專利名稱：以氨基酸配對(duì)為基礎(chǔ)的自組裝肽和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及形成納米結(jié)構(gòu)的自組裝肽，制備多肽的方法和此類肽的用途。
背景技術(shù)：
由于非共價(jià)相互作用，分子自發(fā)地組裝成良好有序的排列被稱為“分子自組裝”。 由此產(chǎn)生的超分子結(jié)構(gòu)通常提供了非常明確的宏觀屬性的納米構(gòu)造。(Whitesides et al.，(1991)，Science 254:1312-1319 "Whitesides et al. (1991)”)。這些實(shí)體的自組裝能力已成為這些實(shí)體作為新型材料開(kāi)發(fā)成過(guò)程中的關(guān)鍵因 素。例如，過(guò)去十年研究發(fā)現(xiàn)生物聚合物的分子自組裝在發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)生物材料在醫(yī)療技 術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用中起著關(guān)鍵作用，更具體而言，是在再生醫(yī)學(xué)和藥物遞送系統(tǒng)方面起關(guān)鍵 作用(Langer and Vacanti(1993)Science 260 920-926 ；Hubbell (1996)MRS Bulletin 21(11) 33-35)。納米技術(shù)的一個(gè)重要問(wèn)題是自發(fā)形成的高度有序的納米級(jí)結(jié)構(gòu)(Whitesides et al. (1991 年)，Zhang (2003 年)Biotechnology 21 :1171_1178，Lazzari et al. (2006) J. Nanosci. Nanotechnol. 6 =892-905)。簡(jiǎn)單的構(gòu)建模塊，如肽，能相互識(shí)別和組裝，這種方 式指導(dǎo)其形成有序納米結(jié)構(gòu)。幾種不同的共價(jià)相互作用的綜合，包含靜電相互作用、氫鍵、 疏水相互作用和芳香堆積相互作用，指導(dǎo)形成構(gòu)造。自組裝肽最近正成為在生物納米技術(shù)研究中最有前途的生物分子材料(Zhang et al (1993)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90 3334-3338 ；"Zhang et al(1993) " ；Chen(2005) Colloids Surf. A 261 3-24 ；"Chen (2005) ，，；Zhang (2002) Biotechnol. Adv. 20 321-339 ' Zhang(2002) ‘ ；Aggeli et al. (1999)Mol. Med. Today 5:512-513" Aggeli et al. (1999) 〃 ；and Zhang et al. (1994)Biopoly. 34 :663_672)。自組裝肽，不僅涉 及到許多的天然蛋白質(zhì)的狀態(tài)，如淀粉蛋白纖維化(amyloidfibrillogenesis) (Aggeli et al(1999))，而且還提供了有用的用于制造超分子的各種生物分子構(gòu)建模(Zhang et al. (1993) ；Chen(2005) ；Zhang(2002))。離子互補(bǔ)兩親性肽是一類新型的自組裝肽，例如EAK由谷氨酸(E)，丙氨酸(A)和 賴氨酸(K)組成(Zhang et al. (1993)和美國(guó)專利第 5，670，483to Zhang et al.)。這個(gè) 新肽起源于zuotin，一種傾向于與左旋的Z-DNA結(jié)合的酵母蛋白質(zhì)(Zhang et al. 1993))。 這些多肽分子結(jié)構(gòu)包含交替正電荷和負(fù)電荷，使離子互補(bǔ)。這種離子的互補(bǔ)性，加上氫鍵， 疏水性和范德華相互作用促進(jìn)肽分子自組裝成高度穩(wěn)性的聚合體(Chen(2005) ；Hong et al. (2003) Biomacromol. 4 1433-1442" Hong et al. (2003) ” ；and Fung et al. (2003) Biophys. J.85 :537-548〃 Fung et al. (2003)”)。自組裝肽所形成的納米/微米構(gòu)造在 生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，包含組織工程支架(Zhang et 15al. (1995) Biomater. 16 1385-1393and Holmes et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6728-6733)和生物表 面圖樣制作(Zhang (2002))。據(jù)近年報(bào)道，這些多肽可以封裝疏水有機(jī)化合物和可調(diào)控地卸 載到細(xì)胞膜模型中(Keyes-Bag et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126 :7522_7532)。
EAKI6-II是一個(gè)以離子互補(bǔ)型氨基酸為基礎(chǔ)的自組裝肽的例子。在云母表面， EAK16-II肽以濃度依賴的方式自組裝成多種結(jié)構(gòu)，。(Jun et al. (2004)Biophys. J. 87 1249-1259)。EAK16-II 的臨界聚集濃度(CAC)被確定為 0. 06mM(Fung et al. 2003)) 此 外，該EAK肽的序列顯示是肽聚集形成納米結(jié)構(gòu)一個(gè)關(guān)鍵的決定因素，(Jim et al. (2004) Biophys. J. 87 1249-1259)。pH 值也是影響肽聚集關(guān)鍵因素(Hong et al. (2003))。在多種與蛋白質(zhì)聚集疾病相關(guān)的形成組裝良好的淀粉纖維蛋白的短肽片斷 中，Gazit 等人開(kāi)展 了肽的自組裝研究，(Azriel andGazit (2001) J. Biol. Chem. 276 3415634161 ；Gazit (2002)FASEB J. 16 77-83 ；Gazit (2002)Bioinformatics 18 880-883)。研究表明，具有3至6個(gè)氨基酸長(zhǎng)度并且含有芳香殘基的肽可形成淀粉樣纖維 以進(jìn)一步組裝成 β 折疊(Maji et al. (2004)Tetrahedron 60:3251-3259)。由于這些短 肽具有可形成富含β折疊的纖維的能力，淀粉樣肽可作為用來(lái)建立納米電子器件的構(gòu)建 模塊(reviewed in Reches and Gazit (2006) Current Nanoscience 52:105-111)。苯丙氨酸二肽已被證明可以自組裝成肽納米管(Reches andGazit (2003) Science 300:625-627)。此后研究表明，自組裝苯丙氨酸二肽可以用來(lái)形成肽納米管和鉬納米粒子 復(fù)合材料(Song et al. (2004) Chern. Commun. 9 =1044-1045) 此外還有研究表明這種肽納 米管還可應(yīng)用于電化學(xué)納米生物傳感器(Yemini et al. (2005) NanoLetters 5:183-186)。美國(guó)專利第7179784號(hào)描述類表面活性劑的自組裝肽可形成納米管。所公開(kāi)的肽 分子具體包含非極性不帶電荷的側(cè)鏈氨基酸和陽(yáng)離子(帶正電)和/或陰離子(帶負(fù)電) 的側(cè)鏈氨基酸。這些多肽是兩親性的，為避免其烴鏈與水接觸而傾向于聚集。此類多肽分 子自組裝的基本原則是形成一個(gè)分離碳?xì)浠衔锖退畢^(qū)的極性界面。美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2002/0160471介紹了肽支架在各種組織修復(fù)和替換中的應(yīng) 用。再一次，為此目的，此申請(qǐng)涉及采用互補(bǔ)的和結(jié)構(gòu)上相容的具有交替疏水性和親水性氨 基酸的兩性自組裝肽的應(yīng)用。美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0164361公開(kāi)了通過(guò)對(duì)照自組裝肽的環(huán)境可以有助于 對(duì)照其成核及積聚增長(zhǎng)過(guò)程。美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0181973描述了具有兩類氨基酸結(jié)構(gòu)域的自組裝多 肽。第一個(gè)結(jié)構(gòu)域含有交替疏水性和親水性氨基酸，未經(jīng)修改的氨基酸可以調(diào)節(jié)自組裝成 宏觀結(jié)構(gòu)。第二個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)域無(wú)法自己進(jìn)行分子自組裝。此申請(qǐng)中，該肽的典型的第二 個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)域模仿自然存在蛋白質(zhì)中(如基底膜的組成部分)具有生物活性的肽基序。美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0209145公開(kāi)了自組裝兩性多肽能夠通過(guò)特異的非共 價(jià)相互作用與生長(zhǎng)因子結(jié)合。此申請(qǐng)公開(kāi)的典型多肽包含一個(gè)烷基尾，一個(gè)可形成β折疊 的肽序列，及一個(gè)具有生物活性的肽序列。美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0272662介紹兩性肽分子組合物，其中包含第一種兩 性肽，具有親水區(qū)和離子電荷，第二種兩性肽具有親水區(qū)和相反的離子電荷。每個(gè)親水區(qū)都 跟一個(gè)生物信號(hào)相關(guān)。YIGSR和IKVAV是所公開(kāi)肽的兩個(gè)例子。美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2006/0079454公開(kāi)了由自組裝肽聚合所形成的管狀、平面 和球型的納米結(jié)構(gòu)。此申請(qǐng)中的肽包含芳香族氨基酸，可以完全由芳香族氨基酸組成，并且 不超過(guò)4個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2006/0084607公開(kāi)了具有交替親水性和疏水氨基酸的兩性肽鏈。此類肽含有至少8個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度、具有相容和互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)，可以自組裝成β-折疊 片，以形成具有宏觀結(jié)構(gòu)的支架。大多數(shù)本領(lǐng)域已知的自組裝的多肽都由交替疏水性和親水性氨基酸或氨基酸片 段組成。仍然需要基于氨基酸性質(zhì)而不是基于電荷來(lái)設(shè)計(jì)多肽。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了自我互補(bǔ)和組裝成納米結(jié)構(gòu)的鏈肽。這些 肽的設(shè)計(jì)基于氨基酸的氨基酸配對(duì)性質(zhì)。證明了此類肽可提高疏水藥物溶解度。此種以 β “鏈肽為基礎(chǔ)的納米結(jié)構(gòu)的多種應(yīng)用包含藥物遞送，生物分子傳感器和生物燃料電池的 應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種具有交替氫鍵質(zhì)子供體氨基酸片段和氫鍵質(zhì) 子受體的氨基酸片段的自我互補(bǔ)鏈肽，可以自我組裝成納米結(jié)構(gòu)。此類多肽含有2至 40個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。此類多肽至少含有一個(gè)質(zhì)子供體和一個(gè)質(zhì)子受體片段，每個(gè)片段由至少 一個(gè)氨基酸組成。此種肽不是由交替的疏水性和親水性氨基酸片段組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供的自我互補(bǔ)型鏈肽具有一種下列結(jié)構(gòu)a) (AxByCz)wAz(I)，和b) (AxByCz)w(C' XB' yA' z)w (II)A、A'、B、B'、(和('，為可形成氫鍵的氨基酸，可以是質(zhì)子供體或質(zhì)子受體氨基 酸；X和y每個(gè)獨(dú)立地為從1到10的整數(shù)，；Z是從0到10的一個(gè)整數(shù)；W是從1至20的一 個(gè)整數(shù)。A互補(bǔ)于A'，B互補(bǔ)于B'，C互補(bǔ)于C'。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供的自我 互補(bǔ)型β-鏈肽還可具有下列結(jié)構(gòu)之一a)AxByCz- ；(III)，和b) AxByCz-Cz' By' Ax' (IV).A、A'、B、B'、(和('每個(gè)獨(dú)立地是供體氨基酸或受體氨基酸，而且每個(gè)自我互 補(bǔ)。這些氨基酸可選自以下組成的組氫鍵供體氨基酸，氫鍵受體氨基酸，帶正電荷的氨基 酸，帶負(fù)電荷的氨基酸，范德華相互作用的氨基酸。A互補(bǔ)于A'，B互補(bǔ)于B'，C互補(bǔ)于 C'。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種自我互補(bǔ)鏈肽，此鏈肽含有至少 一個(gè)氫鍵氨基酸對(duì)，至少一個(gè)離子互補(bǔ)氨基酸對(duì)，和至少一個(gè)疏水氨基酸對(duì)，以形成納米結(jié) 構(gòu)。該肽含有4至40個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種自組裝納米結(jié)構(gòu)，此納米結(jié)構(gòu)是由具有下 列結(jié)構(gòu)式中的一個(gè)多肽聚集而組成a) (AxByCz)wI ；和b) (AxByCz)wAxII.A、B、C均為選自質(zhì)子供體和質(zhì)子受體的氫鍵氨基酸；χ和y每個(gè)獨(dú)立地是從1到 10的一個(gè)整數(shù)，ζ是從0到10的一個(gè)整數(shù)；w是從1至20的一個(gè)整數(shù)。此類自組裝肽形成 的納米結(jié)構(gòu)是以下中的一種納米纖維，納米線，納米薄膜和納米球。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了由具有通式(V)的肽的聚集單位組成的自組裝 納米結(jié)構(gòu)
