一種用于鑒定美洲黑楊優(yōu)良無性系的專用引物及其鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及美洲黑楊優(yōu)良無性系的遺傳鑒定方法，具體設(shè)及一種用于鑒定美洲黑 楊優(yōu)良無性系的專用引物及其鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 美洲黑楊(Populus deltoides Marsh.)為楊柳科（Salicacae)楊屬(Populus L.) 黑楊(Aigeiros)樹種。落葉喬木，樹形高大，干形通直圓滿，尖削度小，分枝粗度中等，葉片 大，屯、形，葉色鮮綠，觀賞價值較高;美洲黑楊木材材質(zhì)潔白、柔軟，易加工，可廣泛用于包裝 用材、旋切用材和纖維用材，在解決膠合板材、紙漿材、薪碳材W及生態(tài)造林等方面均發(fā)揮 著重要作用。此外，美洲黑楊還具有W下優(yōu)點(diǎn)：①生長快，產(chǎn)量高;②耐旱、耐寒、耐熱;③用 途廣泛，經(jīng)濟(jì)效益好等。優(yōu)良無性系的選用是速生、豐產(chǎn)的基礎(chǔ)，因此美洲黑楊在我國長期 的栽培過程中，培育出了大量的無性系、品種，目前已廣泛投入到了生產(chǎn)中。生產(chǎn)上，為保持 親本的優(yōu)良性狀，多采用桿插苗進(jìn)行造林。因此，美洲黑楊產(chǎn)業(yè)發(fā)展中，建立準(zhǔn)確可靠的無 性系真實(shí)性鑒定技術(shù)，是一個急需解決的難題。
[0003] 植物品種遺傳真實(shí)性鑒定的關(guān)鍵是所依賴的技術(shù)手段。W往植物品種鑒別所采用 的方法主要是依據(jù)植物的形態(tài)特征。但植物品種間在形態(tài)上的差異，特別是苗期的差異，往 往并不十分顯著。尤其對楊樹運(yùn)類世代周期長的物種，性狀的差異一般到了成熟期才能表 現(xiàn)出來。自上世紀(jì)八十年代W來，現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，為植物新品種的鑒定提供了準(zhǔn) 確可靠的技術(shù)手段。分子標(biāo)記是WDNA為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，是指能反映生物個體或種群間基 因組差異的特征DNA片段，也稱DNA指紋圖譜。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，通過DNA指紋技術(shù) 鑒別生物個體已經(jīng)成為一項(xiàng)成熟的技術(shù)，并在許多植物新品種鑒別中得到了廣泛應(yīng)用。分 子標(biāo)記技術(shù)直接W植物DNA為分析對象，從根本上克服了環(huán)境的影響，同時也不受基因表達(dá) 的限制，在DNA水平上進(jìn)行品種真實(shí)性鑒定不僅可靠性高，而且大大提高了檢測效率。常見 的分子標(biāo)記有RFLP(Res1:;riction Frag ment Length Polymo;rphism限制片段長度多態(tài) 性）、ISSR(Inte;r-simple sequenc e repeat簡單重復(fù)序列）、RAPD(Random amplified polymo巧hie DNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性）、A化P(Amplified Fra卵ent Length Polymo巧hism，擴(kuò) 增片段長度多態(tài)性）、SSR(Simple Sequence R巧eat,簡單重復(fù)序列）等。應(yīng)用分子標(biāo)記對植 物品種進(jìn)行真實(shí)性鑒定需要考慮W下因素 ：1.簡便、快速，易于在實(shí)際檢驗(yàn)工作中推廣使 用;2.標(biāo)記針對待檢物種有高度特異性，使檢測結(jié)果不受內(nèi)源和外源微生物或病原菌影響； 3.標(biāo)記擴(kuò)增基因位點(diǎn)多態(tài)性高，可W利用較少的引物組合達(dá)到較高的檢測精度。考慮上述 要求，微衛(wèi)星標(biāo)記是目前不同標(biāo)記類型中，用于植物品種真實(shí)性鑒定的最高效的分子標(biāo)記。 微衛(wèi)星DNA也稱簡單重復(fù)序列，是由長度為1-化P串聯(lián)重復(fù)序列組成，微衛(wèi)星是基因組中變 異最為迅速的序列，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。微衛(wèi)星標(biāo)記是基于PCR擴(kuò)增 為基礎(chǔ)的標(biāo)記，微衛(wèi)星標(biāo)記分析相對于基于分子雜交為基礎(chǔ)的標(biāo)記更為簡便、快速。同時微 衛(wèi)星引物是由待檢物種的基因組序列開發(fā)而來，具有極高的種屬特異性，運(yùn)樣既使樣品中 含有不同的內(nèi)源和外源微生物或病原菌污染，檢測結(jié)果也不會受到干擾，運(yùn)一優(yōu)點(diǎn)是RAPD 或AFLP等運(yùn)類隨機(jī)標(biāo)記所不具備的。
[0004] 美洲黑楊不同個體間同一位點(diǎn)的SSR重復(fù)次數(shù)存在差異，造成了個體間等位位點(diǎn) 的長度多態(tài)性。根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端的互補(bǔ)序列來設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片 段，由于微衛(wèi)星串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，通過擴(kuò)增片段的電泳分離，可W獲得不同微衛(wèi)星位點(diǎn)的 基因型W及基因型頻率信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有植物品種真實(shí)性鑒別技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提 供一種用于鑒定美洲黑楊優(yōu)良無性系的專用引物，可真實(shí)、簡便、快速、可靠的鑒定美洲黑 楊優(yōu)良無性系。本發(fā)明的另一目的是提供一種利用上述專用引物鑒定美洲黑楊優(yōu)良無性系 的方法。
