專利名稱：：表面修飾Cu²⁺的納米磁性材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于無機(jī)材料和分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種表面修飾Ci^+的磁性材料及其制備方法和應(yīng)用。技術(shù)背景眾所周知，蛋白質(zhì)組成具有多樣性和可變性，即在同一物種的不同細(xì)胞中或同一細(xì)胞在不同時(shí)期，其蛋白質(zhì)組成都是在不斷變化的，造成蛋白質(zhì)組成異常復(fù)雜。同時(shí)由于蛋白質(zhì)存在翻譯后修飾，所以一個(gè)mRNA往往對(duì)應(yīng)多個(gè)蛋白質(zhì)，也就是說，蛋白質(zhì)的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于基因的數(shù)量，蛋白質(zhì)在大小、相對(duì)豐度、酸堿度和疏水性方面差異很大，僅在相對(duì)豐度上，高豐度蛋白質(zhì)與低豐度蛋白質(zhì)相差六個(gè)數(shù)量級(jí)甚至更高；而且，由于蛋白質(zhì)無法像DNA—樣被"擴(kuò)增"，這些都造成許多含量低的蛋白質(zhì)在大規(guī)模的檢測(cè)中很難被檢測(cè)到。低豐度蛋白的分析與鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)內(nèi)容之一。在生物體中承擔(dān)重要生命活動(dòng)的蛋白往往都是低豐度蛋白，然而其極低的含量給后續(xù)的分析和檢測(cè)帶來困難，限制了人們對(duì)它們的研究和認(rèn)識(shí)。因此要從分子水平上，深入研究生命過程的規(guī)律，探索生命現(xiàn)象的奧秘，必須對(duì)一些具有重要生理功能的低豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行分析監(jiān)測(cè)，這對(duì)目前的分析技術(shù)和手段不能不說是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。低豐度蛋白的有效濃縮是實(shí)現(xiàn)其準(zhǔn)確分析和鑒定的重要條件之一。實(shí)際上在蛋白質(zhì)組學(xué)研究過程中許多方面都涉及到樣品的有效富集，以膠內(nèi)酶解樣品的分析為例酶解肽段提取液的體積太大，在質(zhì)譜分析前必須濃縮。目前最常用的樣品濃縮方法有溶劑蒸發(fā)法和色譜濃縮法。溶劑蒸發(fā)法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，在干燥過程中容器表面的吸附會(huì)造成大量的肽段損失，同時(shí)無機(jī)鹽等雜質(zhì)也會(huì)被濃縮，影響質(zhì)譜鑒定的靈敏度。色譜濃縮法是利用樣品與吸附劑之間的色譜相互作用對(duì)樣品進(jìn)行濃縮，吸附劑一般是采用烷基鏈修飾的硅膠。該方法能實(shí)現(xiàn)在對(duì)樣品進(jìn)行有效濃縮的同時(shí)，去除樣品中的鹽分和其他雜質(zhì)。尤其是在液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)，為了防止樣品中的鹽分等雜質(zhì)進(jìn)入質(zhì)譜影響信號(hào)檢測(cè)，都是采用了在分離柱前連接一根短小的反相預(yù)柱，以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品濃縮和除鹽的效果。被人們廣泛采用的進(jìn)行樣品除鹽濃縮的商品化產(chǎn)品Zip-tip和Zip-plate，也都是基于色譜濃縮法的原理。分別是在槍頭管尖或是九十六孔板孔的底部填充少許反相填料，操作相對(duì)繁瑣；且由于填料很少，因此能富集濃縮的樣品量很有限。近年來，納米材料以其發(fā)展快速和應(yīng)用潛力而被越來越多地應(yīng)用于在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中。楊艽原教授小組等成功地將沸石納米粒子應(yīng)用于痕量肽段的富集，但是該方法需要高速離心分離樣品和沸石混合物，操作相對(duì)繁瑣。因此發(fā)展一種簡(jiǎn)單便捷而又有效的分離富集蛋白和肽段的方法成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)重要方面。