專利名稱：新型肽及其的治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型肽及其在治療中的應(yīng)用。
主動抗細(xì)胞因子免疫是由Zagury等人于1990年開發(fā)，特別是以專利申請WO92/22577為基礎(chǔ)的一種主動免疫治療策略。
此觀念被幾個科研組采用，并在國際科學(xué)雜志上發(fā)表文章，包括針對以下蛋白質(zhì)的主動免疫經(jīng)過戊二醛處理而多聚化的完整IFN-α蛋白(Gringeri等人，JAIDS 1999；20358-70)、由天然TNF-α蛋白和卵清蛋白T表位組成的嵌合TNF-α蛋白(Dalum等人，NatureBiotechnology，1999；17666-69)、與KLH偶聯(lián)的完整IL9(Richard等人，PNAS，2000；97767-72)或者完整IL5與破傷風(fēng)毒素T表位組成的嵌合蛋白(Hertz等人，J Immunol，2001；1673792-99)。
這些方法確證了自體抗細(xì)胞因子免疫的可行性，但是這些少數(shù)的成功掩蓋了由某些作者描述的不成功試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)胞因子不能獲得足夠的保護(hù)性和臨床有效的抗體，而且以在一種方式中有效的形式制備的同一細(xì)胞因子，在另一種方式是無效的(Richard等人，PNAS，2000；97767-72)。
為了試圖解釋這種現(xiàn)象，專利申請者觀察到至今所有作者使用的都是完整的細(xì)胞因子(可選地略有修飾)，這會導(dǎo)致特別是在以下水平的困難-目的抗原決定簇的免疫原性能力的稀釋(對于B和T應(yīng)答)-體內(nèi)可能產(chǎn)生促進(jìn)抗體(B應(yīng)答)。
因此合意的是存在能夠獲得抗體的抗原，這些抗體相對細(xì)胞因子具有足夠的保護(hù)性，并且限制細(xì)胞因子的活性。
WO-A-98/51705描述了hRANTES、MIP1α和MIP1β肽，它們包括了與CCR5共受體結(jié)合的這些化學(xué)因子的第二和第三個半胱氨酸之間的部分。
WO-A-98/34631描述了來源于細(xì)胞因子受體γ鏈的肽，這些肽用于阻斷細(xì)胞因子的結(jié)合或者激活受體。
WO-A-94/01457描述了用作攜帶藥物混合物的物質(zhì)的IFNα。
EP-A-0218531描述了用于制備抗體的IL1肽。
這就解釋了本專利的主題是來源于細(xì)胞因子的包含5到40個氨基酸的肽的原因，該肽特征在于至少有一個氨基酸，且優(yōu)選是至少兩個連續(xù)的氨基酸都包含至少一個原子與所述細(xì)胞因子對應(yīng)受體的一個原子之間的距離d小于5埃，間距d根據(jù)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(例如晶體學(xué)或者NMR)進(jìn)行估算；優(yōu)選這些肽誘導(dǎo)與所述細(xì)胞因子發(fā)生相互作用的抗體，排除以下情況--包含在hRANTES、MIP1α和MIP1β的第二和第三個半胱氨酸之間的肽，以及--包含在IFNα的123到140位氨基酸之間的肽。
由于其長度，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞因子肽只對應(yīng)于有限數(shù)目的細(xì)胞因子表位，一般是一個或者兩個細(xì)胞因子表位，因此不包含這些細(xì)胞因子的許多其他表位。
“細(xì)胞因子”指的是真正的細(xì)胞因子以及有化學(xué)吸引力的細(xì)胞因子，它們也被稱為趨化因子。優(yōu)選人細(xì)胞因子?！跋嗷プ饔谩敝傅氖沁@些抗體，例如因?yàn)樗鼈冏R別天然蛋白(這可以通過免疫試驗(yàn)如ELISA和蛋白質(zhì)印跡顯示出來)，或者因?yàn)樗鼈冏钄嗉?xì)胞因子與其受體的結(jié)合(這可以通過生物活性試驗(yàn)或者生物化學(xué)競爭試驗(yàn)顯示出來)，在體內(nèi)具有有益的臨床作用。
在細(xì)胞因子中，可以提到例如TGF1β、IL1α、IL1β、vEGF、TNFα、IFNα和γ，IL4、5、6、10、12、13、15、18、23、IP10、MIP1α和1β、MCP1和Rantes。在以上的細(xì)胞因子中，優(yōu)選為TGF1β、IL1β、vEGF、TNFα、IFNα和γ，IL4、5、6、10、12、13、15、23，或者是這些細(xì)胞因子中某些的任意組合，特別優(yōu)選為IL1β、vEGF、TNFα、IL23和IFNα或者是這些細(xì)胞因子中某些的任意組合。
根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞因子肽來源于或者衍生自細(xì)胞因子?！皝碓从凇钡囊馑际沁@些肽的氨基酸順序與細(xì)胞因子的氨基酸順序相同?！把苌浴钡囊馑际沁@些肽的氨基酸順序與細(xì)胞因子的氨基酸順序基本相同，但是包含一些區(qū)別，這將在后面看到。
本發(fā)明的細(xì)胞因子肽中至少一個氨基酸、優(yōu)選是至少兩個連續(xù)的氨基酸，具有的一個原子與所述細(xì)胞因子對應(yīng)受體的一個原子之間的距離d小于5埃。更有利的間距是小于4.5埃，特別是間隔小于4埃，與所述細(xì)胞因子對應(yīng)受體的一個原子之間的距離最好小于3.5埃。
一般來說，所涉及的氨基酸的原子位于所述氨基酸的側(cè)鏈上。
在實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選條件下，細(xì)胞因子的兩個、特別地是三個、優(yōu)選為四個連續(xù)的氨基酸符合該空間間隔標(biāo)準(zhǔn)。
該間隔根據(jù)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，例如晶體學(xué)或者通過與晶體學(xué)測量產(chǎn)生相似結(jié)果的NMR進(jìn)行估算。
上述細(xì)胞因子肽更為有利的是包含8個以上氨基酸，特別地是10個以上氨基酸，更特別地是12個以上氨基酸，十分特別地是15個以上氨基酸。
