專(zhuān)利名稱(chēng)：一種微流控芯片dna分子存儲(chǔ)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及計(jì)算機(jī)科學(xué)，分子生物學(xué)及微流控芯片技術(shù)。特別提供了一種微流控芯片DNA分子計(jì)算機(jī)、微流控芯片DNA分子運(yùn)算器、微流控芯片DNA分子存儲(chǔ)器、及一種專(zhuān)門(mén)用于DNA分子計(jì)算機(jī)的微流控芯片、和專(zhuān)門(mén)用于DNA分子計(jì)算機(jī)的微流控芯片的試劑盒。
背景技術(shù)：
DNA計(jì)算是一種關(guān)于計(jì)算的新的思維方式，同時(shí)也是關(guān)于化學(xué)和生物的一種新的思維方式。盡管生物的和數(shù)學(xué)的過(guò)程有各自的復(fù)雜性，但它們有一個(gè)重要的共性，即生物體所有的復(fù)雜結(jié)構(gòu)實(shí)際上是編碼在DNA序列中的原始信息經(jīng)過(guò)一些簡(jiǎn)單的處理后得到的，而求一個(gè)含變量W的可算函數(shù)的值也可以通過(guò)一系列含變量W的簡(jiǎn)單函數(shù)的復(fù)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。
DNA計(jì)算的基本原理是將DNA分子中的密碼作為存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)，當(dāng)DNA分子間在某種酶的作用下瞬間完成生物化學(xué)反應(yīng)時(shí)，可以從一種基因代碼變?yōu)榱硪环N基因代碼，如果將反應(yīng)前的基因代碼作為輸入數(shù)據(jù)，那么反應(yīng)后的基因代碼就可以作為運(yùn)算結(jié)果。這樣，通過(guò)對(duì)DNA雙螺旋進(jìn)行豐富的精確可控的生物化學(xué)反應(yīng)，包括標(biāo)記，擴(kuò)增或者破壞原有鏈來(lái)完成各種不同的運(yùn)算過(guò)程，就可能研制成一種以DNA作為運(yùn)算介質(zhì)的新型的計(jì)算機(jī)。由于它采用的是一種完全不同于傳統(tǒng)計(jì)算機(jī)的運(yùn)算邏輯和存儲(chǔ)方式，在解決某些復(fù)雜問(wèn)題時(shí)將具有傳統(tǒng)計(jì)算機(jī)所無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。
作為DNA計(jì)算的一個(gè)成功而最具代表性的例子，DNA計(jì)算機(jī)正以不斷發(fā)展的生物技術(shù)為基礎(chǔ)，開(kāi)始向以集成電路為核心的傳統(tǒng)“無(wú)機(jī)”計(jì)算機(jī)挑戰(zhàn)。由于傳統(tǒng)計(jì)算機(jī)中集成電路的復(fù)雜性，無(wú)機(jī)硅芯片的存儲(chǔ)極限，以及其本身計(jì)算方法的局限性，這使得在傳統(tǒng)計(jì)算機(jī)中實(shí)現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)，超大存儲(chǔ)量和在處理某些問(wèn)題時(shí)運(yùn)算速度數(shù)量級(jí)的提高存在很大困難。
DNA計(jì)算具有并行性高，運(yùn)算速度快，存儲(chǔ)信息量大的特點(diǎn)。但是迄今為止，有關(guān)DNA計(jì)算的研究工作大體集中在兩個(gè)方面即早期的生物分子計(jì)算研究和近期的自動(dòng)生物分子計(jì)算機(jī)器的研究。所有這些工作，至少存在著下述兩個(gè)方面的局限性。一是在DNA計(jì)算中所涉及的生物操作以及相應(yīng)的結(jié)果確認(rèn)缺乏一個(gè)支撐計(jì)算的完整集成的硬件裝置，當(dāng)然也不可能對(duì)相關(guān)的參數(shù)進(jìn)行控制；二是所有這些分子計(jì)算工作只進(jìn)行了DNA分子的自動(dòng)運(yùn)算而沒(méi)有能夠?qū)⑵渲械拿總€(gè)計(jì)算過(guò)程記錄并存貯下來(lái)，而存貯功能是現(xiàn)代意義的計(jì)算機(jī)的主要功能之一，也是DNA計(jì)算機(jī)有別于DNA計(jì)算裝置的一個(gè)基本特征。
微流控芯片實(shí)驗(yàn)室是指把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備，生物與化學(xué)反應(yīng)，分離、檢測(cè)等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行分析的一種技術(shù)。芯片實(shí)驗(yàn)室原則上適用于從核酸、蛋白質(zhì)直到有機(jī)、無(wú)機(jī)小分子的各種不同類(lèi)型分子的反應(yīng)、分離和檢測(cè)，涉及到了很大一部分生物和化學(xué)問(wèn)題。