(AwBxAyCz)nAaBb(V).A、B和C均為選自下列組中的氨基酸疏水氨基酸，帶電氨基酸和氫鍵氨基酸，并 且A、B和C是不同的氨基酸；w、x、y和ζ每個(gè)獨(dú)立地是從1到5的整數(shù)，A和B每個(gè)獨(dú)立地 是從0到2的整數(shù)，并且η是從1到10整數(shù)。自組裝肽形成的納米結(jié)構(gòu)是以下的一種納 米纖維、納米線、納米薄膜和納米球。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供與治療制劑結(jié)合的包含描述的鏈肽的藥物組 合物。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了用于給病人遞送材料的試劑盒，此試劑盒包含包 含自組裝β _鏈肽和治療劑的藥物組合物、一種或更多種電解質(zhì)，緩沖液，遞送工具，適于 將一種或更多種其他成份與組合物混合到一起的容器，準(zhǔn)備使用藥物組合物的說(shuō)明書(shū)，混 合組合物和其它成分的說(shuō)明書(shū)，和將此組合物給予受試者的說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種使用具有氨基酸配對(duì)特性的自組肽來(lái)制備納 米結(jié)構(gòu)的方法。該方法包含下列步驟設(shè)計(jì)鏈肽，其由與互補(bǔ)氨基酸至少能夠形成下列 作用力的一種氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和范德華作用力的氨基酸組成；形成含 有2至40個(gè)氨基酸的鏈，該鏈含有至少一個(gè)氨基酸對(duì)，能夠形成至少一種下列作用力氫 鍵、靜電相互作用、疏水相互作用、以及范德華作用力，并具有互補(bǔ)性氨基酸對(duì)并與第二個(gè) 肽具有立體化學(xué)作用。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)目標(biāo)的生物分子的方法。該方法包含下 列步驟通過(guò)肽的自組裝從鏈肽形成納米結(jié)構(gòu)；將肽吸收到電極的表面，允許電子轉(zhuǎn)移 和生物催化分子的固定；在納米結(jié)構(gòu)的肽包裹的表面偶聯(lián)一個(gè)提供可檢測(cè)信號(hào)的“報(bào)道”分 子；提供目標(biāo)的生物分子。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了 一個(gè)使用β -鏈肽來(lái)確定蛋白質(zhì)聚集疾病抑制劑 的方法。


本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式的這些以及其它特征將在下面的描述中變得更明顯，其中 附圖可提供參考圖1是一種基于氨基酸配對(duì)(AAP)的自組裝肽設(shè)計(jì)的流程圖。圖2Α是芘在不含肽的情況下(0毫克/毫升)或在含有 ΕΑΚ16-ΙΙ (ΑΕΑΕΑΚΑΚΑΕΑΕΑΚΑΚ) (0.5毫克/毫升)的情況下在玻璃瓶中的照片。芘的化學(xué)結(jié) 構(gòu)如下所示。圖2Β是0. 1毫克/毫升玫瑰樹(shù)堿在逐步減少的ΕΑΚ16-ΙΙ肽濃度(0. 5,0. 1和0 毫克/毫升)的情況下在玻璃瓶中的照片。最后瓶(最右)是一個(gè)沒(méi)有ΕΑΚ16-ΙΙ肽的對(duì) 照。玫瑰樹(shù)堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)列在下圖。圖3Α描述了芘從ΕΑΚ16-ΙΙ肽的釋放速率，表達(dá)為芘濃度(測(cè)量單位為微摩爾/ 升)對(duì)時(shí)間(測(cè)量單位為小時(shí))的函數(shù)(Keyes-Baiget al. (2004) J. Am. Chern. Soc. 126 7522-7532〃 KeyesBaiget al. (2004)")。圖3B是在溶液中芘和EAK比例為78 1時(shí)的一個(gè)掃描電鏡照片。虛線從圖3A 中的掃描電鏡照片延長(zhǎng)至相應(yīng)的芘釋放曲線(fromKeyes-Baig et al. (2004))。
圖3C是在溶液中芘和EAK比例為16 1時(shí)的一個(gè)掃描電鏡照片。虛線從圖3A 中的掃描電鏡照片延長(zhǎng)至相應(yīng)的芘釋放曲線(fromKeyes-Baig et al. (2004))。圖4是β -淀粉樣肽(1-42個(gè)氨基酸)在疏水性H0PG(高定向裂解石墨)表面 (A-C)和云母表面(D-H)上的原子力顯微鏡照片。圖像之間的時(shí)間間隔為512s。(I)是 β-淀粉樣肽氨基酸序列的示意圖。箭頭表明，Αβ在疏水石墨(HOPG)和云母表面上的組 裝可能暗示分別在疏水性的脂膜內(nèi)部和親水性(帶負(fù)電)頭部的Αβ聚集。圖5是ΕΑΚ16-ΙΙ肽的納米纖維在云母表面成核和增長(zhǎng)的示意圖。肽單體以矩形 框表示。多肽上的電荷示意為(_和+)。圖6是一種肽單體在云母表面上組裝的示意圖，肽內(nèi)正電荷被吸引到帶云母的負(fù) 電荷上。圖中顯示平放的兩個(gè)多肽。圖7是ΕΑΚ16-ΙΙ肽二聚體在不同ρΗ的溶液中在云母表面上組裝的一系列示意 圖Α)水(中性)；B) ImM HCL ；C) IOmM HCL ；D) ImM NaOH ；和 E) IOmM NaOH。在 IOmM NaOH 中，肽二聚體不吸附在云母表面上，無(wú)纖維形成。這說(shuō)明了溶液ρΗ值調(diào)控在云母上的表面 輔助的肽組裝。圖8顯示了由能夠形成氫鍵的氨基酸組成的本發(fā)明的肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在合成的肽 中，氫鍵對(duì)的排列根據(jù)重復(fù)對(duì)單3位的數(shù)量(肽長(zhǎng)度)而變化，例如QN和NS對(duì)應(yīng)QNQN和 NSNS或NSNSNSNS，也可根據(jù)重復(fù)單位本身而設(shè)計(jì)(如QN與QQNN)。圖9A是用肽QN、QNQN、QQNN和NS4 (NSNSNSNS)的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)圖， 相對(duì)波數(shù)(cm—1)繪制吸收?qǐng)D譜。FTIR光譜可確定肽在表面(干燥的)上所形成的二級(jí)結(jié) 構(gòu)。圖9B 是肽 QN、QNQN、QQNN和 NS4 (NSNSNSNS)的相對(duì)波長(zhǎng)繪制的圓二色(CD) (mdeg) 光譜圖。CD光譜可用來(lái)確定肽在本體溶液中的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖10是肽NS4、QNQN、QN、QQNN和單獨(dú)ThT的硫磺素T (ThT)檢測(cè)法的熒光光譜測(cè) 定圖。以標(biāo)準(zhǔn)化的強(qiáng)度對(duì)波長(zhǎng)(nm)作圖。ThT熒光增強(qiáng)與在溶液中所形成的β-折疊的大
量存在有關(guān)。圖IlA是QN肽(肽濃度為0. lmg/ml)的掃描電子顯微鏡(SEM)的圖像。圖IlB是QNQN肽(肽濃度為0. lmg/ml)的掃描電子顯微鏡圖像。圖IlC是QQNN肽(肽濃度為0. lmg/ml)的掃描電子顯微鏡圖像。圖IlD是NS肽(肽濃度為0. lmg/ml)的掃描電子顯微鏡圖像。圖IlE是NSNS (肽濃度為0. lmg/ml)的掃描電子顯微鏡圖像。圖IlF是NSNSN (肽濃度為0. lmg/ml)的掃描電子顯微鏡圖像。圖IlG是NSNSNSNS (肽濃度為0. lmg/ml)的掃描電子顯微鏡圖像。圖12A是各種濃度NS4肽(mM)的ThT檢測(cè)法的熒光光譜數(shù)據(jù)圖象。圖中箭頭指 向的ThT熒光峰根據(jù)肽的濃度的增加而增加。標(biāo)準(zhǔn)化的強(qiáng)度對(duì)波長(zhǎng)(nm)作圖。圖12B是圖12A中繪制的標(biāo)準(zhǔn)化的強(qiáng)度值對(duì)濃度(μ M)的Log值的數(shù)據(jù)的圖像。 圖中箭頭所指的峰為臨界聚集濃度(CAC)。圖13A是本發(fā)明的AC8肽(FEFQFNH0的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖。圖13B是AC8肽分子結(jié)構(gòu)示意圖。箭頭所指為一對(duì)離子鍵對(duì)，一對(duì)氫鍵(HB)對(duì)和 疏水殘基。
圖14A是各種濃度的AC8肽的表面張力相對(duì)時(shí)間的函數(shù)的圖(測(cè)量單位mj/m2)。圖14B是圖14A中的一個(gè)平衡表面張力作為多肽濃度(μ M)的函數(shù)的圖。兩條直 線相交點(diǎn)為CAC。圖15Α是對(duì)于AC8肽相對(duì)波長(zhǎng)(nm)繪制的熒光強(qiáng)度(a. u.)的ThT熒光光譜圖。 圖15B是相對(duì)肽濃度(μΜ)繪制的圖15Α中ThT熒光光譜圖。圖中兩條直線相交點(diǎn)說(shuō)明 AC8 的 CAC 為約 20 μ Μ。圖16Α是AC8肽相對(duì)波長(zhǎng)(nm)繪制的8_苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-l-napht halenesulfonic acid,ANS)檢測(cè)法的熒光光譜(a. u.)圖。箭頭表明熒光峰出現(xiàn)在475nm。圖16B是圖16A中的ANS熒光光譜數(shù)據(jù)相對(duì)肽濃度(μ Μ)繪制的圖。這兩個(gè)直線 相交點(diǎn)顯示AC8的CAC為20微摩爾。圖17Α是AC8肽的標(biāo)準(zhǔn)化光強(qiáng)度對(duì)肽濃度(微摩爾/升)的靜態(tài)光強(qiáng)度圖。圖中 兩條直線相交點(diǎn)說(shuō)明AC8的CAC接近20微摩爾/升。圖17Β不同濃度的AC8肽大小尺寸(水力直徑，nm)分布(％ )圖。圖18A是2.2微摩爾/升AC8肽自組裝結(jié)構(gòu)的一個(gè)原子力顯微鏡圖像。圖18B是5微摩爾/升AC8肽自組裝結(jié)構(gòu)的一個(gè)原子力顯微鏡圖像。圖18C是10微摩爾/升AC8肽自組裝結(jié)構(gòu)的一個(gè)原子力顯微鏡圖像。圖18D是40微摩爾/升AC8肽自組裝結(jié)構(gòu)的一個(gè)原子力顯微鏡圖像。圖18E是87微摩爾/升AC8肽自組裝結(jié)構(gòu)的一個(gè)原子力顯微鏡圖像。圖18F是利用AC8肽的紅外吸收光譜圖，相對(duì)波數(shù)繪制的吸收?qǐng)D，表明AC8肽形成 大量的折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)圖19是AC8肽單體濃度低于CAC(左側(cè))及高于CAC(右側(cè))時(shí)的組裝示意圖，其 中AC8濃度高于CAC時(shí)產(chǎn)生成熟纖維，原細(xì)纖維和肽單體的混合物。圖20Α是與單獨(dú)的EAK肽相比(藍(lán)色條)，在不同濃度的EAK肽(微克/毫升)與 玫瑰樹(shù)堿(紅色條)存在下，MCF-7的細(xì)胞存活度(測(cè)量為％存活度)的圖。黑色和綠色 條分別為代表細(xì)胞培養(yǎng)液和水溶劑的對(duì)照。圖20Β是不同濃度的EAK肽(毫克/毫升)或水與0. 1毫克/毫升玫瑰樹(shù)堿在玻 璃小瓶中的照片。圖20C是0. 1毫克/毫升玫瑰樹(shù)堿與0. 5毫克/毫升EAK肽的掃描電鏡照片。圖20D是0. 1毫克/毫升玫瑰樹(shù)堿與0. 1毫克/毫升EAK肽的掃描電鏡照片。圖20Ε是僅有0. 1毫克/毫升玫瑰樹(shù)堿在水溶液中的掃描電鏡照片。圖21Α是在各種不同濃液中(細(xì)胞培養(yǎng)基，Η20，3. 3%二甲基亞砜)，單獨(dú)玫瑰樹(shù)堿 (0. 1毫克/毫升)，或存在(紅色條)或不存在玫瑰樹(shù)堿時(shí)(藍(lán)色條)0. 1毫克/毫升的各 種不同多肽(EAK-P，EAKK, EFK, NS4, FEQNK, QN, QNQN 或 QQNN)時(shí)，Α549 細(xì)胞的存活度。所 有有關(guān)多肽存在的細(xì)胞存活度實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)都是在有血清的條件下進(jìn)行的。圖21Β是在各種不同濃液中(細(xì)胞培養(yǎng)基，Η20，3.3%二甲基亞砜)，單獨(dú)玫瑰樹(shù)堿 (0. 