在實(shí)施本發(fā)明的其他優(yōu)選條件下，上述細(xì)胞因子肽包含35個以下的氨基酸，更為有利的是30個以下，特別地是25個以下，更特別地是20個以下。一般來說最短的序列對應(yīng)的是含有至少兩個連續(xù)氨基酸的單個組(group)的肽，其包含至少一個原子與所述細(xì)胞因子對應(yīng)受體的一個原子之間的間隔小于5埃，而一般根據(jù)本專利的最長序列含有兩個組、或者甚至三個組、或者更多的這種連續(xù)氨基酸。實(shí)際上這些組可以被幾個如10個氨基酸分隔，如在IL1β中。
從以上的細(xì)胞因子肽中，特別保留了一個或者多個肽，從這些中選出的或來源于這些的肽，其名稱如下hIL1β(人白介素1β)1-APVRSLNCTL-10(SEQ ID No.1)29-LHLQGQDMEQQ-39(SEQ ID No.2)123-STSQAENMPV-132(SEQ ID No.3)hvEGF(人血管內(nèi)皮生長因子)
73-IMRIKPHQGQHIGEMS-83(SEQ ID No.4)hTNFα(人腫瘤壞死因子α)20-PQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEG-54(SEQ ID No.5)80-ISRIAVSYQTKVNLLS-95(SEQ ID No.6)124-FQLEKGDRLSAEINR-138(SEQ ID No.7)hIFNγ(人干擾素γ)1-MQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGIKN-36(SEQ ID No.8)118-MAELSPAAKTGKRKRS-133(SEQ ID No.9)hIL10(人白細(xì)胞介素10)20-PNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKE-50(SEQ ID No.10)hIL4(人白細(xì)胞介素4)5-ITLQEIIKTLNSL-17(SEQ ID No.11)70-AQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAG-95(SEQ ID No.12)hIL12p40(人白細(xì)胞介素12亞單位p40)80-LLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCE-110(SEQ ID No.13)135-KSSRGSSDPQG-145(SEQ ID No.14)hIL18(人白細(xì)胞介素18)1-YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTD-35(SEQ ID No.15)68-CEKISTLSCEN-78(SEQ ID No.16)141-EDELGDRSIMFTVQNED-157(SEQ ID No.17)hIP10(人干擾素γ可誘導(dǎo)蛋白)39-VEIIATMKKKGEKRCLNPESKA-60(SEQ ID No.18)hIL5(人白細(xì)胞介素5)1-IPTSALVKETLALLSTHRTLLIANET-26(SEQ ID No.19)96-LQEFLGVMNTEWI-108(SEQ ID No.20)hTGFβ2(2型人轉(zhuǎn)化生長因子β)25-KRDLGWKWIHE-35(SEQ ID No.21)87-TILYYIGKTPKIEQ-100(SEQ ID No.22)hIL15(人白細(xì)胞介素15)
1-ANWVNVISDLKKI-13(SEQ ID No.23)74-SSNGNVTESGCKECEELEKKNIKEFLQSFVHIVQMF-111(SEQ ID No.24)hIL6(人白細(xì)胞介素6)28-KQIRYILDGISA-39(SEQ ID No.25)114-RAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLL-149(SEQ ID No.26)hMIP1α(人巨噬細(xì)胞炎性蛋白α)51-ADPSEEWVQKYVSDLELSA-69(SEQ ID No.27)hMIP1β(人巨噬細(xì)胞炎性蛋白β)52-ADPSESWVQEYVYDLELN-69(SEQ ID No.28)hIL13(人白細(xì)胞介素13)8-TALRELIEEL-17(SEQ ID No.29)57-CSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSS-82(SEQ ID No.30)hIL23(人白細(xì)胞介素23)52-GHMDLREEGDEETT-65(SEQ ID No.31)115-LLPDSPVGQLHASLLGLSQ-133(SEQ ID No.32)160-LLRFKILRSLQAFVAVAARA-179(SEQ ID No.33)hRANTES(人調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)的趨化因子)51-ANPEKKWVREYINSLEMS-68(SEQ ID No.34)hIFNα(人干擾素α)12-RRTLMLLAQMRK-23(SEQ ID No.35)95-LEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRK-121(SEQ ID No.36)前述的序列是從由于在炎癥反應(yīng)中或者在特異性免疫應(yīng)答中起作用而參與人類疾病發(fā)展的細(xì)胞因子中選出的。特別保留以下的肽hIL1β的123-STSQAENMPV-132hvEGF的73-IMRIKPHQGQHIGEMS-83hTNFα的20-PQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEG-54hIFNγ的1-MQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGIKN-36hIL10的20-PNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKE-50