廣義地說(shuō)，芯片實(shí)驗(yàn)室分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是以靜態(tài)親和雜交技術(shù)為核心的陣列微孔板芯片，沒(méi)有流通網(wǎng)絡(luò)，沒(méi)有分離，因?yàn)楸容^專(zhuān)一的適用于DNA和蛋白質(zhì)，通常被國(guó)內(nèi)的媒體稱(chēng)之為“生物芯片”。另一類(lèi)以微流控技術(shù)為基礎(chǔ)，由微通道在芯片上形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，通常被稱(chēng)之為微流控芯片實(shí)驗(yàn)室，是芯片實(shí)驗(yàn)室的主流。
微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，特別是它所具有的芯片實(shí)驗(yàn)室的基本條件以及高通量大規(guī)模集成的特點(diǎn)，為取代試管或表面操作，構(gòu)建一個(gè)嚴(yán)格意義上的DNA計(jì)算機(jī)提供了一種可能的平臺(tái)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以微流控芯片為操作平臺(tái)的DNA分子計(jì)算機(jī)、DNA分子運(yùn)算器、DNA分子存儲(chǔ)器、及一種專(zhuān)門(mén)用于DNA分子計(jì)算機(jī)的微流控芯片、和專(zhuān)門(mén)用于DNA分子計(jì)算機(jī)的微流控芯片的試劑盒。
本發(fā)明提供了一種微流控芯片DNA分子計(jì)算機(jī)，主要包括——以DNA分子為運(yùn)算介質(zhì)，以微流控芯片為操作平臺(tái)的DNA分子運(yùn)算器；——以DNA分子為存儲(chǔ)介質(zhì)，以微流控芯片為操作平臺(tái)的DNA分子存儲(chǔ)器；——以電子計(jì)算機(jī)和檢測(cè)器為核心的控制器；控制器分別與DNA分子運(yùn)算器和DNA分子存儲(chǔ)器的微流控芯片上的電極聯(lián)接。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子計(jì)算機(jī)中，所述作為運(yùn)算介質(zhì)的DNA分子，在所述DNA分子運(yùn)算器的微流控芯片上，按照所述控制器發(fā)出的指令完成DNA分子運(yùn)算。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子計(jì)算機(jī)中，所述DNA分子運(yùn)算器的輸入部分對(duì)應(yīng)的是含有特定序列的DNA計(jì)算分子和含有特定序列的DNA轉(zhuǎn)移分子，輸出部分對(duì)應(yīng)的是通過(guò)酶切、酶連等生化過(guò)程獲得的的代表計(jì)算結(jié)果DNA輸出分子。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子計(jì)算機(jī)中，所述作為存儲(chǔ)介質(zhì)的DNA分子，在所述DNA分子存儲(chǔ)器的微流控芯片上，按照所述控制器發(fā)出的指令完成對(duì)所述DNA分子運(yùn)算過(guò)程和結(jié)果的存儲(chǔ)。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子計(jì)算機(jī)中，所述DNA分子存儲(chǔ)器的輸入部分對(duì)應(yīng)的是DNA空白分子和含有已知序列的DNA存儲(chǔ)單元分子，輸出部分對(duì)應(yīng)的是通過(guò)酶切、酶連等生化過(guò)程獲得的經(jīng)過(guò)“疊加操作”的DNA存儲(chǔ)分子。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子計(jì)算機(jī)中，所述DNA存儲(chǔ)單元分子的種類(lèi)數(shù)目與DNA分子運(yùn)算器中的DNA轉(zhuǎn)移分子的種類(lèi)數(shù)目相對(duì)應(yīng)。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子計(jì)算機(jī)中，所述檢測(cè)器針對(duì)DNA分子運(yùn)算器的DNA輸出分子進(jìn)行檢測(cè)，所述電子計(jì)算機(jī)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果做出甄別判斷并對(duì)DNA分子運(yùn)算器和DNA分子存儲(chǔ)器發(fā)送指令，使得DNA分子分別在運(yùn)算器和存儲(chǔ)器的微流控芯片操作平臺(tái)上完成DNA分子運(yùn)算和DNA分子存儲(chǔ)。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子計(jì)算機(jī)中，所述檢測(cè)器可以為激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器。