1毫克/毫升)，或存在(深色條)或不存在玫瑰樹(shù)堿時(shí)(淡色條)各種不同肽(ΕΑΚ-ρ， EAKK, EFK, NS4, FEQNK, QN, QNQN或QQNN)中Α549細(xì)胞的存活度。所有有關(guān)多肽存在的細(xì) 胞存活度實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)都是在4小時(shí)無(wú)血清的條件下進(jìn)行的。圖22是對(duì)于各種不同多肽，在玫瑰樹(shù)堿(EPT)存在時(shí)，發(fā)射熒光(標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度)對(duì)波長(zhǎng)(nm)的圖。箭頭分別指向晶體形式的EPT，電中性EPT和質(zhì)子化的EPT。圖23A是在各種不同濃度AC8肽中(微摩爾/升)同時(shí)在1. 33%的二甲基亞砜中 含有0. 04毫克/毫升玫瑰樹(shù)堿(EPT)的發(fā)射熒光(標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度)對(duì)波長(zhǎng)(nm)的圖，表明 AC8肽具有溶解EPT的能力。圖23B是圖23A中熒光強(qiáng)度對(duì)肽濃度繪制的圖，表明肽溶解EPT的能力與其本身 濃度相關(guān)。圖24A是在各種對(duì)照介質(zhì)中(1.3%二甲基亞砜，PBS，H20，單獨(dú)培養(yǎng)基)A549細(xì)胞 的存活度。圖24B是在各種濃度EAK及1.3% 二甲基亞砜條件下，在含有(紅色條)及不含 (藍(lán)色條)EPT時(shí)A549細(xì)胞的存活度。圖24C是在各種對(duì)照液中(1. 3%二甲基亞砜，磷酸鹽緩沖溶液，水，培養(yǎng)基)MCF-7 細(xì)胞的存活度。圖24D是在各種濃度EAK及1.3%二甲基亞砜條件下，在含有(紅色條)及不含 (藍(lán)色條)EPT時(shí)MCF-7細(xì)胞的存活度。圖24E是5，9和100微克/毫升AC8與0. 04毫克/毫升EPT的熒光發(fā)射光譜。溶 液中含有1. 3%二甲基亞砜。該溶液對(duì)A549和MCF-7兩種細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)試，數(shù)據(jù)如圖24B 和D所示。圖25A描繪在僅有培養(yǎng)基，水，各種濃度的EAK肽(125或25微克/毫升)，25微 克/毫升AC8肽，EPT與水溶液(EPT-H ；25微克/毫升)，或玫瑰樹(shù)堿溶在二甲基亞砜中 (EPT-D ；25微克/毫升)條件下，在不同時(shí)間點(diǎn)直到48小時(shí)的治療過(guò)程中(時(shí)間間隔表示 在該圖的頂部)，A549細(xì)胞的存活度。所有肽-EPT組合的制備均不含二甲基亞砜。紅/暗 紫色條代表存在EPT與多肽，而藍(lán)/淺紫色條代表僅有肽。圖25B顯示如圖25A的MCF-7細(xì)胞類似的數(shù)據(jù)。圖26A是描繪在培養(yǎng)基，水，或各種濃度的AC8肽(微克/毫升)在有(紅色條) 及無(wú)EPT(藍(lán)色條)時(shí)A549細(xì)胞的存活度的條形圖。圖26B描繪了在存在玫瑰樹(shù)堿(EPT)時(shí)AC8肽稀釋效應(yīng)對(duì)A549存活度的條形圖。 (Dl = 2倍稀釋；D2 = 4倍稀釋；D3 = 8倍稀釋，D4 = 16倍稀釋)。圖26C是描繪在培養(yǎng)基，水，或各種濃度的AC8肽(微克/毫升)在有(紅色條) 及無(wú)EPT(藍(lán)色條)時(shí)MCF-7細(xì)胞的存活度的條形圖。圖26D描繪了在存在玫瑰樹(shù)堿(EPT)時(shí)AC8肽稀釋效應(yīng)對(duì)MCF-7存活度的條形圖。 (Dl = 2倍稀釋；D2 = 4倍稀釋；D3 = 8倍稀釋，D4 = 16倍稀釋)。圖27A是不同濃度的AC8肽(毫克/毫升)與0. 04毫克/毫升玫瑰樹(shù)堿的發(fā)射 熒光(標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度)對(duì)波長(zhǎng)(nm)的函數(shù)。圖27B相對(duì)圖27A中的波長(zhǎng)繪制的熒光發(fā)射的放大圖。圖27C是描繪在培養(yǎng)基，水，或各種濃度的AC8肽(微克/毫升)在有(紅色條) 及無(wú)EPT(藍(lán)色條)時(shí)A549細(xì)胞的存活度的條形圖。圖27D描繪了在存在玫瑰樹(shù)堿(EPT)時(shí)，AC8肽稀釋效應(yīng)對(duì)A549存活度的條形圖。 (Dl = 2倍稀釋；D2 = 4倍稀釋；D3 = 8倍稀釋，D4 = 16倍稀釋)。圖27E是描繪在培養(yǎng)基，水，或各種濃度的AC8肽(微克/毫升)在有(紅色條)及無(wú)EPT(藍(lán)色條)時(shí)MCF-7細(xì)胞的存活度的條形圖。圖27F描繪在存在玫瑰樹(shù)堿(EPT)時(shí)，AC8肽稀釋效應(yīng)對(duì)MCF-7存活度的條形圖。 (Dl = 2倍稀釋；D2 = 4倍稀釋；D3 = 8倍稀釋，D4 = 16倍稀釋)。圖28 是在 pH4 (A-C)和 pH7 (D-F)條件下，各種濃度的 dG16(A，D)、dG16(B, Ε)和 dGC16 (C，F(xiàn))寡核苷酸的Δ ODr對(duì)總EAK肽濃度的函數(shù)的一系列點(diǎn)圖。圖29是EAK肽結(jié)合dG16，dC16和dGC16的v/Pf對(duì)ν函數(shù)的對(duì)點(diǎn)圖，pH4 (A)和ρΗ7⑶。圖30是EAK肽溶液與3. 6微摩爾/升的(A) FAM_dGC16在pH4 (激發(fā)波長(zhǎng)為452nm， 發(fā)射波長(zhǎng)為514nm) ； (B) FAM_dGC16，在pH 7 (激發(fā)波長(zhǎng)為494nm，發(fā)射波長(zhǎng)為514nm) ； (C) FAM-dC16在pH4(激發(fā)波長(zhǎng)為452nm，發(fā)射波長(zhǎng)為514nm)；和(D)FAM_dC16在pH7 (激發(fā)波 長(zhǎng)為494nm，發(fā)射波長(zhǎng)為514nm)混合的上清液中的熒光各向異性的點(diǎn)圖。圖31是FAM-ClC16在加入EAK后所形成的聚集物中光的各向異性(〇)和計(jì)算的 百分比(■)。圖32是dC16-Rh在有及無(wú)EAK時(shí)并在pH值為7條件下的紫外線吸收光譜。(A) 3. 9 微摩爾/升dC16-Rh( ·),60微摩爾/升EAK(+)，3. 9微摩爾/升dC16-Rh和60微摩爾/
升EAK，離心前Γ-)和離心后(X) ； (B)濃度圍3.9(·)，2.0(~_)，1.3(Χ)微摩爾/升的
(!C16-Rh0圖33是3. 6微摩爾/升dGC16與各種濃度EAK的混合物在㈧pH4和⑶pH7的 20%聚丙烯酰胺凝膠電泳的照片(0，6，60，120微摩爾/升EAK分別在第1，2，3，4跑道上)。圖34是0. 1毫克/毫升EAK溶液含有Imol %的FAM-EAK在有(·)及無(wú)(o) (A) 3. 6 微摩爾/升dG16在pH4 (激發(fā)波長(zhǎng)為452nm，發(fā)射波長(zhǎng)為514納米)；和(B) 4. 3微摩爾/升 dG16在pH7 (激發(fā)波長(zhǎng)為494nm，發(fā)射波長(zhǎng)為514納米)條件下光的各向異性的對(duì)點(diǎn)圖。圖35是通過(guò)穩(wěn)態(tài)光散射(SLS)獲得的對(duì)點(diǎn)圖，在(ο)緩沖液和含有(▲ ) 3. 6微 摩爾/升dG16和和0. 1毫克/毫升EAK，( □ ) 0. 1毫克/毫升ΕΑΚ，(χ) 3. 6微摩爾/升dG16 在(A)pH4和(B)pH7的溶液中。激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)均為350納米。圖36是EAK-寡核苷酸(ODN)復(fù)合物的原子力顯微鏡(AFM)圖像，EAK-寡核苷酸 (ODN)復(fù)合物形成在含有3. 6微摩爾/升dG16和和0. 1毫克/毫升，pH值為4的溶液中， (A) 8分鐘；(B) 60分鐘；(C) 70分鐘；及(D) 75分鐘。圖片C和D分別是標(biāo)記的區(qū)域B和C 中的放大圖。圖37是動(dòng)態(tài)光散射所測(cè)的EAK-ODN復(fù)合物的直徑分布直方圖。溶液含有7. 2微 摩爾/升dG16和和各種濃度的EAK，溶液pH值為4。僅有EAK樣本的測(cè)定于在其制備后40 分鐘，其濃度為0. 1毫克/毫升(60微摩爾/升)，僅有dG16的樣本濃度為7. 2微摩爾/升。圖38是3. 6微摩爾/升僅有熒光標(biāo)記的dC16和其與0. 2毫克/毫升的EAK所形 成復(fù)合物在PH4溶液中被KI的熒光淬滅的Stern-Volmer圖。實(shí)線代表適合在表_12中列 出參數(shù)的 Stern-Volmer 方程。(A) FAM_dC16 (A), FAM-dC16_EAK ( □)禾口 (B) dC16-Rh (A), dC16-Rh-EAK (D)0圖39是0. 5毫克/毫升EAK16-II肽(用0. 22微米過(guò)濾器過(guò)濾)溶解于水，1毫 摩爾/升鹽酸，10毫摩爾/升鹽酸和10毫摩爾/升氫氧化鈉的散射光強(qiáng)度(測(cè)量動(dòng)態(tài)光散 射(DLS)的光吸收)對(duì)時(shí)間(小時(shí))的繪制的圖。圖40是EAKI6-II肽納米纖維在純水中的云母表面從吸附的納米纖維“種子”(上圖)和纖維聚集團(tuán)(下圖)增長(zhǎng)的原子力顯微鏡成像圖。綠色箭頭表示納米纖維從“種子 的兩個(gè)活化點(diǎn)”的增長(zhǎng)和紅色箭頭指向參考點(diǎn)(上圖)。圖41是顯示2微摩爾/升EAK16-II肽在云母表面在pH值逐漸增加條件下(分別 為10毫摩爾/升鹽酸，1毫摩爾/升鹽酸，水，1毫摩爾/升氫氧化鈉，10毫摩爾/升氫氧 化鈉)的納米結(jié)構(gòu)形成的一系列原子力顯微鏡圖。線從各顯微鏡照片至相應(yīng)PH條件下的 Zeta電位(毫伏)與溶液pH值的函數(shù)圖。圖42A是在各種PH值條件下(1毫摩爾/升鹽酸，水，和1毫摩爾/升氫氧化鈉)2 微摩爾/升EAK16-II肽納米纖維在云母表面上增長(zhǎng)速度(單位為納米/秒)的頻率圖(單 位為％)。圖42B是2微摩爾/升EAK16-II肽納米纖維在各種pH值條件下在云母表面上平 均增長(zhǎng)速率的表格。圖43A是EAK16-II (0. 05毫克/毫升)在云母表面上，在水中成像的原子力顯微鏡 圖。圖43B是EAK16-II (0. 05毫克/毫升)在高定向裂解石墨表面上，在水中成像的原 子力顯微鏡圖。圖44A是肽單體在高定向裂解石墨表面自組裝的示意圖。箭頭指示的方向?yàn)榧{米 纖維的增長(zhǎng)方向。為了最大限度形成多肽之間及多肽與裂解石墨表面的疏水相互作用力， 肽分子傾向于沿著HOPG晶格方向排列最多的碳原子。從而導(dǎo)致肽納米纖維的方向成60或 120度角。圖44B是10微摩爾/升EAK16-II肽在高定向裂解石墨表面上組裝的原子力顯微 鏡成像圖，顯示纖維的方向成60或120度角，與圖44A中高定向裂解石墨的晶格方向相像。圖44C是一個(gè)EAK16-II肽單體示意圖，表明基于肽的尺寸和HOPG的晶格其對(duì)高 定向裂解石墨晶格的覆蓋。圖45是肽修飾后表面兩性變化的一系列顯微照片(A)水滴在云母表面(無(wú)多 肽)；(B)水滴在EAK修飾的云母表面；(C)水滴在高定向裂解石墨表面和(D)水滴在EAK 修飾的高定向裂解石墨表面。圖46A裸的高定向裂解石墨表面的原子力顯微鏡成像圖和對(duì)應(yīng)的截面分析。圖46B是EAK肽改性的高定向裂解石墨表面的原子力顯微鏡圖。圖46C是葡萄糖氧化酶(GOx)分子在裸的高定向裂解石墨表面的原子力顯微鏡成 像圖及其相應(yīng)的截面分析。粗糙背景表示該GOx在高定向裂解石墨表面可能發(fā)生變性。圖46D是葡萄糖氧化酶(GOx)分子在EAK肽改性的高定向裂解石墨表面的原子力 顯微鏡圖。比圖46C更多的球型GOx出現(xiàn)在改性的高定向裂解石墨表面上，顯示表面改性 提供了 一種對(duì)GOx吸附更生物兼容性的環(huán)境。圖47是EAK肽上的谷氨酸與酶如葡萄糖氧化酶上的氨基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的示意圖。 EDC 1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺；NHS =N-羥基琥珀酰亞胺。圖48是描繪ΕΠ(肽修飾的和未修飾的高定向裂解石墨的電化學(xué)性能的1毫摩爾/ 升鐵氰化鉀在從2至100mV/S的不同掃描速率下的一系列循環(huán)伏安圖。在低掃描速率下， EAKI6-II納米纖維表面涂層不會(huì)明顯阻止電子轉(zhuǎn)移。圖49是葡萄糖氧化酶固定于EAK肽修飾的高定向裂解石墨電極上的一個(gè)相對(duì)電壓繪制電流的循環(huán)伏安圖，銀/氯化銀電極為參比電極，掃描速率為2毫伏/秒。圖50是20毫摩爾/升葡萄糖在葡萄糖氧化酶固定于EAK肽修飾的高定向裂解石 墨電極上氧化的電流(微安)對(duì)電壓(伏)的圖。銀/氯化銀電極為參比電極，電極的幾 何表面積為1平方厘米。圖5IA是不同濃度葡萄糖(0-20毫摩爾/升)在GOx固定的EAK肽/HOPG電極上 氧化的電流(微安)對(duì)時(shí)間(秒)的圖。圖51B是GOx固定的EAK肽/HOPG電極電流(微安)對(duì)葡萄糖的濃度(毫摩爾/ 升)的圖。這些數(shù)據(jù)可以用來(lái)擬合下面的非線性回歸方程，以獲取最大電流Imax和酶-底 物復(fù)合物的米氏常數(shù)Km。