hIL4的70-AQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAG-95hIL18的1-YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTD-35hIL23的52-GHMDLREEGDEETT-65，115-LLPDSPVGQLHASLLGLSQ-133或160-LLRFKILRSLQAFVAVAARA-179免疫學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)知道，不對免疫原性蛋白的免疫性質(zhì)進(jìn)行任何程度改變的天然肽鏈修飾是可能的。因此也可以提及細(xì)胞因子肽的衍生物，它們與這些天然的序列高度同源，例如與相應(yīng)的天然蛋白質(zhì)有大于50％的同源性，特別地是大于70％的同源性，優(yōu)選地是大于80％地同源性，甚至是大于90％的同源性，同時保留了天然肽中該表位的免疫性質(zhì)。它們的同源區(qū)從5到40個殘基不等，例如從8到40個殘基，或者從8到35個殘基，優(yōu)選從10到35個殘基或者12到35個殘基，顯著優(yōu)越的是12到30個殘基，特別地是15到30個殘基，非常特別地是15到25個殘基。
細(xì)胞因子肽可以含有被改變的殘基，條件是改變不能明顯降低免疫原性，或者加入化學(xué)基團(tuán)(甲基、乙酰基等等)或者有立體化學(xué)改變(使用D型氨基酸)。同細(xì)胞因子肽一樣，細(xì)胞因子肽衍生物應(yīng)該誘導(dǎo)與細(xì)胞因子相互作用的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞因子衍生物在其組成氨基酸中可以含有一個或者幾個改變，例如一個或幾個氨基酸的缺失、替換、增加或者官能化(例如?；?，改變的程度仍然處在以上說明的框架(免疫性質(zhì))內(nèi)。例如一般亮氨酸殘基替換為異亮氨酸殘基不改變這種性質(zhì)；一般來說，改變涉及的氨基酸應(yīng)該少于天然肽中40％的氨基酸，特別地少于30％的氨基酸，優(yōu)選的少于20％的氨基酸，非常特別地少于10％的氨基酸。重要的是，與天然細(xì)胞因子比較，由經(jīng)過改變的肽誘導(dǎo)出的抗體是有活性的。
這些改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍以內(nèi)的，他們可以通過簡單的試驗(yàn)核實(shí)改變的發(fā)生。這種改變的衍生物的免疫原性可以在免疫小鼠后通過ELISA試驗(yàn)進(jìn)行評價，由ELISA檢測的抗原是完整的細(xì)胞因子或者是具有免疫性的細(xì)胞因子肽；也可以通過細(xì)胞因子-受體結(jié)合阻斷試驗(yàn)進(jìn)行檢測?？赡艿男薷膬?yōu)選地影響少于8個氨基酸，更有利地影響少于6個氨基酸，特別地少于4個氨基酸，非常特別地是3個或者更少地氨基酸，如兩個或者單一氨基酸。
本發(fā)明的主題還是一種化合物，其特征在于它含有至少一種以上提及的細(xì)胞因子肽或者細(xì)胞因子肽衍生物。這種化合物可以包含相同的肽/衍生物的重復(fù)、或者包含不同的肽/衍生物組合，或者呈線性形式、或者呈枝狀蠟燭臺結(jié)構(gòu)形式或者是與載體蛋白相混和的偶聯(lián)物。這種化合物還可以以環(huán)化形式出現(xiàn)。這樣根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞因子肽或者細(xì)胞因子肽衍生物可以插入到較長的氨基酸序列中，特別提供了更好的構(gòu)象；或者與外源的T表位結(jié)合(不論是對于蛋白質(zhì)還是DNA免疫)。
更為有利地，它們可以以共價形式與載體蛋白如KLH相聯(lián)合。
正如已經(jīng)看到的那樣，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞因子肽一般對應(yīng)的是少量的細(xì)胞因子表位。特別地，當(dāng)它們被插入、結(jié)合或者組合時，上述化合物不包含所述細(xì)胞因子的其他表位。
這些細(xì)胞因子肽或者細(xì)胞因子肽衍生物可以包括在任意蛋白質(zhì)序列中，此序列與天然細(xì)胞因子的其他表位不具有同源性。例如，它們可以是結(jié)合受體的位點(diǎn)，在受體末端通常有一個半胱氨酸以使肽具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。另一個例子是被破傷風(fēng)毒素的T表位序列包圍的肽。還有一個例子可以包含對應(yīng)于受體結(jié)合位點(diǎn)序列的肽，但是某些氨基酸被它們的D型異構(gòu)體所取代，以避免它們的拮抗劑作用。實(shí)際上，可以任選的更為有利的是使用對于受體沒有拮抗劑作用的肽衍生物，這樣免疫原就不會干擾免疫應(yīng)答了。
為提高免疫應(yīng)答，這些細(xì)胞因子肽或者細(xì)胞因子衍生物可以與載體蛋白相偶聯(lián)。偶聯(lián)的方法以及考慮使用的載體蛋白根據(jù)目標(biāo)肽可以有所不同例如它們可以是鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)蛋白或者是破傷風(fēng)類毒素(TT)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的化學(xué)方法，如使用碳二亞胺、戊二醛或者雙重氮化對二氨基聯(lián)苯偶聯(lián)法與肽進(jìn)行偶聯(lián)?？梢酝ㄟ^在序列中加入或者整合入氨基酸，如賴氨酸、組氨酸、酪氨酸或半胱氨酸來促進(jìn)這些偶聯(lián)的實(shí)現(xiàn)。這種與一種外源T表位〔來源于惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、KLH等等〕偶聯(lián)(不論是化學(xué)還是遺傳的偶聯(lián))的肽化合物也屬于本發(fā)明的范疇。