本發(fā)明提供了一種微流控芯片DNA分子運(yùn)算器，由運(yùn)算介質(zhì)、反應(yīng)介質(zhì)和微流控芯片構(gòu)成所述運(yùn)算介質(zhì)為含有特定序列的DNA計(jì)算分子、用于中間操作的含有特定序列DNA轉(zhuǎn)移分子和通過(guò)生化反應(yīng)代表計(jì)算結(jié)果的DNA輸出分子；所述反應(yīng)介質(zhì)為各種用于酶切、酶連反應(yīng)的生化酶；所述微流控芯片上至少設(shè)置有由微通道順序相連的酶切反應(yīng)區(qū)、酶連反應(yīng)區(qū)、結(jié)果輸出區(qū)。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子運(yùn)算器中，所述微流控芯片上，酶連反應(yīng)區(qū)的數(shù)目與轉(zhuǎn)移分子的種類(lèi)數(shù)目相對(duì)應(yīng)。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子運(yùn)算器中，所述微流控芯片上，結(jié)果輸出區(qū)前設(shè)置有PCR擴(kuò)增區(qū)。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子運(yùn)算器中，所述微流控芯片上，設(shè)置有存放各種運(yùn)算介質(zhì)、各種反應(yīng)介質(zhì)的區(qū)域，這些區(qū)域通過(guò)微通道與各自相關(guān)的酶切反應(yīng)區(qū)或酶連反應(yīng)區(qū)相連。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子運(yùn)算器中，所述微流控芯片上，設(shè)置有統(tǒng)一的分別存放空白緩沖液和廢液的區(qū)域。
本發(fā)明提供了一種微流控芯片DNA分子存儲(chǔ)器，由存儲(chǔ)介質(zhì)、反應(yīng)介質(zhì)和微流控芯片構(gòu)成所述存儲(chǔ)介質(zhì)包括含有已知序列的短鏈的DNA存儲(chǔ)單元分子、用于起始操作的DNA空白分子、通過(guò)生化反應(yīng)代表疊加結(jié)果的DNA存儲(chǔ)分子。
所述微流控芯片上至少設(shè)置有存儲(chǔ)單元區(qū)、酶切反應(yīng)區(qū)、酶連反應(yīng)區(qū)和結(jié)果輸出區(qū)。酶切反應(yīng)區(qū)、酶連反應(yīng)區(qū)、結(jié)果輸出區(qū)由微通道順序相連，存儲(chǔ)單元區(qū)與酶連反應(yīng)區(qū)由微通道相連。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子存儲(chǔ)器中，所述微流控芯片上，結(jié)果輸出區(qū)前設(shè)置有PCR擴(kuò)增區(qū)。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子存儲(chǔ)器中，所述微流控芯片上，設(shè)置有存放各種存儲(chǔ)介質(zhì)、各種反應(yīng)介質(zhì)的區(qū)域，這些區(qū)域通過(guò)微通道與各自相關(guān)的酶切反應(yīng)區(qū)或酶連反應(yīng)區(qū)相連。
本發(fā)明微流控芯片DNA分子存儲(chǔ)器中，所述微流控芯片上，設(shè)置有統(tǒng)一的分別存放空白緩沖液和廢液的區(qū)域。
本發(fā)明的發(fā)明人基于上述以微流控芯片為基礎(chǔ)的DNA分子計(jì)算機(jī)的基本技術(shù)方案，利用現(xiàn)有設(shè)備，設(shè)計(jì)并搭建了一臺(tái)相應(yīng)的微流控芯片DNA計(jì)算機(jī)，這一臺(tái)DNA計(jì)算機(jī)具體地由微流控芯片、微流控芯片工作站以及用以完成各種分子反應(yīng)的試劑盒等三個(gè)部分組成。
DNA計(jì)算機(jī)微流控芯片由一塊一面集成有多組復(fù)雜微通道的平板A和一塊封接平板B疊合而成；平板A具有多組復(fù)雜微通道，該芯片微通道的寬度為75μm。兩個(gè)平板中間形成封閉通道，在平板A上設(shè)置有通道的進(jìn)出口。具體芯片設(shè)計(jì)如圖3所示。圖3中a組液池及微通道完成DNA計(jì)算機(jī)的輸入、輸出、計(jì)算功能，b組液池及微通道完成存貯功能。
或者說(shuō)，本發(fā)明提供了一種用于DNA分子計(jì)算機(jī)的微流控芯片，其特征在于在該芯片上集成有DNA分子運(yùn)算器和DNA分子存儲(chǔ)器。
在微流控芯片的一側(cè)，集成了可以進(jìn)行酶連、酶切反應(yīng)、PCR反應(yīng)和微通道中的電泳分離的各種操作單元，用以完成DNA分子計(jì)算的輸入/輸出功能、計(jì)算功能和控制功能；具體地，本發(fā)明用于DNA分子計(jì)算機(jī)的微流控芯片中，所述DNA分子運(yùn)算器部分對(duì)稱(chēng)地設(shè)置有一個(gè)酶切反應(yīng)池(1)、兩個(gè)酶連反應(yīng)池(2)、兩個(gè)PCR反應(yīng)池(3)、一個(gè)緩沖液池(4)、兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)核酸片段池(5)、一個(gè)廢液池(6)。酶切反應(yīng)池(1)分別地與酶連反應(yīng)池(2)、再順序地與PCR反應(yīng)池(3)連接；緩沖液池(4)、廢液池(6)和兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)核酸片段池(5)構(gòu)成一個(gè)十字型通道的檢測(cè)區(qū)，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)核酸片段池(5)之間為進(jìn)樣通道，緩沖液池(4)、廢液池(6)之間為檢測(cè)通道；PCR反應(yīng)池(3)接檢測(cè)區(qū)的進(jìn)樣通道；見(jiàn)圖4。