磁性聚合物微球以其易于表面修飾、溶液分散性好以及靈敏的磁場(chǎng)感應(yīng)性為其應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析中痕量肽段的分離富集方面提供了可能。本研究合成了四氧化三鐵磁性聚合物微球，進(jìn)而合成了新型的表面修飾Q^+的磁性聚合物材料。利用該磁性聚合物材料作為吸附劑，進(jìn)行痕量多肽的分離富集以及MALDI-TOF/MS直接分析并初步應(yīng)用于實(shí)際血樣中多肽的富集。從而簡(jiǎn)化了低濃度多肽的分析測(cè)定程序，解決了痕量樣品的分析困難；也為磁性聚合物微球的應(yīng)用開辟了新的途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單、效率高、效果好，能對(duì)多肽進(jìn)行富集的表面修飾012+的納米磁性材料及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的表面修飾Q+的納米磁性材料，是先采用水熱法合成胺基修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子，然后分別與己二酰氯、亞氨基二乙酸反應(yīng)，再用Ci^+對(duì)其表面進(jìn)行化學(xué)修飾，生成表面修飾C士+金屬離子的磁性納米材料，其結(jié)構(gòu)如下式所示其中M為帶有氨基的四氧化三鐵納米粒子。coo上述表面修飾012+的納米磁性材料的制備方法如下(1)用水熱法合成表面帶有氨基的四氧化三鐵(Fe304)的超順磁性納米粒子采用3.0克FeCl3'6H20為原料，以80-90mL乙二醇為分散體系，添加6-12克無水乙酸鈉，10-20克l,6-己二胺，反應(yīng)溫度為195-200°C，反應(yīng)時(shí)間為4-6小時(shí)，生成表面帶有氨基的磁性納米粒子,其粒徑是20_100nm;(2)將由步驟(1)合成的Fe304氨基磁性粒子反復(fù)用去離子水洗滌，以除去水溶性雜質(zhì)，再將產(chǎn)物以40-5(TC真空干燥得到黑色粉末。然后對(duì)Fe304氨基磁性納米粒子進(jìn)行表面修飾。先將納米粒子磁球表面用己二酰氯修飾。取干燥的100mL兩頸瓶，加入25-30mL無水氯仿，稱取100毫克干燥的Fe3O4氨基磁性納米粒子粉末，得到納米粒子的分散液。將兩頸瓶置于冰水浴中密封攪拌20-30分鐘，保持冰水浴，向瓶中滴入0.2-0.3mL己二酰氯，繼續(xù)密封攪拌4-5小時(shí)。然后通過酰氯在粒子上接亞氨基二乙酸(IDA)。先在磁鐵輔助下用無水氯仿洗去未反應(yīng)的己二酰氯，再加入25-30mL無水氯仿分散。在分散液中加入300-500毫克IDA粉末，機(jī)械攪拌5-6小時(shí)，停止攪拌，在磁鐵輔助下用丙酮和水洗掉多余的IDA，并收集合成好的磁性納米材料，40-50'C烘干。(3)用銅離子修飾納米磁性粒子表面，稱取10毫克步驟(2)制備的納米材料黑色粉末，將其分散在l-2mLlmol/L的硫酸銅溶液中浸泡過夜。然后用去離子水洗去硫酸銅溶液，并將所得的磁性納米材料重新分散在lmL去離子水中。本發(fā)明合成的表面修飾012+的納米磁性材料，合成方法簡(jiǎn)單有效并具有很好的磁場(chǎng)感應(yīng)性，可直接放入肽段中，無需特殊處理，絡(luò)合到磁性納米材料上后，無需離心分離，采用簡(jiǎn)單磁場(chǎng)作用即可實(shí)現(xiàn)肽段的富集。本發(fā)明提供的表面修飾Ci^+的納米磁性材料可應(yīng)用于生物體中低豐度蛋白或肽段的富集，并擴(kuò)展了磁性納米材料的實(shí)際應(yīng)用，在生物分析研究等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。圖1為表面修飾012+的磁性納米粒子的合成方法圖示。圖2為水熱法合成的表面修飾氨基的Fe304磁性納米粒子的透射電鏡圖(a)和掃描電鏡圖(b)。它具有很好的均一性和分散性。圖3(a)為表面修飾C^+的磁性納米材料的表面照片，(b)為材料的表面元素分析圖，(c)為材料的表面元素分析結(jié)果，由圖及下面表格可得，納米粒子表面平均銅含量約0.9%，可見本發(fā)明成功制備了表面修飾012+的磁性鈉米材料。