也可以進(jìn)行蠟燭臺類型的網(wǎng)絡(luò)偶聯(lián)或者與如鐵傳遞蛋白或鐵蛋白的偶聯(lián)，以有效地激活免疫應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明的肽可以特別地由化學(xué)合成、遺傳工程或者其他任何合適的方法產(chǎn)生。環(huán)狀肽的合成、在需要時將一個或者多個半胱氨酸移植到鏈末端產(chǎn)生二硫橋，使得有可能部分恢復(fù)在該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中這些肽片段所具有的二級結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞因子肽、細(xì)胞因子衍生物和它們的化合物具有非常有用的藥理學(xué)性質(zhì)。它們特別地被賦予了顯著的抗細(xì)胞因子性質(zhì)。它們實(shí)際上是免疫原，并能夠在受試者體內(nèi)產(chǎn)生識別天然細(xì)胞因子的抗體。這些肽不含有來源于它們所對應(yīng)的細(xì)胞因子的許多其他表位。
這些性質(zhì)將在后面的實(shí)驗(yàn)部分予以舉例說明。這些例子為以上描述的肽作為藥物使用提出了正當(dāng)?shù)睦碛伞?br> 將這些肽限制為靠近受體結(jié)合位點(diǎn)的肽以及不包括其他細(xì)胞因子表位這兩個事實(shí)，特別提供了有利條件，限制了促進(jìn)細(xì)胞因子活性或者使細(xì)胞因子具有活性潛能的抗體的產(chǎn)生。而且由于目標(biāo)抗原決定簇的數(shù)目有限，也使提高抗細(xì)胞因子免疫的質(zhì)量成為可能。
這就是為什么本發(fā)明的主題也是藥物，其特征在于它們由細(xì)胞因子肽或細(xì)胞因子衍生物或以上描述的化合物組成，即由細(xì)胞因子肽或細(xì)胞因子衍生物或前面描述的免疫原性化合物組成，或者包含hRANTES的第二到第三個半胱氨酸之間的氨基酸，或者包含IFNα的123位到140位氨基酸。這些肽用于人或者動物身體的治療方法，以及利用這種細(xì)胞因子肽或細(xì)胞因子衍生物或免疫原性化合物制備治療或預(yù)防用藥物，以用于與細(xì)胞因子的存在或過量有關(guān)的疾病的治療和預(yù)防。
根據(jù)本發(fā)明的藥物可以用于與免疫系統(tǒng)失調(diào)有關(guān)的疾病的預(yù)防和治療。免疫系統(tǒng)失調(diào)涉及細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生，例如自身免疫疾病(包括，特別是多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、自身免疫糖尿病、狼瘡)、過敏或哮喘、癌癥或艾滋病。因此顯然抵御IL1β或TNFα可以用于類風(fēng)濕多發(fā)性關(guān)節(jié)炎；抵御IFNγ、IL18、IL23或IL12可以用于自身免疫糖尿?。坏钟鵌L4、IL5和IL13可以用于過敏或哮喘；抵御性IL10或vEGF可以用于某些癌癥。更為一般的是，Th1/Th2失調(diào)(其控制免疫應(yīng)答自身并且以標(biāo)準(zhǔn)方式使得IL12、IL2、IL4、IL6、IL10、IL13、IFNγ和TNFα介入)可以通過主動免疫受益于平衡的重新調(diào)整。這只是幾個例子，而本發(fā)明的主題還可以是以包括以上提到的肽序列(不包括其他肽因子表位)的主動免疫為基礎(chǔ)的對于人體的任何治療。這些序列可以根據(jù)本描述中的說明進(jìn)行修改，且DNA免疫可以通過遺傳密碼的簡單翻譯而進(jìn)行。
體液免疫應(yīng)答可以通過ELISA檢測或者顯示天然細(xì)胞因子與其受體的結(jié)合受到抑制的檢測來進(jìn)行評價。細(xì)胞應(yīng)答可以通過關(guān)于所用肽的細(xì)胞增殖檢測來進(jìn)行評價。
根據(jù)本發(fā)明的免疫原性活性成分可以按照如下使用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞因子肽或細(xì)胞因子衍生物或免疫原性化合物施用給患者，如通過皮下或者肌肉途徑給需要這種治療的患者注射足以達(dá)到治療水平上有效的量。使用的劑量可以是例如1到1000微克，特別是10到500微克，通過皮下途徑，每月一次連續(xù)三個月，然后定期地使用，例如每2-6個月一次，根據(jù)被誘導(dǎo)出的血清抗體計(jì)算。當(dāng)單一免疫原性分子不帶有可中和過量產(chǎn)生的細(xì)胞因子的所有活性位點(diǎn)時，可以在同一個制劑中同時使用兩個或者更多不同的免疫原性分子，以誘導(dǎo)出中和所有有害位點(diǎn)的抗體。
本發(fā)明的主題還可以是藥物組合物，特別是含有至少一種以上提及的細(xì)胞因子肽或者細(xì)胞因子衍生物或者免疫原性化合物作為活性成分的疫苗。
作為藥物，可以將本發(fā)明的細(xì)胞因子肽或者細(xì)胞因子衍生物或者免疫原性化合物混入將要以疫苗領(lǐng)域任何標(biāo)準(zhǔn)途徑使用的藥物組合物，特別是通過皮下注射、肌肉注射、靜脈注射或者口服途徑。注射可以是單劑量或者是在某一段時間后重復(fù)一次或者多次注射。
這就是為什么本申請的主題還是一種治療或者預(yù)防用的藥物組合物，其特征在于它含有一或多種細(xì)胞因子肽或細(xì)胞因子衍生物或化合物免疫原作為活性成分，這些免疫原可以是新型的或者如以上確定的那樣，含有IFNα的123位到140位氨基酸。
免疫原性藥劑可以單獨(dú)使用或者與一種作為佐劑的賦形劑或藥物上可以接受的賦形劑混合物相混和。本申請的主題更具體是含有以上提及的細(xì)胞因子肽或者細(xì)胞因子衍生物或者免疫原性化合物作為免疫原的疫苗。
本發(fā)明的主題還是一種制備以上描述的組合物的方法，其特征在于，根據(jù)已知的方法，一種或者幾種活性成分與可以接受的賦形劑，特別是藥物上可以接受的賦形劑相混和。
