本發(fā)明涉及一種野外分離中華散尾鬼筆子實體的方法,尤其涉及一種利用自制便攜式超凈工作臺組織分離中華散尾鬼筆子實體的方法。
技術(shù)背景
中華散尾鬼筆(Lysurus mokusin)屬于籠頭菌科(Clathraceae),散尾鬼筆屬(Phallus)。中華散尾鬼筆菌頭部細(xì)長,呈棱柱形,頭部有4-5個爪狀裂片,紅色,初期裂片相互連接一起,后期從頂部彼此分離,靠內(nèi)側(cè)面產(chǎn)生暗褐色孢體粘液,具臭味。菌柄淺粉至淺肉色,具4-5條縱行凹槽,松軟呈海綿狀。菌托白色。進來有關(guān)于誤食中華散尾鬼筆中毒的報道。因此,有學(xué)者推斷其是否可以在森防中作生物農(nóng)藥。為了進行深入研究,需要對中華散尾鬼筆進行人工培養(yǎng),但是,目前沒有針對其進行分離的方法。
普遍使用的分離大型真菌子實體的方法為組織分離法。常規(guī)的組織分離方法是:野外采集的大型真菌子實體作為分離材料,在超凈工作臺中,用無菌水沖洗后,用75%的酒精溶液表面消毒。取消毒過的刀片縱切,挑取菌蓋與菌柄交界處的一小塊組織(火柴頭大小),接種到PDA培養(yǎng)基上3-5天后,接種塊上產(chǎn)生白色絨毛狀菌絲,即為組織分離得到的菌種。但是,在野外,因為條件的限制,從采集地將新鮮子實體運回實驗室內(nèi),在采集后的8小時內(nèi)在超凈工作臺中進行分離,會受路途、天氣、蟲蝕、腐爛等因素影響子實體的新鮮度,給分離造成困難。因此建議野外采集,就地分離。
中華散尾鬼筆沒有菌蓋,子實體內(nèi)部為網(wǎng)狀中空結(jié)構(gòu),子實體柔軟,不耐運輸和保存。所以不能使用上述方法分離。即使需要就地分離,也會因為其特殊的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),需要精細(xì)的操作和消耗較長的時間而容易被分布廣泛的雜菌污染,導(dǎo)致分離成功率低??朔巴夥蛛x中華散尾鬼筆子實體時的上述困難,需要發(fā)明特殊的器材和分離方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的技術(shù)方案采用了自制便攜式超凈工作臺組織分離中華散尾鬼筆子實體的方法,并且分離時取頭部和菌柄交界處的內(nèi)層網(wǎng)狀組織的方法。采用本發(fā)明能夠提高中華散尾鬼筆子實體野外分離的成功率。
本發(fā)明的技術(shù)方案是:利用自制便攜式超凈工作臺就地采集,就地分離,分離時取頭部和菌柄交界處的內(nèi)層網(wǎng)狀組織。
包括以下步驟:
1.培養(yǎng)基的配制,配制PDA斜面培養(yǎng)基,在121℃下高壓蒸汽滅菌20min備用。
2.將自制便攜式超凈工作臺用75%的酒精溶液擦拭消毒。
3.將手術(shù)刀、鑷子、火柴、記號筆、PDA培養(yǎng)基分別用75%的酒精溶液擦拭消毒后快放入自制便攜式超凈工作臺,夾在C型管卡上,卡住卡扣密封。
4.夏末秋初攜帶自制便攜式超凈工作臺進入林場,在落葉松林下地被物上采集中華散尾鬼筆進行分離。
5.將采集到的中華散尾鬼筆子實體用浸有0.1%的升汞的棉球擦拭消毒,然后用錫紙包住,放入自制便攜式超凈工作臺,卡住卡扣密封,打開紫外燈滅菌20min。關(guān)閉紫外燈,打開節(jié)能照明燈。雙手從手套中伸入自制便攜式超凈工作臺,點燃酒精盒,將手術(shù)刀從C型管卡上取下,在酒精盒火焰中來回幾次,后橫向切開子實體的頭部與菌柄交界處,然后取下鑷子在酒精盒火焰中來回幾次,后撕取一小塊0.5cm左右的內(nèi)層網(wǎng)狀組織,在火焰附近接入PDA培養(yǎng)基,然后將試管管口和棉塞在火焰中來回幾次,塞好棉塞,用記號筆在試管外壁標(biāo)記。