在芯片的另一側(cè)，設(shè)計(jì)了一個(gè)存貯裝置，其中包括有一個(gè)“棧”，用以累加每次計(jì)算所得的結(jié)果，直到指令發(fā)送完畢。
具體地，本發(fā)明用于DNA分子計(jì)算機(jī)的微流控芯片中，所述DNA分子存儲(chǔ)器部分設(shè)置有兩個(gè)存儲(chǔ)單元分子儲(chǔ)液池(7)、一個(gè)酶切、酶連反應(yīng)池(8)、一個(gè)PCR反應(yīng)池(3)、一個(gè)緩沖液池(4)、一個(gè)廢液池(6)、樣品廢液池(9)；酶切、酶連反應(yīng)池(8)分別與兩個(gè)存儲(chǔ)單元分子儲(chǔ)液池(7)和PCR反應(yīng)池(3)相連；PCR反應(yīng)池(3)、樣品廢液池(9)、緩沖液池(4)、廢液池(6)構(gòu)成一個(gè)十字型通道的檢測(cè)區(qū)，緩沖液池(4)、廢液池(6)之間為檢測(cè)通道，PCR反應(yīng)池(3)、樣品廢液池(9)之間為進(jìn)樣通道；見(jiàn)圖5。
微流控芯片的微通道的截面為倒梯形或矩形，微通道寬度為75μm。液池直徑為2～6mm。
微流控芯片材質(zhì)可以是玻璃，石英，塑料。其中塑料芯片包括PDMS芯片、PMMA芯片、PC芯片。
微流控芯片工作站是一套現(xiàn)有的、常用的用于微流控芯片的工作系統(tǒng)，見(jiàn)圖2，由一體化的芯片電泳平臺(tái)、激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)、CCD監(jiān)測(cè)、電源和計(jì)算機(jī)操作系統(tǒng)等部分組成。具有芯片能源供應(yīng)和信號(hào)收集功能，并兼管對(duì)DNA計(jì)算機(jī)的硬件控制。
為了使上述DNA計(jì)算機(jī)能夠?qū)崿F(xiàn)輸入、輸出、計(jì)算和存貯等功能，還需要一系列的生化反應(yīng)試劑與之相配合，為此，本發(fā)明還提供了一種DNA計(jì)算機(jī)微流控芯片試劑盒，如圖6所示，盒內(nèi)裝置有1片DNA計(jì)算機(jī)微流控芯片(11)，1套限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)試劑(22)，1套連接酶反應(yīng)試劑(33)，1套聚合酶鏈反應(yīng)PCR反應(yīng)試劑(44)，1瓶電泳緩沖液(55)及標(biāo)準(zhǔn)核酸片段(66)。芯片結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3，集成有多組復(fù)雜微通道，a組液池及微通道完成DNA計(jì)算機(jī)的輸入、輸出、計(jì)算功能，b組液池及微通道完成存貯功能。
限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)試劑包含限制性?xún)?nèi)切酶和反應(yīng)緩沖液。限制性?xún)?nèi)切酶的種類(lèi)可以為FokI，BglI，BstXI，SfiI等。連接酶反應(yīng)試劑包含T4連接酶和反應(yīng)緩沖液。PCR反應(yīng)試劑包含Taq酶、反應(yīng)緩沖液和脫氧核苷三磷酸(dNTP)。所述marker作為內(nèi)標(biāo)物以確定產(chǎn)物DNA的長(zhǎng)度。
總之，本發(fā)明首次采用微流控芯片技術(shù)取代目前DNA計(jì)算過(guò)程中廣泛使用的試管或表面操作，利用微流控芯片操作精確可控、以及可以高通量大規(guī)模集成的特點(diǎn)，為構(gòu)建一個(gè)嚴(yán)格意義上的DNA計(jì)算機(jī)提供了一種現(xiàn)實(shí)可能的平臺(tái)。


圖1為微流控芯片DNA計(jì)算機(jī)體系結(jié)構(gòu)圖；圖2為DNA計(jì)算機(jī)的微流控芯片工作站照片；圖3為DNA計(jì)算機(jī)微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖；A.集成有多組復(fù)雜微通道和通道進(jìn)出口的平板，B.封接平板；圖4為DNA計(jì)算機(jī)微流控芯片上運(yùn)算器設(shè)計(jì)示意圖；圖中孔1.酶切反應(yīng)池，孔2.酶連反應(yīng)池，孔3.PCR反應(yīng)池，孔4.緩沖液池，孔5.標(biāo)準(zhǔn)核酸片段，孔6.廢液池，圖5為DNA計(jì)算機(jī)微流控芯片上存儲(chǔ)器設(shè)計(jì)示意圖；圖中孔7.存儲(chǔ)分子儲(chǔ)液池，孔8.酶切、酶連反應(yīng)池，孔3.PCR反應(yīng)池，孔4.緩沖液池，孔6.廢液池，孔9.樣品廢液池。
圖6為DNA計(jì)算機(jī)所用的試劑盒結(jié)構(gòu)示意；