根據(jù)本發(fā)明為患者施用細(xì)胞因子或細(xì)胞因子衍生物或者免疫原性化合物相當(dāng)于是主動免疫治療。進(jìn)行被動免疫治療也可以是有效的，即直接為患者提供他所需要的抗體。
疫苗制劑對于鼻內(nèi)途徑以聚縮乙烯為賦形劑的凝膠、或者滴鼻液、或者噴霧的形式進(jìn)行包裝，對于口服途徑可以使用抗胃腸消化的膠囊、糖衣片或者抗胃腸消化的顆粒形式。
對于通過全身或者粘膜途徑給藥的DNA疫苗，質(zhì)粒的蓋倫制劑(galenic presentation)可以是在生理液體如生理PBS(磷酸鹽緩沖液＝PBS)中的懸液?？梢詫①|(zhì)粒包裹在可生物降解的聚合物(PLG、PLA、PCL)微球體內(nèi)通過抵抗胃腸消化的膠囊給藥(口服途徑)。該DNA還可以在細(xì)菌載體、沙門氏菌類型載體或者病毒類型載體、腺病毒或者痘病毒的活載體中表達(dá)。
最后，本申請的主題是患者主動免疫的方法，其特征在于細(xì)胞因子肽或者細(xì)胞因子衍生物或者免疫原性化合物作為免疫原如以上描述使用，更為有利的是與一種礦物質(zhì)的、油性的或者合成的免疫佐劑聯(lián)合使用。
免疫可以按照標(biāo)準(zhǔn)方式進(jìn)行，特別的是使用肽或者免疫原性化合物作為綴合物，優(yōu)選有佐劑如ISA51或者鋁存在。免疫可以是基于DNA(與外源T表位結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)同源的序列)，即使用裸露DNA，或者是包含適合啟動子，如pCR3.1的表達(dá)載體。施用的DNA可以通過使用適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)(CpG等等)來保護(hù)不被核酸酶降解。特別地，首次DNA免疫之后可以使用肽化合物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的加強(qiáng)免疫。
用于使用以上描述的肽的優(yōu)選條件還適用于以上提及的本發(fā)明的其他對象。


圖1和圖2(圖1的放大)表示了來源于IL10的肽與受體接觸時的晶體結(jié)構(gòu)。可以看到IL10細(xì)胞因子(左側(cè))與其受體(右側(cè))的接觸。
在圖2中，可以觀察到標(biāo)記為黑色的氨基酸間隔小于4埃(d＝兩個黑點(diǎn)之間的虛線)。從下到上它們分別對應(yīng)于以下氨基酸對192IL10R絲氨酸對著28IL10天冬氨酸(3.18埃)；100IL10R天冬氨酸和101IL10R谷氨酸對著34IL10賴氨酸(3.83埃和3.84埃)；和94IL10R天冬酰胺對著39IL10甲硫氨酸(3.70埃)。對于每個氨基酸確定一個中央點(diǎn)作為該氨基酸的α碳、側(cè)鏈末端以及挑選出來的位于側(cè)鏈上、距離前兩個點(diǎn)最遠(yuǎn)的第三個點(diǎn)三者的氣壓中心(baric centre)。測量的距離d是氨基酸，即半胱氨酸與其受體的中央點(diǎn)之間的距離。顯然這個距離可以用其他通常的方法確定。
以下的例子對本發(fā)明進(jìn)行了舉例說明。
例1從人IL1β的序列合成肽KLHLQGQDMEQQ(SEQ ID No.37)，在天然序列上加入K殘基使得可以通過戊二醛偶聯(lián)使其與KLH結(jié)合。
在有ISA51佐劑存在時免疫五只小鼠。第一針在第0天注射，將40微克的免疫原與足量的ISA51混和制備100微升的乳劑。對于第21天和第40天進(jìn)行的加強(qiáng)免疫，100微升的乳劑中含有20微克的免疫原。使用加入同樣佐劑的KLH同時免疫五只小鼠作為對照。
在第60天采集血清，使用天然細(xì)胞因子進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，以檢測是否有抗體存在。
對于每只小鼠得到的平均吸收值列表如下
對中和天然細(xì)胞因子的抗體的存在進(jìn)行以下估算20單位的天然IL1β細(xì)胞因子與1∶100到1∶2000稀釋的小鼠(免疫的或者對照)血清先在37攝氏度溫育2小時。再向反應(yīng)混合物加入EL4細(xì)胞，每個微孔加50000個細(xì)胞。24小時后通過三明治ELISA試驗(yàn)檢測(R&D診斷)上清中IL2的產(chǎn)生。IL2產(chǎn)生受到抑制的百分比表示了IL1β被中和的百分比?？梢钥吹剑庖叩男∈笥蟹磻?yīng)而對照小鼠沒有反應(yīng)。
例2用來源于人vEGF的合成肽KPHQGQHIGEMS(SEQ ID No.38)免疫五只小鼠。該肽通過戊二醛反應(yīng)與載體蛋白KLH偶聯(lián)。在與例1相同的條件進(jìn)行免疫后，在第60天采集血清，并使用天然細(xì)胞因子進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，以檢測是否有抗體存在。
對于每只小鼠得到的平均吸收值列表如下
例3用來源于人TNFα的合成肽KYQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQL(SEQ ID No.39)免疫五只小鼠。該肽與KLH載體蛋白通過二重氮對二氨基聯(lián)苯偶聯(lián)。在天然序列中加入K和Y殘基使得可以通過戊二醛偶聯(lián)使其與KLH結(jié)合。在與例1相同的條件進(jìn)行免疫后，在第60天采集血清，并使用天然細(xì)胞因子進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，以檢測是否有抗體存在。
對于每只小鼠得到的平均吸收值列表如下
對中和天然細(xì)胞因子的抗體的存在進(jìn)行以下估算50單位的天然TNFα細(xì)胞因子與1∶200稀釋的小鼠(免疫的或者對照)血清先在37攝氏度溫育2小時。再將向反應(yīng)混合物加入L929細(xì)胞，每個微孔加25000個細(xì)胞。24小時后用萘酚藍(lán)黑(Sigma)染色來檢查細(xì)胞的裂解。裂解受到抑制的百分比表示了TNFα被中和的百分比。可以看到，受到免疫的小鼠有反應(yīng)而對照小鼠沒有反應(yīng)。