[0006] 技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種用于鑒定美洲黑楊優(yōu)良無性系的專用引物，所述專用引物能高效鑒別美洲黑 楊的43個優(yōu)良無性系，共包括6對引物，名稱和序列如下：
[000引 NJFUP-polyOl:
[0009] 5 '-GACACCGTTTCTTTTCTGAG-3 '，5 '-ACCAGATCTTCATCTTCCAA-3 '；
[0010] NJFUP-poly02：
[0011] 5 '-TCGAATAGCTGGGATACTTC-3 '，5 '-TATCACCCGAACAAAAACTC-3 '；
[0012] NJFUP-poly05：
[0013] 日'-CCTTAGCCTTCTCACACAAC-3'，5'-GGTCTCCATTTTAGCTGTCA-3'；
[0014] NJFUP-poly06：
[0015] 5 '-GCCCAAACTCTTATTTGATG-3 '，5 '-TGGTGGAGGCTAGGATAGTA-3 '；
[0016] NJFUP-poly07：
[0017] 5 '-ATTGCTCTTGCAGAAATCAT-3 '，5 '-GGATACCAAGTCATCGGTAG-3 '；
[001 引 NJFUP-polylO：
[0019] 5 '-AGAACTTGTGAGGCAGGTAA-3 '，5 '-AAAGCTCTCCCCTAACAAAG-3 '。
[0020] -種用于美洲黑楊優(yōu)良無性系遺傳鑒定的方法:分別W待鑒定的美洲黑楊樣品的 DNA和標(biāo)準(zhǔn)對照樣的DNA為模板，在任一對專用引物對引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得產(chǎn)物，對產(chǎn)物 進(jìn)行毛細(xì)管電泳(ABI 3730)，利用GeneMapper基因型分析軟件進(jìn)行基因型比對，若檢測到 基因型不同則為不同品種;若相同，查表4相應(yīng)引物基因型出現(xiàn)的頻率，計算待檢樣品與標(biāo) 準(zhǔn)樣品基因型相同的概率;若相同概率達(dá)不到檢測要求時，繼續(xù)選取其他引物進(jìn)行檢測，直 至相同概率達(dá)到檢測要求;其中，引物對選自權(quán)利要求1所述的6對專用引物，表4為說明書 中的表4。
[0021] 所述的用于鑒定美洲黑楊優(yōu)良無性系的方法，PCR反應(yīng)體系為：模板DNA30ng， 0.27mM dUTPs，1.5yg BSA，上下游引物各 10pmol，2U Taq DNA聚合酶，3uL含20mM MgCb的 10 X buff er，加滅菌去離子水補(bǔ)充反應(yīng)體積到15化;PCR反應(yīng)條件為:95 °C預(yù)變性3min; 9個 TouchDown循環(huán):95°C變性30 s，59°C到50°C (每個循環(huán)退火溫度下降rC)退火30 s，72°C延伸 30s;然后進(jìn)行25個常規(guī)PCR循環(huán):95°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸30s; 72°C延伸5min。
[0022] 上述方法中，是W抽樣的方法，用43個美洲黑楊優(yōu)良無性系的DNA模板，在權(quán)利要 求1的引物對引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用ABI-3730和GeneMapper分析軟件進(jìn)行基因型分析， 獲得不同品種在不同引物位點(diǎn)的基因型頻率信息，然后利用獲得的基因型頻率，選擇引物， 若待檢樣品和對照標(biāo)準(zhǔn)品種基因型在任何一個微衛(wèi)星引物位點(diǎn)上表現(xiàn)不同，即否定待檢品 種和標(biāo)準(zhǔn)對照是同一品種，若所有選用引物在待檢樣品和對照標(biāo)準(zhǔn)品種中產(chǎn)生的基因型均 一致，可查表4的基因型頻率，計算出待檢樣品和對照標(biāo)準(zhǔn)品種是同一品種的鑒定準(zhǔn)確概 率。
[0023] 有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)包括:利用6對美洲黑楊專用引物， 進(jìn)行美洲黑楊優(yōu)良無性系的遺傳鑒定，鑒定方法操作簡單、快捷，鑒定的準(zhǔn)確率高，檢測結(jié) 果可靠、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，為美洲黑楊優(yōu)良無性系鑒定提供了可靠技術(shù)手段，應(yīng)用前景廣闊，具有 很好的實(shí)用性，能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
【附圖說明】
[0024] 圖1是引物NJFUP-PO ly02對標(biāo)準(zhǔn)樣品與待檢測樣品基因組DNA擴(kuò)增得到的基因型 (GeneMapper)；
[0025] 圖2是引物NJ即P-poly07對標(biāo)準(zhǔn)樣品與待檢測樣品N2基因組DNA擴(kuò)增得到的基因 型（GeneMapper)。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0027] 下述實(shí)例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所用微衛(wèi)星引物合成工作 由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司完成