圖7為2個(gè)輸入符號(hào)(a，b)和3個(gè)狀態(tài)(S0，S1，S2)的有限狀態(tài)自動(dòng)機(jī)；圖8為三角形的句法結(jié)構(gòu)；圖9為輸入符號(hào)為“aabbb”的有限狀態(tài)自動(dòng)機(jī)的計(jì)算流程及相應(yīng)電泳譜圖；圖10為微流控芯片DNA計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)過(guò)程及相應(yīng)電泳譜圖。
具體實(shí)施例方式由圖1可見(jiàn)，微流控芯片DNA計(jì)算機(jī)主要包括微流控芯片工作站、微流控芯片以及用以完成各種分子反應(yīng)的試劑盒。微流控芯片工作站由電源、控制裝置和輸出裝置組成，具有芯片能源供應(yīng)和信號(hào)收集功能，并兼管DNA計(jì)算機(jī)的控制。工作站的直流高壓電源系統(tǒng)連有八個(gè)電極，可根據(jù)需要在微流控芯片的不同位置各間施加不同的電壓，控制反應(yīng)液按需要在通道間流動(dòng)。微流控芯片工作站的檢測(cè)器可相對(duì)芯片移動(dòng)，對(duì)算法邏輯單元和存貯單元中的反應(yīng)產(chǎn)物分別進(jìn)行檢測(cè)。芯片是整個(gè)計(jì)算機(jī)的核心，計(jì)算機(jī)的運(yùn)算功能和存貯功能均在芯片上完成。試劑盒中的DNA分子和各種試劑通過(guò)輸入單元進(jìn)入系統(tǒng)。
圖2為集成式DNA計(jì)算機(jī)的微流控芯片工作站，是現(xiàn)有設(shè)備，兼有電滲和壓力兩種驅(qū)動(dòng)方式，以激光誘導(dǎo)熒光為檢測(cè)手段，包括激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)及CCD圖像監(jiān)測(cè)光學(xué)系統(tǒng)、八電極直流高壓電源系統(tǒng)、程控三維平臺(tái)、控制電路系統(tǒng)及軟件系統(tǒng)等。微流控芯片工作站的上部，是芯片固定平臺(tái)和電極操作平臺(tái)，可上下移動(dòng)。下部由一體化的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)組成，其中包括可供調(diào)焦和管道監(jiān)測(cè)之用的CCD和光學(xué)檢測(cè)記錄部分。在光學(xué)檢測(cè)記錄部分中設(shè)計(jì)有可供更替發(fā)射熒光窄帶濾光片的部位，以供多種波長(zhǎng)選擇。工作站后部由可切換的高壓電源及有關(guān)電路組成。
圖3為DNA計(jì)算機(jī)的核心部件微流控芯片。這一芯片包括了輸入、輸出、計(jì)算和存貯等功能，分別集成了酶切反應(yīng)、酶連反應(yīng)、PCR反應(yīng)和電泳分離等操作單元。在芯片的一側(cè)的算法邏輯單元(a)，詳見(jiàn)圖4，孔1為酶切反應(yīng)池(1)同時(shí)為DNA計(jì)算機(jī)信號(hào)的輸入單元，所有指令均從這兒進(jìn)入。檢測(cè)點(diǎn)是輸出端，通過(guò)激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)DNA分子，并通過(guò)A/D轉(zhuǎn)化將信號(hào)傳輸給微流控芯片工作站的軟件部分，再行翻譯表達(dá)，完成輸出功能。芯片中的通道和孔是完成DNA計(jì)算所必需的功能單元，用以實(shí)現(xiàn)DNA的生化反應(yīng)和反應(yīng)產(chǎn)物的及時(shí)分離檢測(cè)，保證DNA計(jì)算機(jī)輸入、輸出功能和計(jì)算功能的完成。在所示芯片的存貯一側(cè)(b)，詳見(jiàn)圖5，設(shè)計(jì)了一種“堆棧”存貯器，用以存貯每次計(jì)算所得的結(jié)果。這種“堆?！贝尜A器在上下文無(wú)關(guān)文法識(shí)別中有較重要的作用。
圖6為微流控芯片DNA計(jì)算機(jī)所采用的試劑盒，試劑盒中包括微流控芯片，完成酶切反應(yīng)、酶連反應(yīng)、PCR反應(yīng)和電泳分離所需的各種化學(xué)生物學(xué)試劑。
把圖1中的微流控芯片DNA計(jì)算機(jī)與典型的電子計(jì)算機(jī)各組成單元的功能進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果如表1所示。
表1.微流控芯片DNA計(jì)算機(jī)與典型電子計(jì)算機(jī)的各組成單元的功能對(duì)照


微流控芯片DNA計(jì)算機(jī)的功能實(shí)現(xiàn)為方便計(jì)，采用2個(gè)輸入符號(hào)(a，b)和3個(gè)狀態(tài)(S0，S1，S2)的有限狀態(tài)自動(dòng)機(jī)來(lái)實(shí)現(xiàn)微流控芯片DNA計(jì)算機(jī)的上述各項(xiàng)功能，如圖7所示。該有限狀態(tài)自動(dòng)機(jī)是基于等腰三角形的句法結(jié)構(gòu)模式識(shí)別的思想提出的。