Imax 最大電流，Kffl 酶-底物復(fù)合物的米氏常數(shù)。圖52表示GOx-固定的EAK肽/HOPG電極貯存可長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月的穩(wěn)定性圖。圖53表示GOx固定的EAK肽/HOPG電極具有較高的操作穩(wěn)定性的圖。圖54A是一個(gè)應(yīng)用GOx固定的EAK肽/HOPG電極作為生物燃料電池示意圖。圖54B是一個(gè)說(shuō)明使用漆酶和氫化酶的02/H2生物燃料電池中電子和質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī) 制的示意圖。圖55是一個(gè)基于修飾的EAK肽的自組裝與電化學(xué)還原和加強(qiáng)步驟制造金屬納米 線的示意圖。圖56示出了在pH7. 3的HEPES緩沖液中siRNA與越來(lái)越高濃度的肽(從0到40 微摩爾/升)的吸收光譜。(從上到下)圖57說(shuō)明了在260納米波長(zhǎng)下，不同濃度siRNA的減色效應(yīng)相對(duì)R9濃度的函數(shù)。 siRNA的濃度為1. 5微摩爾/升(ο)，3. 0微摩爾/升(■)和4. 5微摩爾/升(*)。實(shí)線 是用Prism產(chǎn)生的最佳線性擬合。誤差線代表每個(gè)siRNA濃度下三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖58說(shuō)明了在260納米波長(zhǎng)下，不同濃度siRNA的減色效應(yīng)相對(duì)正電荷/負(fù)電荷 比例的函數(shù)。siRNA的濃度為1. 5微摩爾/升(ο)，3. 0微摩爾/升(■)和4. 5微摩爾/ 升(*)。實(shí)線是用Prism產(chǎn)生的最佳線性擬合。圖59是3. 0微摩爾/升的siRNA (上)和100微摩爾/升的R9 (下)在HEPES緩 沖液中(6毫摩爾/升HEPES-氫氧化鈉，20毫摩爾/升氯化鈉，0. 2毫摩爾/升氯化鎂，pH 值7. 3)的圓二色譜圖。光譜顯示一個(gè)典型的siRNA的A-DNA結(jié)構(gòu)和R9的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。圖60說(shuō)明了在pH7. 3HEPES緩沖液中siRNA與越來(lái)越高濃度的肽(從0到40微 摩爾/升)的圓二色譜圖。(從上到下)圖61說(shuō)明了在260納米波長(zhǎng)下，siRNA的橢圓相對(duì)R9濃度的函數(shù)的相關(guān)變化。 siRNA的濃度為1. 5微摩爾/升(ο)，3. 0微摩爾/升(■)。實(shí)線是用Prism產(chǎn)生的最佳 線性擬合。圖62說(shuō)明了在260納米波長(zhǎng)下，siRNA的橢圓作為正電荷/負(fù)電荷比例的函數(shù)的 相對(duì)變化。siRNA的濃度為1. 5微摩爾/升(ο)，3. 0微摩爾/升(■)。實(shí)線是用Prism 產(chǎn)生的最佳線性擬合。圖63說(shuō)明了 1. 5微摩爾/升CTGFsiRNA_R9肽的復(fù)合物的水力直徑和Zeta電位。 siRNA和siRNA-R9復(fù)合物的Zeta電位用實(shí)條表示；R9的Zeta電位用斜條表示；大小是由 實(shí)線表示。誤差線是三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖64說(shuō)明了 siRNA(l. 5微摩爾/升)和siRNA_R9(l. 5微摩爾/升/150微摩爾/升)復(fù)合物在加入2摩爾/升鹽后，對(duì)260納米波長(zhǎng)光的吸光度。siRNA單獨(dú)的吸光度和 siRNA-R9復(fù)合物溶液的吸光度測(cè)試于在添加鹽前(白色條)、添加鹽后兩小時(shí)(斜條)和 添加鹽后一天(黑色條)。誤差線來(lái)自于三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖65說(shuō)明了計(jì)算出的CTGF siRNA-R9復(fù)合物的結(jié)合等溫線。根據(jù)Bujalowski和 洛曼發(fā)展出的分析方法，算出的自由肽濃度是錯(cuò)誤的。圖66說(shuō)明了 EAKI6-II (AEAEAKAKAEAEAKAK)的分子結(jié)構(gòu)；A是丙氨酸，E是谷氨酸 和K為賴氨酸。圖67說(shuō)明了肽-玫瑰樹(shù)堿懸浮液中玫瑰樹(shù)堿熒光光譜隨著時(shí)間的變化。(A)玫瑰 樹(shù)堿熒光光譜對(duì)時(shí)間的函數(shù)；(B)在468納米(菱形)和520納米(方形)下，玫瑰樹(shù)堿標(biāo) 準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度對(duì)時(shí)間的函數(shù)。玫瑰樹(shù)堿濃度為1. 0毫克/毫升；肽濃度為0. 2毫克/毫升。圖68顯示0. 2毫克/毫升EAKI6-II溶液在機(jī)械攪拌前(菱形)和30小時(shí)后(方 形)對(duì)400nm光的靜態(tài)光散射圖。圖69顯示肽濃度對(duì)復(fù)合物形成的影響。肽_玫瑰樹(shù)堿懸浮液中玫瑰樹(shù)堿在468 納米(A)和520納米(B)的標(biāo)準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度作為時(shí)間的函數(shù)。玫瑰樹(shù)堿的濃度固定在1. 0 毫克/毫升，EAK16-II肽的濃度為0至0. 5毫克/毫升。圖70顯示玫瑰樹(shù)堿濃度對(duì)復(fù)合物形成的影響。肽_玫瑰樹(shù)堿懸浮液中玫瑰樹(shù)堿 在468納米(A)和520納米(B)的標(biāo)準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度作為時(shí)間的函數(shù)。EAK16-II肽的濃度為 0. 2和0. 5毫克/毫升，玫瑰樹(shù)堿濃度為0. 1至1. 0毫克/毫升。圖71說(shuō)明了肽-玫瑰樹(shù)堿懸浮液經(jīng)過(guò)24小時(shí)機(jī)械攪拌后的玫瑰樹(shù)堿熒光光譜。 玫瑰樹(shù)堿濃度為0. 1毫克/毫升和肽濃度為0至0. 5毫克/毫升。插圖為玫瑰樹(shù)堿晶體的 熒光光譜。圖72(A)玫瑰樹(shù)堿熒光強(qiáng)度對(duì)時(shí)間的函數(shù)，顯示玫瑰樹(shù)堿從0. 05毫克/毫升 EAK16-II和0. 1毫克/毫升玫瑰樹(shù)堿在雞蛋卵磷脂囊泡中釋放。(B)玫瑰樹(shù)堿從不同的 肽-玫瑰樹(shù)堿復(fù)合物中轉(zhuǎn)移至雞蛋卵磷脂囊泡的圖。該復(fù)合物由0. 1毫克/毫升玫瑰樹(shù)堿 與各種濃度的EAK16-II制成0. 05 (三角形)，0. 1 (十字叉)，0. 2 (方形)和0. 5毫克/毫 升(空心圓)。實(shí)線代表實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合公式2或公式3的擬合曲線。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別 為 295 和 436nm。圖73是0. 1毫克/毫升玫瑰樹(shù)堿與不同濃度EAK16-II肽復(fù)合物的掃描電鏡照片 (a) 0.5毫克/毫升，(b) 0.2毫克/毫升和(c)0. 05毫克/毫升。圖74 (a)是在加入不同比率的肽-玫瑰樹(shù)堿復(fù)合物24小時(shí)后MCF-7細(xì)胞和A549 細(xì)胞的存活度；(b)經(jīng)過(guò)一系列稀釋后細(xì)胞的存活度。復(fù)合物的制備是在0. 1毫克/毫升 玫瑰樹(shù)堿與0. 02至1. 0毫克/毫升不同濃度EAK16-II條件下進(jìn)行的。圖75是EAK16-II-玫瑰樹(shù)堿復(fù)合物對(duì)MCF_7 (a)和A549 (b)細(xì)胞的時(shí)間依賴毒性 的函數(shù)。EPT-H2O為玫瑰樹(shù)堿對(duì)照組(純水)。圖75. 1顯示A549細(xì)胞(a)和MCF_7 (b)細(xì)胞攝取玫瑰樹(shù)堿的熒光圖像。綠顏色為 玫瑰樹(shù)堿的熒光。第一列為相位對(duì)比圖像，插圖為其相應(yīng)的熒光圖像。*表示半曝光時(shí)間。圖75. 2顯示在37°C和4°C條件下，A549和MCF-7細(xì)胞對(duì)玫瑰樹(shù)堿攝取的熒光圖 像。綠顏色代表玫瑰樹(shù)堿熒光。第一列顯示相位對(duì)比圖像，插圖為其相應(yīng)的熒光圖像。圖76是光強(qiáng)度為基礎(chǔ)的雞蛋卵磷脂囊泡粒徑分布圖。
圖77是肽-玫瑰樹(shù)堿的懸浮液經(jīng)過(guò)24小時(shí)攪拌后的照片。玫瑰樹(shù)堿濃度為0. 1
毫克/毫升并且肽的濃度為0至0. 5毫克/毫升。圖78(a)各種濃度的玫瑰樹(shù)堿在雞蛋卵磷脂囊泡中的校準(zhǔn)曲線。(b)圖(a)中玫 瑰樹(shù)堿相應(yīng)的紫外吸收。圖79顯示隨時(shí)間釋稀5倍(實(shí)心)和稀釋10倍(條紋)的溶液的相對(duì)紫外可 見(jiàn)光吸收度的變化(Δ( 》。溶液通過(guò)混合8. 6微摩爾/升dGI6與㈧10. 5微摩爾/ 升 EAK16-IV，pH 值為 4 ； (B) 48. 2 微摩爾 / 升 EAK16-IV，pH 值為 7 ； (C) 24. 1 微摩爾 / 升 EAK16-II，pH 值為 4，和(D) 60 微摩爾 / 升 EAK 16-11，pH 值為 7。圖80說(shuō)明(A) 5. 0微摩爾/升dC16和120微摩爾/升EAK16-II在pH值為4的 溶液中的吸收光譜。離心后溶液上清液的(χ)；待溶液干后，重懸于PH值為11的緩沖液中， 攪拌，對(duì)攪拌后的得到的溶液的離心前(□)和后(_)的吸收光譜。(B)為將在pH4(o)和 pH7 (·)的8. 6微摩爾/升dC16和0. 1毫克/毫升EAK16-IV混合，所得到的聚集物重新懸 浮于PH值為9. 5緩沖液后，其溶液的對(duì)紫外可見(jiàn)光吸收度的相應(yīng)變化對(duì)時(shí)間的函數(shù)。圖81顯示8. 6微摩爾/升Fl-dC16-Rh溶液在有或無(wú)60微摩爾/升EAK16-IV在 PH4條件下的熒光光譜。制備后半小時(shí)，溶液用pH值為4的緩沖液稀釋10倍，并且在25°C 保存1天。此EAK-ODN聚集物再與0. 7單位/微升的核酸外切酶混合。㈧無(wú)EAK16IV 20 分鐘(Δ )，30分鐘(+)，和對(duì)照實(shí)驗(yàn)，即無(wú)核酸酶(ο) ； (B)含有EAK16IV 20分鐘(+)，60 分鐘(Δ )，90分鐘(-)和無(wú)處理對(duì)照(X)。制備1天后，溶液被離心處理。圖82是標(biāo)準(zhǔn)化的ID/IA比例對(duì)降解ODN的百分比的校正曲線。ID/IA比例標(biāo)準(zhǔn)化 于完整的Fl-dC16-Rh。實(shí)線代表了適合公式，標(biāo)準(zhǔn)化ID/IA = AX降解ODN百分比+1的最 佳擬合曲線，其中 A = O. 0410士0. 002，R2 = 0. 999。圖83說(shuō)明(A) EAK肽序列對(duì)核酸酶降解寡核苷酸的保護(hù)作用的效應(yīng)。約8. 6微摩 爾/升Fl-dC16-Rh與60微摩爾/升EAK16-IV或EAK16-II在pH 4 (斜條紋)或pH7 (實(shí) 心)條件下混合30分鐘，然后再稀釋10倍。1天后對(duì)該溶液離心。(B)顯示在pH4(斜條 紋)或pH7 (實(shí)心)條件下稀釋10倍后一天Fl-ClC16-Rh在EAK-ODN聚集物的比例。圖84說(shuō)明(A) 8. 6微摩爾/升Fl_dC16-Rh與10微摩爾/升EAK16-IV在pH4條件 下形成的EAK-ODN聚集物的熒光光譜。對(duì)照實(shí)驗(yàn)(X)，樣品制備一天后，經(jīng)過(guò)核酸酶處理 30分鐘后再離心(■ )。(B)降解的寡核苷酸在EAK-ODN聚集物中的百分比對(duì)EAK16IV濃 度的函數(shù)。圖85顯示離心對(duì)8微摩爾/升Fl-ClC16-Rh與60微摩爾/升EAK16-IV在pH 4條 件下形成的EAK-ODN聚集物對(duì)核酸酶的抵抗的效應(yīng)(A)樣品制備30分鐘后，溶液經(jīng)離心 (□)或沒(méi)有離心(·)，然后稀釋10倍。24小時(shí)后，所生成的溶液與核酸外切酶I混合。 在不同時(shí)間測(cè)量寡核苷酸降解百分比；(B)制備30分鐘后，對(duì)該溶液離心，再稀釋10倍。大 約24小時(shí)后，記錄所生成溶液(X)及其離心后上清液(·)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜；(C) 寡核苷酸降解百分比。在EAK-dC16混合24h后，溶液離心一次，再在未來(lái)3天每天離心一 次。最終的溶液與核酸外切酶混合60分鐘。圖86說(shuō)明了 EAK16-II，EAK16-IV和EFK16-II的分子結(jié)構(gòu)和序列。N禾Π C端分另Ij 受乙?；王０坊Ｗo(hù)。圖87說(shuō)明了(a)EAK16_II，( )EAK16_IV和(c)EnQ6-II肽納米結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡圖像。多肽濃度為0.5毫克/毫升。圖中比例尺為200nm。圖88三種肽EAK16-II，EAK16-IV和EHQ6-II和其組裝物的反映其疏水性的動(dòng)態(tài) 表面張力(a)和ANS熒光光譜圖(b)。插圖是無(wú)肽的情況下ANS的熒光對(duì)照?qǐng)D。