例4用來源于人IFNγ的肽KKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKN(SEQ ID No.40)免疫五只小鼠。該肽以MAPS的形式化學(xué)合成。然后該MAPS肽通過與戊二醛反應(yīng)與載體蛋白破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)。在與例1相同的條件進(jìn)行免疫后，在第60天采集血清，使用天然細(xì)胞因子進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，以檢測是否有抗體存在。
對于每只小鼠得到的平均吸收值列表如下
對中和天然細(xì)胞因子的抗體的存在進(jìn)行以下估算100單位的天然細(xì)胞因子與1∶250稀釋的小鼠(免疫的或者對照)血清先在37攝氏度溫育2小時。再將向反應(yīng)混合物加入RAW 264.7細(xì)胞，每個2ml孔中加30000個細(xì)胞。24小時后用熒光素偶聯(lián)的第二類抗CMH抗體進(jìn)行標(biāo)記，使用流式細(xì)胞儀估計(jì)細(xì)胞上第二類抗CMH抗體的表達(dá)。第二類抗CMH抗體的表達(dá)受到抑制的百分比表示了IFNγ被中和的百分比?？梢钥吹皆诿庖叩男∈笾杏^察到了抑制而對照小鼠中沒有出現(xiàn)。這些試驗(yàn)的顯著性閾值是30％。
例5用來源于人IL10的肽DECNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNC(SEQ IDNo.41)免疫五只小鼠。該肽用化學(xué)合成，每個末端加上一個半胱氨酸以得到一個環(huán)肽。然后該肽通過與碳二亞胺反應(yīng)與載體蛋白KLH偶聯(lián)。在天然序列中還加入DE殘基使得可以通過碳二亞胺偶聯(lián)使其與KLH結(jié)合。在與例1相同的條件進(jìn)行免疫后，在第60天采集血清，使用天然細(xì)胞因子進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，以檢測是否有抗體存在。
對于每只小鼠得到的平均吸收值列表如下
例6用對應(yīng)于人IL4的肽KQLIRFLKRLDRNLWGLAG(SEQ ID No.42)免疫五只小鼠。該肽通過與戊二醛反應(yīng)與載體蛋白KLH偶聯(lián)。在與例1相同的條件進(jìn)行免疫后，在第60天采集血清，使用天然細(xì)胞因子進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，以檢測是否有抗體存在。
對于每只小鼠得到的平均吸收值列表如下
例7用對應(yīng)于人IL12p40的肽KKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCE(SEQ IDNo.43)免疫五只小鼠。該肽通過與二重氮對二氨基聯(lián)苯反應(yīng)與載體蛋白破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)。在與例1相同的條件進(jìn)行免疫后，在第60天采集血清，使用天然細(xì)胞因子進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，以檢測是否有抗體存在。
對于每只小鼠得到的平均吸收值列表如下
例8用來源于人IL18的肽KYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFID(SEQ ID No.44)免疫五只小鼠。該肽通過與戊二醛反應(yīng)與載體蛋白KLH偶聯(lián)。在天然序列上加入K殘基使得可以通過戊二醛偶聯(lián)使其與KLH結(jié)合。在與例1相同的條件進(jìn)行免疫后，在第60天采集血清，使用天然細(xì)胞因子進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，以檢測是否有抗體存在。
對于每只小鼠得到的平均吸收值列表如下
例9用來源于人IP10的合成肽KKKGEKRCLNPESKA(SEQ ID No.45)免疫五只小鼠。該肽通過與戊二醛反應(yīng)與載體蛋白破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)。天然序列中的三個K殘基可使肽通過用戊二醛偶聯(lián)而與KLH結(jié)合。在與例1相同的條件進(jìn)行免疫后，在第60天采集血清，使用天然細(xì)胞因子進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，以檢測是否有抗體存在。
對于每只小鼠得到的平均吸收值列表如下
例10用對應(yīng)于人IL5的肽KLQEFLGVMNTEWI(SEQ ID No.46)免疫五只小鼠。該肽通過與戊二醛反應(yīng)與載體蛋白KLH偶聯(lián)。在天然序列上加入K殘基使得可以通過戊二醛偶聯(lián)而與KLH結(jié)合。在與例1相同的條件進(jìn)行免疫后，在第60天采集血清，使用天然細(xì)胞因子進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，以檢測是否有抗體存在。
對于每只小鼠得到的平均吸收值列表如下
例11用對應(yīng)于人TGFβ2的肽DTILYYIGKTPKIE(SEQ ID No.47)免疫五只小鼠。該肽通過與碳二亞胺反應(yīng)與載體蛋白KLH偶聯(lián)。在天然序列中加入D殘基以通過偶聯(lián)產(chǎn)生一個鍵合。在與例1相同的條件進(jìn)行免疫后，在第60天采集血清，使用天然細(xì)胞因子進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，以檢測是否有抗體存在。
對于每只小鼠得到的平均吸收值列表如下
