋住雜交區(qū)域避免溶液揮發(fā)；
3)去除雜交液，用2xssc溶液洗板兩遍；
4)在495nm紫外光源下觀察結(jié)果；
5)通過彩色掃碼設(shè)備識別有關(guān)彩色信號，并有能將其轉(zhuǎn)換成黑白信號進(jìn)行分析。
實施例3雜交溫度檢測
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，雜交溫度亦可成為這個防偽策略中系統(tǒng)密鑰中的一部分，這是因為不同的匹配序列需要不同的雜交溫度。因此，不適合的溫度導(dǎo)致雜交無法進(jìn)行，而使熒光及相關(guān)圖案無法生成。因此可以考慮在雙色或多色方案中，不同的序列對采用不同的雜交溫度，從而增加防偽安全性。另外，對高溫有耐受性的材料，也可以使用較高的雜交溫度。發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)，如果雜交序列存在一個或兩個錯配，雜交仍有可能發(fā)生，但較高的溫度(37-55℃)可以限制此類雜交的發(fā)生，從而提高安全性。
在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。
盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。