肽濃度為 0. 5毫克/毫升，而ANS濃度為10微摩爾/升。圖89說(shuō)明了肽-玫瑰樹(shù)堿復(fù)合物的形成。(a)玫瑰樹(shù)堿與不同濃度的三種肽形 成的復(fù)合物的照片，在純水中的玫瑰樹(shù)堿作為對(duì)照。玫瑰樹(shù)堿與不同濃度的EAK16-II (b)， EAK16-IV(C)和EHQ6-n(d)所形成的復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)化熒光光譜，插圖顯示低濃度肽與復(fù) 合物的光譜。圖90說(shuō)明了在水溶液中，玫瑰樹(shù)堿在三種肽EAK16-II，EAK16-IV和EHQ6-II溶 液中和缺乏肽條件下穩(wěn)定的最高懸浮度(百分比)。圖91是出了通過(guò)DLS0. 5毫克/毫升三種多肽EAKI6-II，EAKI6-IV和EFKI6-II 在純水中的粒度分布(a) ；0. 5毫克/毫升EAKI6-II和EAKI6-IV與玫瑰樹(shù)堿復(fù)合物在水溶 液中的粒度分布(b)。圖92是三種肽EAKI6-II，EAKI6-IV和ΕΠ(Ι6-ΙΙ在不同肽濃度下與玫瑰樹(shù)堿形成 復(fù)合物的掃描電鏡照片像。玫瑰樹(shù)堿晶體在純水中作為對(duì)照。圖93說(shuō)明了不同濃度的三種肽EAKI6-II，EAKI6-IV和ΕΠ(Ι6-ΙΙ與玫瑰樹(shù)堿的復(fù) 合物對(duì)Α549細(xì)胞(a)和MCF-7細(xì)胞(b)的毒性。未經(jīng)處理的細(xì)胞的存活度為1 (M為細(xì)胞 經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基處理)。溶劑的對(duì)照實(shí)驗(yàn)為，純水處理細(xì)胞(深綠色條)；藥物對(duì)照實(shí)驗(yàn)為玫瑰 樹(shù)堿僅溶于純水(而沒(méi)有肽)來(lái)處理細(xì)胞(淺綠色條)。藍(lán)條代表在沒(méi)有玫瑰樹(shù)堿而僅有 肽的條件下的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。圖94 (A)說(shuō)明了三種肽EAKI6-II，EAKI6-IV和ΕΠ(Ι6-ΙΙ在濃度為0. 5毫克/毫 升和不同濃度玫瑰樹(shù)堿的復(fù)合物對(duì)Α549細(xì)胞(a)和MCF-7細(xì)胞(b)的毒性；(B)為上述復(fù) 合物經(jīng)過(guò)系列稀釋后對(duì)細(xì)胞的毒性。圖95顯示了 EAKI6-II的質(zhì)譜圖。圖96顯示了 ofEAKI6_IV的質(zhì)譜圖。圖97顯示了 ΕΠ(Ι6-ΙΙ的質(zhì)譜圖。圖98說(shuō)明了 ΕΑΚΙ6-ΙΙ的高效液相色譜數(shù)據(jù)。肽的純度約為73%。圖99說(shuō)明了 EAKI6-IV的高效液相色譜數(shù)據(jù)。肽的純度約為83%。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及自組裝成各種納米結(jié)構(gòu)的肽。這些多肽的設(shè)計(jì)依據(jù)于每個(gè)氨基酸參與 氫鍵、靜電作用、疏水和范德華相互作用的能力。由此產(chǎn)生的自組裝納米結(jié)構(gòu)可以應(yīng)用于多 種技術(shù)或生物醫(yī)療功能，包含藥物遞送和溶解度，生物傳感器和生物燃料電池。在下面的說(shuō)明書(shū)中，詳載了許多具體的細(xì)節(jié)，進(jìn)而提供對(duì)該項(xiàng)發(fā)明更透徹的理解。 然而，在此情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以看到本發(fā)明可能具有實(shí)踐性但卻沒(méi)有具體的首 選特色。在下面的描述中，提到了本領(lǐng)域的某些術(shù)語(yǔ)，其中一些定義如下?！鞍被帷钡亩x是20種必需的氨基酸的任意種。這些包含那些天然存在的以及 非天然存在的，例如D-天然氨基酸，β和γ衍生物。按照標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)，氨基酸殘基序列可用三個(gè)字母或一個(gè)字母的代碼來(lái)命名，例如丙氨酸(Ala，Α)；精氨酸(Arg，R)的；天門冬酰 胺aSparigine(ASp，N)的；天門冬氨酸(天冬氨酸，D)，半胱氨酸(半胱氨酸，C)的；谷氨酰 胺(谷氨酰胺，Q)的；谷氨酸(谷氨酸，E)；甘氨酸(Gly，G)的；組氨酸(His，H)，異亮氨酸 (He, I)；亮氨酸(Leu，L)，賴氨酸(賴氨酸，L)，蛋氨酸(Met，Μ)；苯丙氨酸(丙氨酸，F(xiàn))； 脯氨酸(Pro，P)的；絲氨酸(Ser，S)的；蘇氨酸(蘇氨酸，T)的；色氨酸(Trp，W)，酪氨酸 (Tyr, Y)的；和纈氨酸(Val, V)。術(shù)語(yǔ)“肽”是指本文中所使用的氨基酸鏈。特別是，肽是由2至40個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“自組裝”所指的是在通常環(huán)境條件下原子、分子或多肽形成的 具有正規(guī)形狀和結(jié)構(gòu)。特別是，自組裝是指肽聚集成一個(gè)有序的結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“自組裝多肽”，是指本文中所使用的肽能與另一具有相同或不同的氨基酸序 列的肽非共價(jià)相互作用，進(jìn)而在近熱力學(xué)平衡條件下形成一個(gè)有序的結(jié)構(gòu)。本文中所使用術(shù)語(yǔ)“氫鍵”，是一種化學(xué)鍵，其中一個(gè)分子的氫原子被吸引到通常 是另一個(gè)分子的具有電負(fù)性的原子上，尤其是氮或氧原子。氫鍵發(fā)生于多肽上的氨基酸之 間，尤其是多肽骨架的氨基酸上的原子之間易形成氫鍵作用力。但是，氨基酸側(cè)鏈上的原子 形成的氫鍵更有助于穩(wěn)定和誘導(dǎo)肽組裝。短鏈肽的側(cè)鏈相互作用更為重要。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“ β鏈”，是指采用伸展構(gòu)象和涉及氫鍵的氨基酸的一個(gè)連續(xù) 展開(kāi)的結(jié)構(gòu)。這“β-折疊”這個(gè)術(shù)語(yǔ)是指可相互形成氫鍵的β鏈的聚集。β鏈間呈平行或反 平行排列，從而形成β-折疊(片層)。測(cè)定其平行或反平行構(gòu)象是基于肽從N至C端排列 的方向。平行排列是指所有肽都是從N到C端方向排列。反平行排列是指，交替肽是相反 的方向排列(即第一個(gè)肽是從N到C端排列，而相對(duì)的第二肽是從C至N端排列)。平行排 列可以包含肽平移造成的肽兩端彼此交錯(cuò)。至少肽的一半長(zhǎng)度涉及肽間相互作用力。在反 平行的排列中，多肽通常是排列成一條線來(lái)提供平齊的兩個(gè)端點(diǎn)。這是一個(gè)典型的終端到 終端互補(bǔ)肽。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“離子互補(bǔ)性”是指帶正負(fù)電荷的殘基交替排列這個(gè)特殊模 式的特征。典型的電荷分布是第一類(_+)；第二類型(一++)；第四類型(一一++++)，和重 復(fù)此類電荷分布或其組合的其它任意類型。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“疏水性的”是指一種物質(zhì)傾向于排斥水，或者是完全不能在 水中溶解。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“親水性的”，是指能很容易吸收水分并具有很強(qiáng)的易與水相 互作用的極性基團(tuán)的特性。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“兩親性的”是指一種物質(zhì)既有疏水性又有親水性。兩親性 肽包含極性、水溶性(親水性的)和非極性、不溶于水(疏水性的)的碳?xì)滏湴被幔@些 氨基酸排列成一個(gè)特定的序列，可讓肽分子有截然不同的親水區(qū)和疏水區(qū)。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“功能基團(tuán)”指的是一個(gè)額外的短肽序列，此序列可賦予肽某 些特殊生物活性，并能與其它分子/材料結(jié)合。功能基團(tuán)的例子包含分子和細(xì)胞識(shí)別序列， 穿透細(xì)胞膜的序列，和能與金屬離子結(jié)合的基序。功能性基團(tuán)授予多肽特定的功能，但他們 并不一定會(huì)促進(jìn)肽自組裝。
本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞靶向基團(tuán)”是指可以選擇性地與特定的細(xì)胞作用的短 肽序列。靶向基團(tuán)能夠結(jié)合到細(xì)胞表面，傾向于形成一對(duì)結(jié)合體，例如抗體或其部分片段 (如單鏈，F(xiàn)ab片段)，或一個(gè)受體配體。在另一優(yōu)選實(shí)施例，靶向基團(tuán)包含一個(gè)低分子量蛋 白質(zhì)，例如但不僅限于，溶菌酶。細(xì)胞靶向基團(tuán)不參與肽自組裝。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“納米結(jié)構(gòu)”是指各部分排列成具有納米尺寸的一種結(jié)構(gòu)。 納米結(jié)構(gòu)可以形成任何一維，二維，或三維空間的任何形狀，包含納米薄膜，納米纖維，納米 棒，納米線，納米纖維網(wǎng)絡(luò)，納米球，納米螺旋線及其幾種的混合物。具有納米構(gòu)造的表面具 有納米級(jí)的一維結(jié)構(gòu)，即物體的表面厚度只有為0. Inm到IOOnm之間。納米管具有納米尺 寸的兩個(gè)維數(shù)，即該管的直徑為0. 1至lOOnm，其長(zhǎng)度可能更大。最后，球形納米粒子在納米 尺寸上有三個(gè)維數(shù)，即粒子納米在每個(gè)空間維度上的尺寸為0. 1至100納米。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指由30或更少的核苷酸組成的一個(gè)分子。本 術(shù)語(yǔ)包含脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，修飾過(guò)的或未經(jīng)修飾的。核糖核酸可能 的形式為小核RNA (snRNA)，小RNA (miRNA)，核糖體RNA (rRNA)，信使核糖核酸(mRNA)，反義 RNA (antisense RNA)，短發(fā)夾RNA (shRNA)，小干擾RNA (siRNA)，和核酶。寡核苷酸可能是單 鏈或雙鏈。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“生物傳感器”，是指一個(gè)能夠檢測(cè)，記錄，并傳輸有關(guān)生理變 化或過(guò)程信息的器件。更詳細(xì)的說(shuō)，生物傳感器使用由分離出來(lái)的酶，免疫系統(tǒng)，組織，細(xì)胞 器或整個(gè)細(xì)胞介導(dǎo)的特定生化反應(yīng)來(lái)檢測(cè)化合物，通常是使用電，熱或光信號(hào)。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“燃料電池”是指一個(gè)在生物催化劑，酶，細(xì)胞或整個(gè)細(xì)胞有 機(jī)體存在條件下可將原料轉(zhuǎn)換成電力的設(shè)備。更詳細(xì)的說(shuō)，像自組裝多肽這樣的生物材料， 通過(guò)為酶固定化提供生物兼容性的環(huán)境來(lái)改善燃料底物和氧化劑與電極間的電子轉(zhuǎn)移來(lái) 參與生物燃料的制備。指本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“治療劑”是指任何用于治療一種疾病或適應(yīng)癥的化合物 或成分，包含，而不限于注，藥物，小蛋白分子和寡核苷酸。適當(dāng)?shù)闹委焺┌粌H限于， 包含抗癌藥物紫杉醇，玫瑰樹(shù)堿，喜樹(shù)堿，阿霉素和以阿霉素和寡核苷酸為基礎(chǔ)的試劑。定 義中包含疏水性和親水性藥劑。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定劑”是指那些可以放入肽-藥物復(fù)合物中以提高復(fù)合 物在體內(nèi)穩(wěn)定性的材料。在本領(lǐng)域中，一個(gè)穩(wěn)定劑的選擇需要避免與其它任意成分有害反 應(yīng)的相互作用，降低活性藥劑的溶解度。本發(fā)明使用的穩(wěn)定劑的實(shí)例包含甘油，聚乙二醇 (PEG)，丙二醇，脂肪酸，Labrasol (R)，Capmul MCM(R)，Captex200 (R)，Captex 300 (R)或其 混合物。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“藥物輔料”，是指作為一種藥物的有效成分載體的無(wú)效物 質(zhì)。不受限于此，藥物輔料可適當(dāng)從下面的一種或任何幾種物質(zhì)的組合選擇葡萄糖，山梨 醇，甘露醇，淀粉，糊精，麥芽糊精，乳糖，硬脂酸鎂，硬脂酸鈣，滑石粉，微晶纖維素，羥丙基 甲基纖維素和羥乙基。也可以使用其它合適的輔料。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“生物催化劑”，是指催化氧化/還原反應(yīng)的酶。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“電極”，是指可傳遞電子到還原/氧化反應(yīng)中心或從還原/ 氧化反應(yīng)中心傳遞電子的導(dǎo)電材料。