不失一般性，可將三角形看成由一些小的線段組成，每個(gè)線段有相同的長(zhǎng)度。這些線段分成水平線、上行斜線和下行斜線等三種類(lèi)型，是構(gòu)成三角形的基本單元。在此基礎(chǔ)上把這一三角形描述成基元組成的字符串，如圖8所示的三角形可以表示為“aabbbcccc”。文中，采取兩條邊相比較的方法，基于上述有限狀態(tài)自動(dòng)機(jī)通過(guò)DNA分子的計(jì)算得到其最終狀態(tài)，如果最終狀態(tài)為S0，代表兩邊相等，否則表示這兩邊不等。
圖7中的有限狀態(tài)自動(dòng)機(jī)的相應(yīng)狀態(tài)轉(zhuǎn)移規(guī)則設(shè)計(jì)為T(mén)1S0→aS1]]>T2S1→aS2]]>T3S2→bS1]]>T4S1→bS0]]>T5S0→bS2]]>轉(zhuǎn)移分子設(shè)計(jì)為T(mén)1T2


T3T4


T5

上述5種轉(zhuǎn)移分子的左端引物20個(gè)堿基對(duì)均設(shè)計(jì)為不同序列。
圖3為有限狀態(tài)自動(dòng)機(jī)識(shí)別的微流控芯片設(shè)計(jì)圖，由此可以了解微流控芯片DNA計(jì)算機(jī)的輸入、輸出、運(yùn)算、控制和存儲(chǔ)功能的工作原理和實(shí)現(xiàn)過(guò)程。
特定的DNA分子和相應(yīng)的反應(yīng)試劑加入圖4的酶切反應(yīng)池1中，以輸入數(shù)據(jù)。
①DNA分子分別在孔1-3中完成酶切、酶連以及PCR反應(yīng)過(guò)程，進(jìn)行DNA的計(jì)算，②孔4-孔6之間的通道內(nèi)進(jìn)行電泳分離檢測(cè)得到圖譜，輸出數(shù)據(jù)。
③根據(jù)輸出的數(shù)據(jù)，由微流控芯片工作站控制圖5所示的存儲(chǔ)部分實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)。
④孔7放入不同的存儲(chǔ)分子，在孔8和3中完成酶切、酶連以及PCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)存儲(chǔ)。
⑤反應(yīng)產(chǎn)物在孔4-孔6之間的通道內(nèi)進(jìn)行電泳分離檢測(cè)得到圖譜，記錄存儲(chǔ)的結(jié)果。
下面對(duì)如何在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)以有限狀態(tài)自動(dòng)機(jī)為模型的DNA計(jì)算機(jī)的五大功能做一具體介紹(1)輸入圖7中的有限狀態(tài)自動(dòng)機(jī)的輸入分子符號(hào)為aATCACGbACGGTATAGTGC TGCCATTerminator分子為GTACCTCATGGA以初始狀態(tài)S0，輸入符號(hào)“aabbb”的有限狀態(tài)自動(dòng)機(jī)為例，得到相應(yīng)的DNA輸入分 將含有上述DNA序列的分子的溶液導(dǎo)入到圖3中a側(cè)芯片的孔1中，實(shí)現(xiàn)輸入過(guò)程。
(2)輸出選擇FokI限制性?xún)?nèi)切酶，其識(shí)別位點(diǎn)為5’-GGATG-3’，酶切位點(diǎn)是(9，13)，酶切后會(huì)形成一段4bp的粘性末端，它編碼了不同狀態(tài)和符號(hào)的組合，如表2所示。
表2不同狀態(tài)和符號(hào)的組合 酶切后會(huì)形成的粘性末端在連接酶作用下與帶有互補(bǔ)粘性末端的相應(yīng)的轉(zhuǎn)移分子粘連，形成一段新的DNA片段，編碼新的狀態(tài)。
檢測(cè)分子用來(lái)檢測(cè)程序運(yùn)行結(jié)果所對(duì)應(yīng)的狀態(tài)，所以自動(dòng)機(jī)的terminator狀態(tài)均設(shè)計(jì)一個(gè)相應(yīng)的檢測(cè)分子如下 D-S0D-S1D-S2上述檢測(cè)分子和Output分子連接后形成報(bào)告分子(Report分子)，在圖4芯片中的孔4-6間被檢測(cè)并記錄下來(lái)。
(3)計(jì)算在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了如圖9所示計(jì)算流程。
圖9中a-g是輸入狀態(tài)、各個(gè)中間狀態(tài)以及輸出狀態(tài)對(duì)應(yīng)的電泳譜圖。右側(cè)是輸入符號(hào)為“aabbb”的有限狀態(tài)自動(dòng)機(jī)的計(jì)算流程。圖9a為輸入分子Input-aabbb的電泳譜圖，圖9(b-f)表示的是計(jì)算過(guò)程中各個(gè)產(chǎn)物的電泳譜圖，圖9g是輸出分子的電泳譜圖。以100bp系列標(biāo)準(zhǔn)核酸片段(DNA marker)作為內(nèi)標(biāo)物以確定各目標(biāo)分子(已作標(biāo)注)的長(zhǎng)度。在100bp系列DNA marker中，由左到右各個(gè)峰代表的DNA分子長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)為100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp。其中500bp的峰明顯高于其他峰，所以將其作為標(biāo)志物，在圖中標(biāo)出?？擅黠@看出圖9的a-g中各目標(biāo)分子的峰相對(duì)marker發(fā)生了明顯位移，這表明DNA分子經(jīng)過(guò)右側(cè)所示的各步酶切、酶連反應(yīng)后，長(zhǎng)度發(fā)生了變化。