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>圖4為表面修飾Ci^+的磁性納米材料對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解肽溶液的富集效果，對(duì)比(a)未富集；(b)富集后；(c)在含lmol/L氯化鈉溶液中的富集情況，可知，該材料可以很好地富集低豐度的肽，并且在溶液中有鹽存在時(shí)同樣可以得到好的富集效果。圖5為表面修飾C^+的磁性納米材料對(duì)血清肽段的富集。圖中標(biāo)出了血清中部分標(biāo)志性肽，可見該材料對(duì)血清這樣復(fù)雜的實(shí)際樣品也有良好的富集效果。具體實(shí)施方式實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明所提供的超順磁性的表面修飾012+的磁性材料以及進(jìn)行低豐度肽段的分離富集分析過程的進(jìn)一步說明。實(shí)施例i表面修飾c^+的磁性材料的合成表面修飾012+的磁性材料的合成共分為三步。用水熱法合成表面帶有氨基的四氧化三鐵的超順磁性納米粒子采用3.0克FeCl3.6H20為原料，以80-90mL乙二醇為分散體系，添加6-12克無水乙酸鈉，10-20克1,6-己二胺，反應(yīng)溫度為195-200°C，反應(yīng)時(shí)間為4-6小時(shí)，生成表面帶有氨基的磁性納米粒子,其粒徑是20—100nm;首先，將由步驟(l)合成Fe304氨基磁性微球反復(fù)用去離子水洗滌，以除去水溶性雜質(zhì)，最后將產(chǎn)物以40-5(TC真空干燥得到黑色粉末。其次，對(duì)Fe304氨基磁性微球進(jìn)行表面修飾，先將磁球表面用己二酰氯修飾。取干燥的100mL兩頸瓶，加入25-30mL無水氯仿，稱取IOO毫克干燥的Fe304氨基磁性微球粉末，得到納米粒子的分散液。將兩頸瓶置于冰水浴中密封攪拌20-30分鐘，保持冰水浴，向瓶中滴入0.2-0.3mL己二酰氯，繼續(xù)密封攪拌4-5小時(shí)。然后通過酰氯在磁球上接亞氨基二乙酸(IDA)，先在磁鐵輔助下用無水氯仿洗去未反應(yīng)的己二酰氯，再加入25-30mL無水氯仿分散。在分散液中加入300-500毫克IDA粉末，機(jī)械攪拌5-6小時(shí)，停止攪拌，在磁鐵輔助下用丙酮和水洗掉多余的IDA，并收集合成好的磁性納米材料，40-5(TC烘干備用。用銅離子修飾納米磁性微球表面，稱取10毫克烘干的納米材料黑色粉末，將其分散在l-2mLlmol/L的硫酸銅溶液中浸泡過夜。然后用去離子水洗去硫酸銅溶液，并將所得的磁性納米材料重新分散在lmL去離子水中。實(shí)施例2表面修飾c^+的磁性材料用于肽段富集(1)蛋白溶液酶解取1.0mg蛋白樣品，包括牛血清白蛋白(BSA)、細(xì)胞色素C(CytochromeC)、馬心肌蛋白(Myoglobin)、牛P-酪蛋白(p-casein)分別溶于1.0mL水中，加熱變性后，往溶液中加入碳酸氫銨溶液調(diào)節(jié)體系PH約為8，以l:50(酶和蛋白之間的質(zhì)量比)加入25嗎胰蛋白酶。在37°C的溫度下，酶解12小時(shí)后終止酶解，酶解液置于-80°C冰箱冷凍待用。(2)肽段的分離富集將20濃度為2mgmL—1的磁性材料分散液分別加入到1mL濃度為5fmol^L—1標(biāo)準(zhǔn)肽段或是標(biāo)準(zhǔn)蛋白的胰蛋白酶酶解肽段混合物中，37°C，振蕩90min。在外加磁場(chǎng)作用下去除上清后，用純水反復(fù)清洗三次；然后分散在5pLCHCA(5mg/mL;溶于50%(v/v)乙腈和0.1%(v/v)TFA中)將1pL含有被富集肽段的分散液點(diǎn)到靶板上，待干后進(jìn)行MALDI-TOFMS分析。(3)鹽溶液中肽段的富集將20濃度為10mgml/1的磁性材料分散液分別加入到1mL濃度為5findpL—1Myoglobin蛋白的胰蛋白酶酶解肽段混合物中，37°C，振蕩60min。在外加磁場(chǎng)作用下去除上清后，用20|aL純水清洗2次；然后分散在5CHCA(5mg/mL;溶于50%(v/v)乙腈和0.1%(v/"TFA中)將1iaL含有被富集肽段的分散液點(diǎn)到靶板上，待干后進(jìn)行MALDI-TOFMS分析。C4)MALDI-TOF-MS的檢測(cè)取luL富集有肽段的磁性微球分散液點(diǎn)于MALDI靶板上，然后再點(diǎn)上0.5CHCA。待耙板上的點(diǎn)樣液干燥、結(jié)晶后，將靶板放進(jìn)質(zhì)譜儀，進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜測(cè)定。