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“電子轉(zhuǎn)移中間體”，是指一個(gè)可從電化學(xué)反應(yīng)中心到電極間幫助轉(zhuǎn)移電子一種分子。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“燃料來(lái)源”是指可以進(jìn)行氧化/還原反應(yīng)生成電流的材料?；诎被崤鋵?duì)特性設(shè)計(jì)的自組裝多肽可能用來(lái)形成多種多樣的納米結(jié)構(gòu)。本發(fā) 明通過(guò)一個(gè)氨基酸配對(duì)(AAP)的方法設(shè)計(jì)自組裝肽是基于氨基酸可形成彼此相互作用力 的能力，此作用力至少是下面作用力的一種離子互補(bǔ)性，氫鍵，疏水性和范德華相互作用 力(圖1)。以氨基酸配對(duì)為基礎(chǔ)的設(shè)計(jì)的多肽提供了可達(dá)到一定的立體化學(xué)和物理化學(xué)穩(wěn) 定性的互補(bǔ)作用力，產(chǎn)生的配對(duì)親和力和最小配對(duì)自由能。例如，天門冬酰胺-天門冬酰胺 (asn-asn或N-N)可形成一個(gè)氨基酸對(duì)，并可被采用到多肽序列中，這是因?yàn)樘扉T冬酰胺既 可作為質(zhì)子供體又可作為質(zhì)子受體來(lái)參與氫鍵相互作用。當(dāng)自組裝多肽彼此靠近，互補(bǔ)氨 基酸進(jìn)行配對(duì)，納米結(jié)構(gòu)就可形成，一般情況下形成反平行或平行式β "折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在20種必需的氨基酸中，有13種已被確定為能通過(guò)相應(yīng)的側(cè)鏈來(lái)形成氫鍵。這 些氨基酸可作為質(zhì)子受體的包含精氨酸，色氨酸，酪氨酸，賴氨酸，組氨酸，天門冬氨酸，蘇 氨酸，半胱氨酸，絲氨酸，天門冬酰胺，谷氨酸，蛋氨酸和谷氨酰胺。除蛋氨酸外，所有這些氨 基酸還可充當(dāng)質(zhì)子供體。根據(jù)質(zhì)子供體和質(zhì)子受體在氨基酸上的位置可確認(rèn)氨基酸結(jié)合 對(duì)。氨基酸結(jié)合對(duì)還可進(jìn)一步界定為易溶性和不易溶性。在3-位置可作為質(zhì)子受體，形成 氫鍵，并具有較高水溶性的氨基酸是天門冬氨酸和組氨酸。天門冬氨酸能夠與在3-位置的 質(zhì)子供體氨基酸絲氨酸結(jié)合形成氫鍵，而組氨酸能夠與蘇氨酸氫鍵結(jié)合。同樣，4-位置質(zhì)子 受體氨基酸色氨酸、組氨酸和天冬氨酸與4-位置質(zhì)子供體氨基酸谷氨酰胺酸氫鍵結(jié)合，而 精氨酸，谷氨酸與4-位置的質(zhì)子供體氨基酸天門冬酰胺氫鍵結(jié)合。5-位置質(zhì)子受體氨基 酸酪氨酸可與相應(yīng)的質(zhì)子供體氨基酸谷氨酸和精氨酸氫鍵結(jié)合，而賴氨酸可與谷氨酰胺， 色氨酸和組氨酸氫鍵結(jié)合。具有較低水溶性的氫鍵結(jié)合氨基酸對(duì)包含天門冬酰胺(3-位 置質(zhì)子受體)與蘇氨酸、絲氨酸或半胱氨酸；蛋氨酸(3-位置質(zhì)子受體)與半胱氨酸和絲氨 酸；4-位置質(zhì)子受體氨基酸谷氨酰胺與天冬酰胺；和5-位置質(zhì)子受體酪氨酸與谷氨酰胺或 色氨酸，如表-4所示。含有2至8個(gè)氨基酸長(zhǎng)度(1至4個(gè)氨基酸對(duì))可溶性較低的氫鍵氨基酸對(duì)的肽可 以被合成。典型的肽由以下氨基酸組成谷氨酰胺(Q)-天冬酰胺(N)或天冬酰胺(N)-絲 氨酸(S)氨基酸對(duì)。多肽的N端點(diǎn)可能會(huì)被乙酰保護(hù)，C端點(diǎn)可能被氨基保護(hù)。肽可能含 有不同數(shù)量的氨基酸，以及不同數(shù)量的連續(xù)氫鍵對(duì)。例如，我們可以合成含有單對(duì)氫鍵對(duì)的 多肽(例如QN，NS)的，還可以合成具有雙對(duì)氫鍵對(duì)的肽(例如QNQN合NSNS或QQNN)，還 可以合成含四對(duì)氫鍵對(duì)的肽(例如NSNSNSNS)。肽除了只含有可形成氫鍵對(duì)的氨基酸，肽還可以含能參與所有的離子配對(duì)，疏水 配對(duì)，和氫鍵配對(duì)的氨基酸。并且這樣的肽也可以被合成。疏水、親水性氨基酸殘基交替排 列有助于肽形成兩親性。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)納米結(jié)構(gòu)的具有氨基酸配對(duì)特性的 自組裝氨基酸肽的制備方法。該方法包含下列步驟設(shè)計(jì)鏈肽，其所含氨基酸與其互補(bǔ) 氨基酸至少能夠形成下列作用力的一種氫鍵，靜電相互作用，疏水相互作用和范德華作用 力；此類多肽鏈含有2至40個(gè)氨基酸，含有至少一個(gè)氨基酸對(duì)能夠形成至少一種下列作用 力，氫鍵，靜電相互作用，疏水相互作用，以及范德華作用力，并具有互補(bǔ)性氨基酸配對(duì)并立 體互補(bǔ)于第二個(gè)多肽。
傅里葉變換紅外光譜(FTIR)，圓二色譜(⑶)和硫磺素T(ThT)熒光光譜可用于分 析肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。紅外光譜可以有助于描述肽形成β-折疊的能力，同時(shí)ThT熒光分析可 以用來(lái)說(shuō)明肽聚集物是否含有豐富的β-折疊結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了 一種自我互補(bǔ)β _鏈肽具有交替氫鍵質(zhì)子供體氨 基酸片段和氫鍵質(zhì)子受體的氨基酸片段，可以自我組裝成納米結(jié)構(gòu)。此類多肽含有2至40 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。此類多肽至少含有一個(gè)質(zhì)子供體和一個(gè)質(zhì)子受體片段，每個(gè)片段至少含有 一個(gè)氨基酸。此種肽不是由交替的疏水性和親水氨基酸片段組成。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明中的β-鏈肽還可進(jìn)一步包含至少一個(gè)功能基團(tuán)，此功 能基團(tuán)位于肽的N端和C端的至少一個(gè)端點(diǎn)上。在一個(gè)實(shí)施例中，功能基團(tuán)可以是細(xì)胞靶 向基團(tuán)、金屬離子結(jié)合基序、或細(xì)胞膜穿透基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的氫鍵存在于肽上具有互補(bǔ)性的氨基酸對(duì)的側(cè)鏈之間。 在一個(gè)實(shí)施例中，互補(bǔ)肽組裝成一個(gè)平行構(gòu)象。在一個(gè)實(shí)施例中，互補(bǔ)肽組裝成反平行構(gòu) 象。多肽可通過(guò)端到端式或交錯(cuò)式自組裝排列。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的肽可以組裝成 交錯(cuò)的排列，其中有1至20個(gè)氨基酸與第二個(gè)多肽的氨基酸形成互補(bǔ)氫鍵。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的β _鏈肽上的氫鍵質(zhì)子供體氨基酸是選自下列氨基酸 組精氨酸，色氨酸，酪氨酸，賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，絲氨酸，天門冬 酰胺，谷氨酸和谷氨酰胺。在一個(gè)實(shí)施例中，β-鏈肽上的氫鍵質(zhì)子受體氨基酸是選自下 列氨基酸組精氨酸，色氨酸，酪氨酸，賴氨酸，組氨酸，天門冬氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，絲氨 酸，天門冬酰胺，谷氨酸，蛋氨酸，谷氨酰胺。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了自我互補(bǔ)鏈肽，包含至少一個(gè)氫鍵氨基酸對(duì)， 至少一個(gè)離子互補(bǔ)氨基酸對(duì)，至少一個(gè)疏水氨基酸對(duì)，并有4至40個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，可形成納 米結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施例中，這種肽符合下列結(jié)構(gòu)式(AwBxAyCz)nAaBb(V)其中，Α，Β和C均為氨基酸，是從下列組中選出，疏水氨基酸組，帶電氨基酸組和氫 鍵氨基酸組，并且Α，B和C是彼此不同的氨基酸；w，X，y和ζ是均為從1到5的整數(shù)，A和 B是一個(gè)從0到2的整數(shù)，并且η是一個(gè)從1到10整數(shù)。疏水氨基酸可適當(dāng)?shù)剡x自纈氨酸， 異亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，半胱氨酸，丙氨酸，酪氨酸，組氨酸，蘇氨酸， 絲氨酸，脯氨酸，甘氨酸，精氨酸和賴氨酸氨基酸組。帶電氨基酸可適當(dāng)?shù)剡x自組氨酸，精氨 酸，賴氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸氨基酸組。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明包含氨基酸序列，苯丙氨酸_谷氨酸_苯丙氨酸_谷氨 酰胺_苯丙氨酸_天門冬酰胺_苯丙氨酸_賴氨酸(Phe-Glu-Phe-Gln-Phe-Asn-Phe-Lys， AC8) (SEQ ID NO :6)。這項(xiàng)發(fā)明還包含這種肽自組裝形成的納米結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種自我互補(bǔ)鏈肽，具有下列結(jié)構(gòu)之一a) (AxByCz)wAz(I)，和b) (AxByCz)w(C' XB' yA' z)w (II)A, A' ,B,B'，C和C'，為可形成氫鍵的氨基酸，可以是質(zhì)子供體或質(zhì)子受體氨基 酸；X和y為從1到10的整數(shù)，；Z是從0到10的一個(gè)整數(shù)；W是從1至20的一個(gè)整數(shù)。A 可互補(bǔ)于A'，B可互補(bǔ)于B'，C可互補(bǔ)于C'。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明所提供的自我互補(bǔ)型鏈肽還可具有下列結(jié)構(gòu)之
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a)AxByCz- ；(III)，和b) AxByCz... C' XB' yA' z (IV).A, A' ,B, B'，C和C'是一個(gè)獨(dú)立氨基酸供體或受體，而且相同字母的氨基酸具 有互補(bǔ)性。這些氨基酸可從下列組中選出氫鍵供體氨基酸組，氫鍵受體氨基酸組，帶正電 的氨基酸組，帶負(fù)電荷的氨基酸組，可范德華相互作用的氨基酸組。A可互補(bǔ)作用于A'，B 可互補(bǔ)作用于B'，C可互補(bǔ)作用于C'。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種自我互補(bǔ)β-鏈肽，此β-鏈肽含有至少一個(gè) 氫鍵氨基酸對(duì)，至少一個(gè)離子互補(bǔ)氨基酸對(duì)，至少一個(gè)疏水氨基酸對(duì)，并且此β “鏈肽可形 成納米結(jié)構(gòu)。此種多肽含有4至40個(gè)氨基酸。本發(fā)明的自我互補(bǔ)β-鏈肽包含谷氨酰胺-天門冬酰胺(Gln-Asn)，谷氨酰胺-天 門冬酰胺-谷氨酰胺-天門冬酰胺(Gln-Asn-Gln-Asn，SEQ ID NO 1)，谷氨酰胺-谷氨酰 胺-天門冬酰胺-天門冬酰胺(Gln-Gln-Asn-Asn, SEQ ID NO :2)，天門冬酰胺-絲氨酸 (Asn-Ser)，天門冬酰胺_絲氨酸-天門冬酰胺_絲氨酸(Asn-Ser-Asn-Ser, SEQ ID NO 3)，天門冬酰胺-絲氨酸-天門冬酰胺_絲氨酸-天門冬酰胺(Asn-Ser-Asn-Ser-Asn，SEQ ID NO 4)和天門冬酰胺-絲氨酸-天門冬酰胺_絲氨酸_天門冬酰胺_絲氨酸_天門冬 酰胺-絲氨酸(Asn-Ser-Asn-Ser-Asn-Ser-Asn-Ser，SEQ ID NO :5)。這項(xiàng)發(fā)明還包含這些 多肽形成的納米結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的多肽可用于制備各種形式的納米結(jié)構(gòu)，包含納米纖維、納米纖維網(wǎng)絡(luò)、納 米管、納米線、納米球和納米螺旋線，以及這些結(jié)構(gòu)的組合。多肽在其臨界聚集濃度(CAC) 可組裝成與濃度相關(guān)的不同納米結(jié)構(gòu)。當(dāng)多肽濃度低于臨界聚集濃度時(shí)，肽可以形成一 個(gè)單層細(xì)小的原細(xì)纖維和多肽單體的混合物，而當(dāng)多肽濃度高于其臨界聚集濃度時(shí)，多 肽可能形成成熟的纖維和纖維束，或其它納米結(jié)構(gòu)。由肽聚集形成的納米結(jié)構(gòu)取決于肽 在溶液中的濃度，以及溶液的 pH(reviewed in Chen (2005) Colloids and Surfaces A Physiochem. Eng. Aspects 26 :3_24.)