(4)存儲(chǔ)在微流控芯片DNA計(jì)算機(jī)中，通過(guò)“堆?！钡臄?shù)據(jù)結(jié)構(gòu)進(jìn)行存儲(chǔ)。根據(jù)計(jì)算的結(jié)果(轉(zhuǎn)移分子及對(duì)應(yīng)輸入符號(hào))，微流控芯片工作站控制存儲(chǔ)芯片把相應(yīng)的數(shù)據(jù)錄入存儲(chǔ)分子中，從而實(shí)現(xiàn)其在DNA計(jì)算機(jī)中的存儲(chǔ)功能。
(5)控制將計(jì)算結(jié)果的信息反饋給工作站，由預(yù)先設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)程序控制另一端的存儲(chǔ)芯片把相應(yīng)的數(shù)據(jù)錄入存儲(chǔ)分子中。
①通過(guò)A-D轉(zhuǎn)換器把芯片中反映DNA分子信息的信號(hào)采集到微流控芯片工作站中；②把采集到的信號(hào)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為圖形文件；③DNA分子的遷移時(shí)間和其分子長(zhǎng)度成正比，通過(guò)特定計(jì)算機(jī)程序分析加入DNA marker的PCR產(chǎn)物電泳圖，可以比較準(zhǔn)確的測(cè)定PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，把計(jì)算值和理想值進(jìn)行比較，就可以確定每步反應(yīng)中的轉(zhuǎn)移分子。
④顯示結(jié)果并發(fā)送信號(hào)到DNA計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)端，通過(guò)DNA分子記錄每步反應(yīng)的數(shù)據(jù)信息。
⑤存儲(chǔ)功能的控制將微流控芯片a側(cè)信號(hào)傳輸給工作站，由其控制芯片b側(cè)的存儲(chǔ)單元輸入Memory-a、Memory-b，直到指令發(fā)送完畢。
存儲(chǔ)器的實(shí)現(xiàn)到目前為止，由于試管技術(shù)條件的限制，無(wú)法實(shí)現(xiàn)DNA計(jì)算的結(jié)果和中間狀態(tài)的存儲(chǔ)，而這一存儲(chǔ)功能可以在本發(fā)明所采用的微流控芯片系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)。
下面我們?cè)敿?xì)討論在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)存儲(chǔ)功能的過(guò)程。計(jì)算機(jī)中常見(jiàn)的線性數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)有表，堆棧和隊(duì)列，這些數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)對(duì)DNA計(jì)算機(jī)的發(fā)展有著非常重要的意義。以下以輸入符號(hào)“aab”為例，來(lái)實(shí)現(xiàn)在微流控芯片上的堆棧存儲(chǔ)結(jié)構(gòu)。存儲(chǔ)單元中最初為“空”，即僅含“E”分子。輸入一個(gè)Memory-a或Memory-b分別使存儲(chǔ)分子增加一段13bp或21bp的特定序列，最終通過(guò)檢測(cè)長(zhǎng)度或測(cè)序可輸出存儲(chǔ)的結(jié)果。
E分子的設(shè)計(jì)從takara購(gòu)買(mǎi)的PUC19質(zhì)粒上用引物L(fēng)1和R1擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為304bp的片段，其中417-422位含有BamHI內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)GGATCC，繼而用BamHI酶切，生成左側(cè)帶有4bp粘性末端的DNA分子，即為空白分子“E”。
堆棧中存儲(chǔ)單元分子的設(shè)計(jì)Memory-a和Memory-b分子右端帶有粘性末端，可與空白分子“E”相連。由于它們均含有FokI酶切位點(diǎn)，因此酶連產(chǎn)物在FokI酶的作用下重新被分割成兩部分。根據(jù)計(jì)算過(guò)程中轉(zhuǎn)移分子給出的有關(guān)狀態(tài)和符號(hào)的信息，進(jìn)行存儲(chǔ)。存入Memory-a或Memory-b，空白分子“E”實(shí)際上增加了一段13bp或21bp的特定序列。當(dāng)輸出為T(mén)erminator分子時(shí)，存儲(chǔ)結(jié)束。最終通過(guò)檢測(cè)長(zhǎng)度或測(cè)序可輸出存儲(chǔ)的結(jié)果。