6.把用過的手術(shù)刀和鑷子在酒精盒火焰中來回幾次,同記號筆和火柴一起,夾回C型管卡上。
7.分離完成后,熄滅酒精盒,打開自制便攜式超凈工作臺,把接種好的PDA培養(yǎng)基和殘留的中華散尾鬼筆子實體取出,用75%的酒精溶液擦拭自制便攜式超凈工作臺,卡住卡扣密封,以備下一次分離操作 使用。
8.接種好的培養(yǎng)基在25℃下避光培養(yǎng)15d至長滿培養(yǎng)皿。
本發(fā)明與已有發(fā)明相比,具有以下優(yōu)點:
1.分離時取頭部與菌柄交界處的內(nèi)層網(wǎng)狀組織,成功率更高,分離出的菌種菌絲體生長更快,菌絲體更致密蓬松。
2.自制便攜式超凈工作臺體積小,輕便,可移動,采集中華散尾鬼筆子實體過程中可全程攜帶。
3.自制便攜式超凈工作臺前壁,側(cè)壁和上壁的前半部分的材質(zhì)為有機玻璃(2),操作時,視野開闊,且有機玻璃質(zhì)量輕,減輕了自制便攜式超凈工作臺的重量。
4.自制便攜式超凈工作臺的前壁可以打開,方便放入材料和工具,也方便取出殘留材料和接種好的PDA培養(yǎng)基。
5.自制便攜式超凈工作臺帶有卡扣(6)和硅膠密封條(3),可以密封。
6.雙手可以從手套(4)中伸入,防止污染。
7.手套采用硅膠材質(zhì),耐高溫,并且能提高操作靈敏度。
8.自制便攜式超凈工作臺的內(nèi)壁有C型管卡(9),可以固定放入自制便攜式超凈工作臺的工具和培養(yǎng)基,攜帶過程中不會互相磕碰損壞工具和培養(yǎng)基。
9.自制便攜式超凈工作臺帶有酒精盒(12),使分離操作可以在火焰附近進行,并且可以在火焰中對工具進行滅菌,避免了交叉污染。
10.自制便攜式超凈工作臺中的酒精盒(12)中裝的是固體酒精,沒有流動性,方便攜帶。
11.自制便攜式超凈工作臺帶有鋰聚合物電池(10),電量可供一天野外操作。
12.自制便攜式超凈工作臺帶紫外燈(8),可以在進行分離操作前對便攜式超凈工作臺內(nèi)部環(huán)境進行滅菌。
13.自制便攜式超凈工作臺帶有節(jié)能照明燈(7),即使在昏暗條件下也可以進行組織分離操作。
14.本發(fā)明可避免分離過程中雜菌的污染,提高野外組織分離的成功率。
15.本發(fā)明也可用于野外分離其他大型真菌子實體。
附圖說明
圖1為便攜式超凈工作臺的剖面示意圖
(1)鉸鏈 (2)有機玻璃 (3)硅膠密封條 (4)手套 (5)把手 (6)卡扣 (7)LED照明燈 (8)紫外燈 (9)C型管卡 (10)鋰聚合物電池 (11)酒精盒蓋 (12)酒精盒 (13)鋁合金板材
圖2為便攜式超凈工作臺的透視示意圖
具體實施方式
具體實施方式一:如圖1所示,野外采集子實體前,將自制便攜式超凈工作臺用75%的酒精擦拭消毒,然后將手術(shù)刀、火柴、鑷子、記號筆分別用75%的酒精溶液擦拭消毒,放入便攜式超凈工作臺,夾在C型管卡(9)上,卡住卡扣(6)密封。采集到中華散尾鬼筆后,在自制便攜式超凈工作臺外用浸有0.1%的升汞的棉球分別擦拭子實體消毒,然后用錫紙包住,放入自制便攜式超凈工作臺,卡住卡扣(6)密封,打開紫外燈(8)滅菌20min。關(guān)閉紫外燈(8),打開節(jié)能照明燈(7)。雙手從手套(4)中伸入自制便攜式超凈工作臺,點燃酒精盒(12),將手術(shù)刀從C型管卡(9)上取下,在酒精盒火焰中來回幾次,后橫向分為切開頭部與菌柄交界處的子實體,然后取下鑷子在酒精盒火焰中來回幾次,后撕取一小塊內(nèi)層網(wǎng)狀組織,在火焰附近接入PDA培養(yǎng)基,然后將試管管口和棉塞在火焰中來回幾次,塞好棉塞,用記號筆在試管外壁標(biāo)記。