多肽的臨界聚集濃度可通過(guò)ThT熒光測(cè)定法，表面張 力測(cè)定法，ANS熒光分析法和穩(wěn)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種自組裝形成的納米結(jié)構(gòu)，此納米結(jié)構(gòu)是由符 合下列結(jié)構(gòu)式的一個(gè)肽聚集而形成a) (AxByCz)wI ；和b) (AxByCz)wAx II.A，B, C均由可提供質(zhì)子供體和受體而形成氫鍵的氨基酸組成；χ和y是從1到10 的一個(gè)整數(shù)，ζ是從0到10的一個(gè)整數(shù)；w是從1至20的一個(gè)整數(shù)。此類自組裝肽形成以 下的幾種納米結(jié)構(gòu)的一種納米纖維，納米線，納米薄膜和納米球。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種自組裝形成的納米結(jié)構(gòu)，此納米結(jié)構(gòu)是由符 合下列結(jié)構(gòu)式的肽聚集而形成(AwBxAyCz)nAaBb(V).A，B和C均為氨基酸，從下列組中選出，疏水氨基酸組，帶電氨基酸組和氫鍵氨基 酸組，并且A，B和C是彼此不同的氨基酸；w，X，y和ζ每個(gè)是從1到5的整數(shù)，A和B是一 個(gè)從0到2的整數(shù)，并且η是一個(gè)從1到10整數(shù)。此類自組裝多肽形成下列納米結(jié)構(gòu)的一種納米纖維，納米線，納米薄膜和納米球。本發(fā)明的多肽可用于可控釋放藥物遞送方面。在此之前，EAK16肽被證明可 用于包裹高度疏水性化合物芘，(圖 2，Keyes-Bag etal. (2004) J. Am. Chern. Soc. 126 7522-7532)。研究進(jìn)一步表明，芘對(duì)肽的比率導(dǎo)致不同的表面包覆(圖3)。目前本發(fā)明公 開(kāi)的肽可用于溶解疏水性治療藥物，如抗癌藥物玫瑰樹(shù)堿(玫瑰樹(shù)堿具有質(zhì)子化和非質(zhì)子 化的中性兩種形式)。此外，此類肽在藥物遞送工具方面有較好的應(yīng)用價(jià)值。被新設(shè)計(jì)的肽 溶解的中性玫瑰樹(shù)堿，在經(jīng)過(guò)水稀釋16倍后，在肽內(nèi)部被保護(hù)的仍然很好，并且具有較好 的穩(wěn)定性。該肽也可用于基因和寡核苷酸遞送的應(yīng)用。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)EAK 16-I,EFKI6-II 和EAK16-II可用于溶解疏水治療藥物、基因和寡核苷酸遞送的應(yīng)用。本發(fā)明的藥物組成成分可包含公開(kāi)的肽和任何適合的在本領(lǐng)域已知的賦形劑或 穩(wěn)定劑。進(jìn)一步的說(shuō)，本發(fā)明的治療劑和藥物組合物的給藥方式，不特別限制于在此領(lǐng)域已 知的合適的給藥方式，包含但不限于口服和靜脈注射。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了可給病人遞送治療劑的一個(gè)試劑盒，該試 劑盒包含藥物組合物，該組合物包含自組裝β-鏈肽與治療劑；一個(gè)或幾個(gè)電解質(zhì)，緩沖 液，給藥工具，可把各種成份混合到一起的容器，使用時(shí)制備藥品的說(shuō)明書(shū)，混合該組合物 和其它成分的說(shuō)明書(shū)，和將此組合物給予受試者的說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明的肽可在不同的表面上組裝，此表面可以是疏水性的也可以是親水性的。 已經(jīng)證明，β-淀粉樣肽(氨基酸1-42)能夠在不同的表面上組裝，這些表面包含云母(親 水性的)和高定向裂解石墨(疏水性的)(圖4 ；Kowalewski and Holtzman(1999)96 3688-3693)。β -淀粉樣聚集物的大小和形狀，以及它們形成的動(dòng)力學(xué)，均表現(xiàn)出依賴于表 面的物理化學(xué)性質(zhì)。兩親性肽可被種到帶電的親水性的表面，如云母，可進(jìn)一步延長(zhǎng)形成納 米纖維，此過(guò)程是濃度依賴的方式(圖5和6)。兩親性肽沉積到帶電表面的驅(qū)動(dòng)力主要是 靜電相互作用(“肽-表面相互作用”)。這樣，肽更容易將其兩端和“種子”對(duì)齊，以實(shí)現(xiàn)納 米纖維的增長(zhǎng)。納米纖維的增長(zhǎng)可接下來(lái)通過(guò)調(diào)控溶液的PH值來(lái)對(duì)照，其原理如圖7所示。 同樣的肽也可種在一個(gè)疏水表面上，如高定向熱解石墨表面，并組裝成不同的納米結(jié)構(gòu)。例 如，ΕΑΚ16肽彼此排列成60°和120°角度。因此，本發(fā)明的肽，可形成特殊納米結(jié)構(gòu)，此納 米結(jié)構(gòu)取決于其所種的表面的性質(zhì)。肽的表面改性會(huì)導(dǎo)致表面潤(rùn)濕性的變化。肽修飾的表 面，可用于生物分子傳感應(yīng)用。肽可結(jié)合生物分子，如酶，進(jìn)而用于酶底物傳感，并將生物分 子固定在表面上。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了 一種燃料電池。在本發(fā)明的肽具有在不同的表面上組裝而制作生物活性電極的能力，使其在生物 燃料電池方面有用。生物燃料電池是使用生物催化劑，通過(guò)電化學(xué)方法，從燃料來(lái)源生產(chǎn)電 的一種裝置。本發(fā)明的肽能固定在電極上，從而用來(lái)進(jìn)一步固定生物傳感分子如酶?？梢?添加酶底物以驅(qū)動(dòng)催化反應(yīng)。這種生物燃料電池具有較好的存儲(chǔ)和操作穩(wěn)定性。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種鏈肽在鑒定蛋白質(zhì)聚集疾病的抑 制劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明的肽可用于產(chǎn)生研究蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病的模型，如老年癡呆癥和朊病毒疾 病。本發(fā)明的肽與淀粉樣肽(1-42氨基酸)相類似，可被接種到各種表面上，從而研究 其組裝的機(jī)理以及抑制其組裝的方法。
本發(fā)明的多肽可應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)應(yīng)用。分子動(dòng)力學(xué)模擬可以用來(lái) 篩選潛在的具有互補(bǔ)性，可以相互作用的氨基酸對(duì)。此信息對(duì)肽文庫(kù)的發(fā)展是非常有用的。 具體應(yīng)用包含用于生產(chǎn)蛋白/多肽和DNA陣列的高通量的篩選和鑒定研究。肽可用于修飾 陣列表面，其功能性殘基可用于固定DNA和蛋白質(zhì)分子到陣列上。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)目標(biāo)生物分子的方法。該方法包 含下列步驟肽自組裝從鏈肽形成納米結(jié)構(gòu)；肽吸附到電極表面，允許電子轉(zhuǎn)移和生物 催化劑的固定；偶聯(lián)一個(gè)可提供肽包裹的納米結(jié)構(gòu)表面可測(cè)信號(hào)的“報(bào)道”分子；提供目標(biāo) 生物分子。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，但不僅限于此，生物分子可選自蛋白質(zhì)，核酸，碳水化合 物和病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，目標(biāo)生物分子是葡萄糖。本發(fā)明的肽，可用于各種涂層應(yīng)用，包含防止生物附著的涂層；提高生物兼容性 的表面涂層；和功能化色譜柱的涂層。肽還可用于修飾表面涂層，并為蛋白質(zhì)/酶的固定提 供一個(gè)生物兼容性的環(huán)境。肽的序列決定其二級(jí)結(jié)構(gòu)和自組裝肽聚集的納米結(jié)構(gòu)，并影響其在藥物遞送、化 學(xué)傳感、生物燃料電池和蛋白質(zhì)聚集疾病研究模型方面的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在以下實(shí)施例中得以進(jìn)一步的說(shuō)明。下面提到的例子和它們具體細(xì) 節(jié)均僅為說(shuō)明本發(fā)明，不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的權(quán)利要求。實(shí)施例1 氫鍵氨基酸配對(duì)(AAP)表1列出可形成氫鍵的氨基酸，以及其可作為質(zhì)子供體和質(zhì)子受體的原子位置。 能夠配對(duì)的氨基酸列于表2?？扇艿暮洼^不可溶的氫鍵氨基酸配對(duì)分別列于表3和4。當(dāng) 氨基酸帶有電荷時(shí)，排斥力的存在會(huì)抑制氫鍵配對(duì)(見(jiàn)表3)。因此，不帶電荷的氨基酸對(duì)能 形成氫鍵是特別興趣的。表1.形成氫鍵的氨基酸及其氨基酸中可作為受體和供體的原子位置。
權(quán)利要求
一種自互補(bǔ)的β鏈肽，包含交替的氫鍵質(zhì)子供體氨基酸片段和氫鍵質(zhì)子受體氨基酸片段，并且具有至少二至四十個(gè)氫鍵氨基酸的長(zhǎng)度以形成納米結(jié)構(gòu)，其中a)所述氫鍵質(zhì)子供體氨基酸片斷由至少一個(gè)氨基酸組成；b)所述氫鍵質(zhì)子受體氨基酸片斷由至少一個(gè)氨基酸組成；c)所述β 鏈肽包含至少一個(gè)質(zhì)子供體片斷和至少一個(gè)質(zhì)子受體片斷；并且d)所述肽不是由交替的疏水性和親水性氨基酸片段組成，其中，自互補(bǔ)的β 鏈肽組裝成所述納米結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自互補(bǔ)鏈肽，其中，氫鍵形成于互補(bǔ)性氨基酸的側(cè)鏈之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自互補(bǔ)鏈肽，其中，自互補(bǔ)的肽以一種平行或反平行的構(gòu)象組裝。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的自互補(bǔ)β-鏈肽，其中，所述肽可進(jìn)一步以一種端點(diǎn)對(duì)端點(diǎn)或 交錯(cuò)肽排列的方式組裝。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的自互補(bǔ)鏈肽，其中，所述肽以交錯(cuò)排列的方式組裝，并且 在所述肽中有至少1個(gè)到至少20個(gè)氨基酸與第二個(gè)肽的互補(bǔ)氨基酸形成氫鍵。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自互補(bǔ)鏈肽，其中，所述氫鍵質(zhì)子供體氨基酸選自下列氨 基酸Arg、Trpλ TyrΛ LysΛ His、Asp、Thr、CysΛ Ser、Asn、Glu 和 Gin。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自互補(bǔ)鏈肽，其中，所述氫鍵質(zhì)子受體氨基酸選自下列氨 基酸Arg、Trp> Tyr> Lys> His、Asp、Thr、Cys> Ser、Asn、Glu、Met 禾口 Gin。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自互補(bǔ)β-鏈肽，其中，所述納米結(jié)構(gòu)選自納米纖維、納米管、 納米平面和納米球。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自互補(bǔ)鏈肽，其中，至少一個(gè)氫鍵氨基酸是不帶電荷的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自互補(bǔ)鏈肽，具有選自以下的結(jié)構(gòu)a)(AxByCz)人(I)；和b)(AxByCz)w(C' XB' yA' z)w(II)其中，A、A'、B、B'、(和('每個(gè)均選自質(zhì)子供體和質(zhì)子受體； χ和y每個(gè)獨(dú)立地是1到10的整數(shù)； ζ是0到10整數(shù)；并且 w是1到20的整數(shù)；其中A與A'互補(bǔ)，B與B'互補(bǔ)，C與C'互補(bǔ)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自互補(bǔ)鏈肽，具有選自以下的結(jié)構(gòu)a)AxByCz-· · ；(III)，和b)AxByCz. . . Cz' By' Ax'(IV)，A、A'、B、B'、(和('每個(gè)獨(dú)立地是供體氨基酸或受體氨基酸，而且每個(gè)自互補(bǔ)，選 自氫鍵供體氨基酸、氫鍵受體氨基酸、帶正電荷的氨基酸、帶負(fù)電荷的氨基酸、和范德華相 互作用的氨基酸，并且其中，A與A'互補(bǔ)，B與B'互補(bǔ)，C與C'互補(bǔ)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自互補(bǔ)β_鏈肽，選自以下序列=Gln-Asru Gln-Asn-Gln-Asn (SEQ ID NO1), Gln-Gln-Asn-Asn(SEQ ID NO 2)、Asn-Ser、Asn-Ser-Asn-Ser(SEQ ID NO 3),Asn-Ser-Asn-Ser-Asn(SEQ ID NO 4)和 Asn—Ser—Asn—S er-Asn-Ser-Asn-Ser(SEQ ID NO :5)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自互補(bǔ)鏈肽，進(jìn)一步在所述肽的N端和C端中的至少一 個(gè)含有功能基團(tuán)，其中，所述功能基團(tuán)選自細(xì)胞靶向部分、金屬離子結(jié)合基序、和細(xì)胞膜穿 透部分。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述肽，其中，所述氨基酸選自天然氨基酸，D型氨基酸，β-氨基 酸衍生物和Y氨基酸衍生物。