存儲(chǔ)過(guò)程的具體操作過(guò)程如下首先在孔12中30℃條件下用BamHI限制性?xún)?nèi)切酶酶切生成左端帶粘性末端的空白分子“E”，其長(zhǎng)度為263bp。65℃加熱10min使酶失去活性。按計(jì)算的結(jié)果引入存儲(chǔ)單元分子Memory-a或Memory-b(包含F(xiàn)okI酶切位點(diǎn))。在18℃酶連30min，65℃加熱10min使酶失去活性。以酶連產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物以電泳檢測(cè)。重復(fù)上述操作，當(dāng)計(jì)算過(guò)程輸出為T(mén)erminator分子時(shí)，存儲(chǔ)結(jié)束。最終得到的存儲(chǔ)分子中包含有整個(gè)DNA計(jì)算的信息，可以隨時(shí)讀取。
以輸入符號(hào)為“aab”的有限狀態(tài)自動(dòng)機(jī)的動(dòng)態(tài)存儲(chǔ)過(guò)程為例，對(duì)存儲(chǔ)過(guò)程進(jìn)行描述圖10-a是堆棧存儲(chǔ)過(guò)程的示意圖和各步存儲(chǔ)產(chǎn)物的電泳譜圖，圖10-b是其對(duì)應(yīng)的運(yùn)算過(guò)程。運(yùn)算過(guò)程中轉(zhuǎn)移分子包含了狀態(tài)和符號(hào)的信息。輸入符號(hào)為“aab”的有限狀態(tài)自動(dòng)機(jī)的轉(zhuǎn)移分子依次為T(mén)1，T2和T3，其對(duì)應(yīng)的符號(hào)依次為a，a，b。根據(jù)以上信息，將Memory-a，Memory-a和Memory-b依次存入E分子，得到Ea，Eaa和Eaab。于是就完成了一個(gè)輸入符號(hào)為“aab”的堆棧存儲(chǔ)。利用與上述“堆?！贝鎯?chǔ)過(guò)程類(lèi)似的方法，也可以實(shí)現(xiàn)隊(duì)列和表的動(dòng)態(tài)存儲(chǔ)過(guò)程。
權(quán)利要求
1.一種微流控芯片DNA分子存儲(chǔ)器，由存儲(chǔ)介質(zhì)、反應(yīng)介質(zhì)和微流控芯片構(gòu)成所述存儲(chǔ)介質(zhì)包括含有已知序列的短鏈的DNA存儲(chǔ)單元分子、用于起始操作的DNA空白分子、通過(guò)生化反應(yīng)代表疊加結(jié)果的DNA存儲(chǔ)分子。所述微流控芯片上至少設(shè)置有存儲(chǔ)單元區(qū)、酶切反應(yīng)區(qū)、酶連反應(yīng)區(qū)、結(jié)果輸出區(qū)。酶切反應(yīng)區(qū)、酶連反應(yīng)區(qū)、結(jié)果輸出區(qū)由微通道順序相連，存儲(chǔ)單元區(qū)與酶連反應(yīng)區(qū)由微通道相連。
2.按照權(quán)利要求1所述微流控芯片DNA分子存儲(chǔ)器，其特征在于所述微流控芯片上，結(jié)果輸出區(qū)前設(shè)置有PCR擴(kuò)增區(qū)。
3.按照權(quán)利要求1或2所述微流控芯片DNA分子存儲(chǔ)器，其特征在于所述微流控芯片上，設(shè)置有存放各種存儲(chǔ)介質(zhì)、各種反應(yīng)介質(zhì)的區(qū)域，這些區(qū)域通過(guò)微通道與各自相關(guān)的酶切反應(yīng)區(qū)或酶連反應(yīng)區(qū)相連。
4.按照權(quán)利要求1或2所述微流控芯片DNA分子存儲(chǔ)器，其特征在于所述微流控芯片上，設(shè)置有統(tǒng)一的分別存放空白緩沖液和廢液的區(qū)域。
5.按照權(quán)利要求3所述微流控芯片DNA分子存儲(chǔ)器，其特征在于所述微流控芯片上，設(shè)置有統(tǒng)一的分別存放空白緩沖液和廢液的區(qū)域。
全文摘要
一種微流控芯片DNA分子存儲(chǔ)器，由存儲(chǔ)介質(zhì)、反應(yīng)介質(zhì)和微流控芯片構(gòu)成所述存儲(chǔ)介質(zhì)包括含有已知序列的短鏈的DNA存儲(chǔ)單元分子、用于起始操作的DNA空白分子、通過(guò)生化反應(yīng)代表疊加結(jié)果的DNA存儲(chǔ)分子。所述微流控芯片上至少設(shè)置有存儲(chǔ)單元區(qū)、酶切反應(yīng)區(qū)、酶連反應(yīng)區(qū)、結(jié)果輸出區(qū)。酶切反應(yīng)區(qū)、酶連反應(yīng)區(qū)、結(jié)果輸出區(qū)由微通道順序相連，存儲(chǔ)單元區(qū)與酶連反應(yīng)區(qū)由微通道相連。本發(fā)明首次采用微流控芯片技術(shù)取代目前DNA計(jì)算過(guò)程中廣泛使用的試管或表面操作，利用微流控芯片操作精確可控、以及可以高通量大規(guī)模集成的特點(diǎn)，為構(gòu)建一個(gè)嚴(yán)格意義上的DNA計(jì)算機(jī)提供了一種現(xiàn)實(shí)可能的平臺(tái)。
文檔編號(hào)G11C13/00GK1786988SQ200410082858
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2004年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月6日
發(fā)明者林炳承, 李博偉, 解華, 黃振德, 丁永生 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所