把用過的手術(shù)刀和鑷子在酒精盒火焰中來回幾次,同記號筆和火柴一起,夾回C型管卡(9)上。依次用上述方法組織分離采集到的中華散尾鬼筆子實體后,熄滅酒精盒(12),打開自制便攜式超凈工作臺,把接種好的真菌培養(yǎng)基和殘留的中華散尾鬼筆子實體取出,用75%的酒精溶液擦拭自制便攜式超凈工作臺,卡住卡扣(6)密封,以備下一次分離操作使用。
具體實施方式二:將采集到的中華散尾鬼筆子實體就地采集,就地分離。采集到的子實體用無菌水沖洗,然后點燃酒精燈,在火焰附近徒手橫向撕開子實體的頭部與菌柄交界處,將鑷子在火焰上來回幾次,然后撕取一小塊0.5cm左右的內(nèi)層網(wǎng)狀組織,接種到PDA培養(yǎng)基上。與用具體實施方式一中的方法在自制便攜式超凈工作臺分離接種的培養(yǎng)基一起在25℃下避光培養(yǎng)15d。每種方法分離5管,每天觀察,記錄污染狀況,結(jié)果見表1。
表1不同分離方法的污染率
在自制便攜式超凈工作臺進行野外分離可以提高分離的成功率。
具體實施方式三:用具體實施方式一中的方法,在分離時分別取頭部,頭部與菌柄交界處和菌柄基部的一小塊內(nèi)層組織接種到PDA培養(yǎng)基上。待長出白色絨毛狀菌絲后,在實驗室內(nèi)分別挑出菌絲接種到PDA培養(yǎng)皿中,做好標(biāo)記。待培養(yǎng)皿中的菌絲體長出一部分后,接種到新的PDA培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)15天至滿皿。每24小時測量并記錄菌絲直徑和生長狀態(tài),結(jié)果見表2。
表2取樣部位與菌絲體生長速率的關(guān)系
取菌柄基部進行分離時和取另兩個部位時菌絲生長速率具有顯著型差異,且菌絲體稀疏扁塌;取頭部和取頭部與菌柄交界處進行分離時,菌絲生長速率無明顯差異;通過觀察菌絲體形態(tài),取頭部進行分離的菌絲體稀疏扁塌,而取頭部與菌柄交界處進行分離的菌絲體致密蓬松。由此可以得出,分離中華散尾鬼筆時取頭部與菌柄交界處的組織會達到更好的分離效果。
具體實施方式四:用具體實施方式一中的方法,待長出白色絨毛狀菌絲后,在實驗室內(nèi)分別挑出菌絲接種到PDA培養(yǎng)皿中心,分別在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃下避光培養(yǎng)至滿皿,每天觀察記錄菌絲直徑,結(jié)果見表4。
表4培養(yǎng)溫度與菌絲生長速率的關(guān)系
在25℃下避光培養(yǎng)時菌絲平均生長速率最大,且菌絲體形態(tài)好;在15℃、20℃、30℃下避光培養(yǎng)時菌絲平均生長速率無明顯差異;在10℃下避光培養(yǎng)要好于在35℃下閉關(guān)培養(yǎng)。所以,在25℃下避光培養(yǎng)更有利于菌絲生長。
具體實施方式五:用具體實施方式一中的方法,待長出白色絨毛狀菌絲后,在實驗室內(nèi)分別挑出菌絲接種到PDA培養(yǎng)皿中心,分別避光,全光,半光半暗在25℃下培養(yǎng)至滿皿,每天觀察記錄菌絲直徑,結(jié)果見表5。
表5光照與菌絲生長速率的關(guān)系
全光條件下平均生長速率與另兩種光照條件下存在顯著差異,且菌絲體稀疏扁塌;避光條件與半光半暗條件下平均生長速率無顯著差異;半光半暗條件下菌絲體形態(tài)沒有避光條件下茂密蓬松。所以,避光培養(yǎng)更有利于菌絲生長。