15.一種自互補(bǔ)β-鏈肽，包含至少一個(gè)氫鍵氨基酸對(duì)，至少一個(gè)離子互補(bǔ)氨基酸對(duì)， 和至少一個(gè)疏水氨基酸對(duì)，并具有4至40個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度以形成納米結(jié)構(gòu)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的自互補(bǔ)β-鏈肽，其中，所述自互補(bǔ)肽以一個(gè)平行或反平行 的構(gòu)象組裝。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述肽，具有以下通式 (AwBxAyCz)人Bb (V)其中，Α、Β和C每個(gè)均是選自疏水氨基酸、帶電荷的氨基酸、和氫鍵氨基酸，并且Α、Β和 C彼此不同；w、χ、y和ζ每個(gè)獨(dú)立地是從1到5的整數(shù)； a和b每個(gè)獨(dú)立地是從0到2的整數(shù)；并且 η是從1到10整數(shù)。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述肽，其中，所述疏水氨基酸選自Val、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、 Cys、Ala、Tyr> His、Thr> Ser> Pro、Gly、Arg 禾口 Lys0
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述肽，其中，所述帶電荷的氨基酸選自HiS、Arg、Lys、Asp和Glu0
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述肽，其中，所述氫鍵氨基酸選自質(zhì)子供體和質(zhì)子受體。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述肽，進(jìn)一步包含至少一個(gè)π鍵配對(duì)氨基酸，選自Tyr、Phe和Trp0
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述肽，由以下氨基酸序列組成=Phe-Glu-Phe-Gln-Phe-Asn-Phe -Lys(AC8)(SEQ ID NO :6)。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述肽，其中氨基酸A、B和C為獨(dú)立的自互補(bǔ)氨基酸和獨(dú)立的與 非自身氨基酸互補(bǔ)的氨基酸，并且所述肽自組裝成平行的β _折疊。
24.根據(jù)權(quán)利要求15所述肽，其中，Α、Β和C每個(gè)分別與第二個(gè)肽中的氨基酸互補(bǔ)，但 不是分別與Α，B和C互補(bǔ)，并且所述肽自組裝成反平行β _折疊。
25.一種自組裝的納米結(jié)構(gòu)，由具有選自以下結(jié)構(gòu)的肽的聚集單位組成a)(AxByCz)wI ；和b)(AxByCz)wAxII其中，A、B和C每個(gè)均為選自質(zhì)子供體和質(zhì)子受體的氫鍵氨基酸； χ和y每個(gè)獨(dú)立地是從1到10的整數(shù)； Z是從0到10的整數(shù)；并且 w是從1到20的整數(shù)，其中，納米結(jié)構(gòu)選自納米纖維、納米線、納米薄膜和納米球。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的自組裝納米結(jié)構(gòu)，其中所述肽選自=Gln-Asru Gln-Asn-Gln-Asn(SEQ ID NO 1) , Gln-Gln-Asn-Asn(SEQ ID NO :2)、Asn-Ser、 Asn-Ser-Asn-Ser(SEQ ID NO 3),Asn-Ser-Asn-Ser-Asn(SEQ ID NO 4)和 Asn—Ser—Asn—S er-Asn-Ser-Asn-Ser(SEQ ID NO :5)。
27.一種自組裝納米結(jié)構(gòu)，由具有通式(V)的肽的聚集單位組成 (AwBxAyCz)人Bb(V)其中，A、B和C每個(gè)均選自疏水氨基酸、帶電荷的氨基酸和氫鍵氨基酸，并且A、B和C 是彼此不同的；w、χ、y和ζ每個(gè)獨(dú)立地是從1到5的整數(shù)； a和b每個(gè)獨(dú)立地是從0到2的整數(shù)；并且 η是從1到10的整數(shù)，其中，所述納米結(jié)構(gòu)選自納米纖維、納米線、納米薄膜和納米球。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的自組裝納米結(jié)構(gòu)，其中，所述肽是Phe-Glu-Phe-Gln-Phe-A sn-Phe-Lys(SEQ ID NO :6)。
29.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求15所述肽和治療劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物組合物，進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物組合物，進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其中，所述肽是Phe-Glu-Phe-Gln-Phe-Asn-P he-Lys(SEQ ID NO 6)。
33.根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其中，所述治療劑選自藥物、小蛋白分子、寡 核苷酸、siRNA, miRNA 和 shRNA。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其中，所述治療劑是疏水性藥物。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的藥物組合物，其中，所述治療劑為選自紫杉醇、玫瑰樹(shù)堿、 喜樹(shù)堿、阿霉素和亞德里亞霉素的抗癌劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其中，所述治療劑是親水性的。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其中，所述治療劑是寡核苷酸。
38.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1所述肽和治療劑。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的藥物組合物，進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的藥物組合物，進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑。
41.根據(jù)權(quán)利要求38所述的藥物組合物，其中所述肽選自=Gln-Asru Gln-Asn-Gln-Asn(SEQ ID NO 1) , Gln-Gln-Asn-Asn(SEQ ID NO :2)、Asn-Ser、 Asn-Ser-Asn-Ser(SEQ ID NO 3),Asn-Ser-Asn-Ser-Asn(SEQ ID NO 4)和 Asn—Ser—Asn—S er-Asn-Ser-Asn-Ser(SEQ ID NO :5)。
42.一種給病人遞送材料的試劑盒，包含權(quán)利要求27和36中任一項(xiàng)所述的藥物組合物；和一種或多種電解質(zhì)、緩沖液、遞送裝置、適合把一種或多種其它藥劑混合到一起的容 器；和為使用配制所述藥物組合物的說(shuō)明書(shū)，混合所述組合物和其它藥劑的說(shuō)明書(shū)，和將所 述組合物給予受試者的說(shuō)明書(shū)。
43.一種制備形成納米結(jié)構(gòu)的具有氨基酸配對(duì)性質(zhì)的自組裝肽的方法，包含a)設(shè)計(jì)一種肽，所述肽由能夠與互補(bǔ)氨基酸形成氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和 范德華力相互作用中的至少一種的氨基酸組成；并且b)產(chǎn)生2至40個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽，所述肽由能夠形成氫鍵、靜電相互作用、疏水性相互 作用和范德華力相互作用中的至少一種的氨基酸對(duì)組成，并與第二個(gè)肽形成互補(bǔ)的氨基酸 配對(duì)和互補(bǔ)的立體化學(xué)。
44.根據(jù)權(quán)利要求15所述肽在給細(xì)胞遞送治療劑中的應(yīng)用。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的應(yīng)用，其中所述治療劑是疏水性的。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的應(yīng)用，其中所述治療劑是親水性的。
47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的應(yīng)用，其中所述治療劑是寡核苷酸。
48.一種檢測(cè)目標(biāo)生物分子的方法，包含a)由權(quán)利要求1所述肽自組裝形成納米結(jié)構(gòu)；b)將所述肽吸附到電極表面，以允許電子轉(zhuǎn)移和生物催化劑的固定；c)偶聯(lián)報(bào)告分子，所述報(bào)告分子能夠給所述肽修飾的納米結(jié)構(gòu)表面提供可檢測(cè)的信 號(hào)；以及d)提供所述目標(biāo)生物分子。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述肽選自EAKI6-I，EFK16-II和EAK16-II。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述目標(biāo)生物分子選自蛋白質(zhì)，核酸，碳水化合 物和病毒。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述目標(biāo)生物分子是葡萄糖。
52.一種檢測(cè)目標(biāo)生物分子的方法，包含a)由權(quán)利要求15所述肽自組裝形成納米結(jié)構(gòu)；b)將所述肽吸附到電極表面，以允許電子轉(zhuǎn)移和生物催化劑的固定；c)偶聯(lián)報(bào)告分子，所述報(bào)告分子能夠給所述肽修飾的納米結(jié)構(gòu)表面提供可檢測(cè)的信 號(hào)；以及d)提供所述目標(biāo)生物分子。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述肽是Phe-Glu-Phe-Gln-Phe-Arg-Phe-Lys。
54.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述目標(biāo)生物分子選自蛋白質(zhì)、核酸、碳水化 合物和病毒。
55.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述目標(biāo)生物分子是葡萄糖。
56.根據(jù)權(quán)利要求1所述肽在形成生物燃料電池中的應(yīng)用。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中，所述的生物燃料電池進(jìn)一步包含電極、生物催 化劑、燃料源和膜。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的應(yīng)用，其中，所述肽選自EAKI6-II和ΕΠ(Ι6-ΙΙ。
59.根據(jù)權(quán)利要求15所述肽在形成生物燃料電池中的應(yīng)用。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的應(yīng)用，其中，所述生物燃料電池進(jìn)一步包含電極、生物催化 劑、燃料源和隔膜。
61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的應(yīng)用，其中，所述肽是Phe-Glu-Phe-Gln-Phe-Arg-Phe-Lys。
62.根據(jù)權(quán)利要求1所述肽在鑒定蛋白質(zhì)聚集疾病的抑制劑中的應(yīng)用。
63.根據(jù)權(quán)利要求1所述肽在改變表面的潤(rùn)濕性中的應(yīng)用。
64.根據(jù)權(quán)利要求1所述肽在改變表面的生物相容性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于形成納米結(jié)構(gòu)的自組裝β-肽鏈，包含該肽的組合物和形成該肽的方法。此外，本發(fā)明還涉及這些肽在藥物遞送和增加藥物的溶解度、生物分子檢測(cè)及生物催化應(yīng)用中的用途。本發(fā)明的多肽還可用于蛋白質(zhì)聚集疾病的模型中。
文檔編號(hào)H01M8/22GK101939329SQ200880114082
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月30日
發(fā)明者馮善宇, 楊紅, 陳璞 申請(qǐng)人:滑鐵盧大學(xué)