MALDI-TOFMS質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)在4700ProteomicsAnalyzer(AppliedBiosystems)上完成；激光器為Nd-YAG激光，波長(zhǎng)355nm，激光脈沖頻率200Hz;加速電壓20kV，正離子模式，反射式TOF條件下檢測(cè)。實(shí)施例3表面修飾Ci^+的磁性材料用于人血清中肽段的富集取10nL成人血清，加入20pLPBS緩沖溶液稀釋后，再加入2iaL濃度為10mg/mL的表面修飾C^+的磁性材料；用移液槍吹打5次，30s后，磁分離去除上清。將富集了肽段的材料用PH為7.0的PBS緩沖溶液清洗三次，上清去除；加入550%(v/v)乙腈水溶液將富集在材料上的肽段洗脫下來，磁分離得洗脫液；將0.5nL含有被富集肽段的洗脫液點(diǎn)到靶板上，干后再點(diǎn)0.5CHCA(5mg/mL;溶于50%(v/v)乙腈和0.1%(v/v)TFA中)。待干后進(jìn)行MALDI-TOFMS分析。權(quán)利要求1、一種表面修飾Cu2+的納米磁性材料，其特征在于由下述方法制備獲得先采用水熱法合成胺基修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子，然后分別與己二酰氯、亞氨基二乙酸反應(yīng)，再用Cu2+對(duì)其表面進(jìn)行化學(xué)修飾，生成表面修飾Cu2+的磁性納米材料，其結(jié)構(gòu)如下式所示其中，M為帶有氨基的四氧化三鐵納米粒子。2、一種如權(quán)利要求1所述的表面修飾012+的納米磁性材料的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)用水熱法合成表面帶有氨基的四氧化三鐵的超順磁性納米粒子采用3.0克FeCl3.6H20為原料，以80-90mL乙二醇為分散體系，添加6-12克無水乙酸鈉和10-20克1,6-己二胺，反應(yīng)溫度為195-200°C，反應(yīng)時(shí)間為4-6小時(shí)，生成表面帶有氨基的磁性納米粒子，其粒徑是20—100nm;(2)修飾已二酰氯和亞氨基二乙酸將由步驟(l)合成的Fe304氨基磁性納米粒子用去離子水洗滌，以除去水溶性雜質(zhì)，再將產(chǎn)物以40-50'C真空干燥，得到黑色粉末；然后，對(duì)Fe304氨基磁性納米粒子進(jìn)行表面修飾取干燥的100mL兩頸瓶，加入25-30mL無水氯仿，稱取100毫克千燥的Fe304氨基磁性納米粒子粉末，得到納米粒子的分散液，將兩頸瓶置于冰水浴中密封攪拌20-30分鐘，保持冰水浴，向瓶中滴入0.2-0.3mL己二酰氯，繼續(xù)密封攪拌4-5小時(shí)，先在磁鐵輔助下用無水氯仿洗去未反應(yīng)的己二酰氯，再加入25-30mL無水氯仿分散，在分散液中加入300-500毫克亞氨基二乙酸粉末，攪拌5-6小時(shí)，在磁鐵輔助下用丙酮和水洗掉多余的亞氨基二乙酸，并收集合成好的磁性納米材料，40-5(TC烘干；(3)最后用銅離子修飾納米磁性粒子表面稱取10mg步驟(2)的納米粒子，將其分散在lmLlmol/L的硫酸銅溶液中浸泡過夜，然后用去離子水洗去硫酸銅溶液，并將所得的磁性納米材料重新分散在lmL去離子水中。3、如權(quán)利要求1所述的表面修飾Ci^+的納米磁性材料在富集生物體中低豐度蛋白或肽段中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于無機(jī)材料和分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種表面修飾Cu²⁺的磁性材料及其制備方法和應(yīng)用。該磁性納米材料是先合成表面富含氨基的四氧化三鐵的磁性納米材料，采用Cu²⁺對(duì)其進(jìn)行表面化學(xué)修飾。該固定Cu²⁺的磁性納米粒子作為微吸附劑，比表面積大，可對(duì)生物體中具有的肽段進(jìn)行富集，方法簡(jiǎn)單有效。該材料在蛋白組學(xué)等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。文檔編號(hào)H01F1/36GK101226808SQ20071017078公開日2008年7月23日申請(qǐng)日期2007年11月22日優(yōu)先權(quán)日2007年11月22日發(fā)明者寧姚,張祥民,鄧春暉申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)