例12用對應(yīng)于人IL6的肽KQIRYILDGISA(SEQ ID No.25)免疫五只小鼠。該肽通過與二重氮對二氨基聯(lián)苯反應(yīng)與載體蛋白TT偶聯(lián)。在與例1相同的條件進(jìn)行免疫后，在第60天采集血清，使用天然細(xì)胞因子進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，以檢測是否有抗體存在。
對于每只小鼠得到的平均吸收值列表如下
例13合成屬于IL1β的肽1-APVRSLNCTL-10(GCACCTGTACGATCACTGAACTGCACGCTC)(SEQ ID No.48)、29-LHLQGQDMEQQ-39(CTCCACCTCCAGGGACAGGATATGGAGCAACAA)(SEQ ID No.49)和123-STSQAENMPV-132(AGCACCTCTCAAGCAGAAAACATGCCCGTC)(SEQ IDNo.50)的DNA，并且通過GYG間隔臂(GGCTACGGC)(SEQ ID No.54)與破傷風(fēng)類毒素的T表位AQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID No.55)(CAGTACATCAAGGCTAACTCCAAGTTCATCGGTATCACTGAGCTG)(SEQ ID No.51)和KLH(VDTVVRKNVDSL)(GTTGACACCACCAGAAAAAATGTTGACTCCCTT)(SEQID No.52)隔開。
最終的核苷酸序列如下GTTGACACCACCAGAAAAAATGTTGACTCCCTTGGCTACGGCGCACCTGTACGATCACTGAACTGCACGCTCGGCTACGGCGTTGACACCACCAGAAAAAATGTTGACTCCCTTGGCTACGGCCTCCACCTCCAGGGACAGGATATGGAGCAACAAGGCTACGGCCAGTACATCAAGGCTAACTCCAAGTTCATCGGTATCACTGAGCTGGGCTACGGCAGCACCTCTCAAGCAGAAAACATGCCCGTCGGCTACGGCGTTGACACCACCAGAAAAAATGTTGACTCCCTT(SEQ ID NO.53)將該DNA序列克隆入pRSET-A中，其編碼一個肽化合物，以多聚組氨酸融合蛋白的形式通過基因工程產(chǎn)生并純化出來。如例1所示，使用該肽作為免疫原。
用ELISA測量小鼠對于天然IL1β的抗體反應(yīng)，得到以下數(shù)值
例14合成屬于IL1β的肽1-APVRSLNCTL-10(GCACCTGTACGATCACTGAACTGCACGCTC)(SEQ ID No.48)、29-LHLQGQDMEQQ-39(CTCCACCTCCAGGGACAGGATATGGAGCAACAA)(SEQ IDNo.49)和123-STSQAENMPV-132(AGCACCTCTCAAGCAGAAAACATGCCCGTC)(SEQ ID No.50)的DNA，并且通過GYG間隔臂與破傷風(fēng)類毒素的T表位AQYIKANSKFIGITEL(CAGTACATCAAGGCTAACTCCAAGTTCATCGGTATCACTGAGCTG)(SEQ ID No.51)和KLHVDTVVRKNVDSL(GTTGACACCACCAGAAAAAATGTTGACTCCCTT)(SEQ IDNo.52)隔開。
最終的核苷酸序列如下GTTGACACCACCAGAAAAAATGTTGACTCCCTTGGCTACGGCGCACCTGTACGATCACTGAACTGCACGCTCGGCTACGGCGTTGACACCACCAGAAAAAATGTTGACTCCCTTGGCTACGGCCTCCACCTCCAGGGACAGGATATGGAGCAACAAGGCTACGGCCAGTACATCAAGGCTAACTCCAAGTTCATCGGTATCACTGAGCTGGGCTACGGCAGCACCTCTCAAGCAGAAAACATGCCCGTCGGCTACGGCGTTGACACCACCAGAAAAAATGTTGACTCCCTT(SEQ ID NO.53)將該DNA序列克隆入pCR3.1中，其在CMV啟動子的控制下編碼IL1b肽。
第一針肌內(nèi)注射的是含有100微克載體的100微升鹽水溶液。兩針加強(qiáng)注射分別在第21天和第40天，使用例13的肽(“初次-加強(qiáng)”類型免疫)。在第60天通過針對天然細(xì)胞因子的ELISA試驗(yàn)檢測五只免疫小鼠和五只對照小鼠的抗體反應(yīng)。
結(jié)果如下
例15使用50％的ISA51(Seppic，巴黎)和50％例1肽的水溶液組成的油包水乳劑制備疫苗(50微克/劑)。
例16基于質(zhì)粒免疫原的疫苗用于IL10系統(tǒng)類型的DNA免疫。
編碼屬于IL1β的肽APVRSLNCTL和LHLQGQDMEQQ的質(zhì)粒(20微克/劑)懸于0.2毫升PBS溶液中用于肌肉注射。
例17由50％的ISA51(SEPPIC，巴黎)和衍生自人TNFα的且與KLH偶聯(lián)的合成肽KYQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQL的50％水溶液組成油包水乳劑制備疫苗(100微克/劑)。
序列表<110>Jean-Francois，ZAGURY<120>新型肽及其在治療中的應(yīng)用<130>bif022175 pct<160>55<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>10<212>PRT<213>人<400>1Ala Pro Val Ala Ser Leu Ala Cys Thr Leu1 5 10<210>2<211>11<212>PRT<213>人<400>2Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln1 5 10<210>3<211>10<212>PRT<213>人<400>3Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val1 5 10<210>4<211>16<212>PRT<213>人<400>4Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser1 5 10 15<210>5<211>35<212>PRT<213>人<400>5
Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala1 5 10 15Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro20 25 30Ser Glu Gly35<210>6<211>16<212>PRT<213>人<400>6Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser1 5 10 15<210>7<211>15<212>PRT<213>人<400>7Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg1 5 10 15<210>8<211>36<212>PRT<213>人<400>8Met Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe1 5 10 15Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly20 25 30Ile Leu Lys Asn35<210>9<211>16<212>PRT<213>人<400>9Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser1 5 10 15
<210>10<211>31<212>PRT<213>人<400>10Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr1 5 10 15Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu20 25 30<210>11<211>13<212>PRT<213>人<400>11Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu1 5 10<210>12<211>26<212>PRT<213>人<400>12Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg1 5 10 15Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly20 25<210>13<211>31<212>PRT<213>人<400>13Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu1 5 10 15Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu20 25 30<210>14<211>11<212>PRT<213>人
<400>14Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly1 5 10<210>15<211>35<212>PRT<213>人<400>15Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1 5 10 15Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp20 25 30Met Thr Asp35<210>16<211>11<212>PRT<213>人<400>16Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn1 5 10<210>17<211>17<212>PRT<213>人<400>17Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu1 5 10 15Asp<210>18<211>24<212>PRT<213>人<400>18Val Glu Ile Ile Ala Thr Met Lys Lys Lys Gly Glu Lys Arg Cys Arg1 5 10 15Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala
20<210>19<211>26<212>PRT<213>人<400>19Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr1 5 10 15His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr20 25<210>20<211>13<212>PRT<213>人<400>20Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile1 5 10<210>21<211>11<212>PRT<213>人<400>21Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu1 5 10<210>22<211>14<212>PRT<213>人<400>22Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile Glu Gln1 5 10<210>23<211>13<212>PRT<213>人<400>23Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile1 5 10<210>24
<211>36<212>PRT<213>人<400>24Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu1 5 10 15Leu Glu Lys Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile20 25 30Val Gln Met Phe35<210>25<211>12<212>PRT<213>人<400>25Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala1 5 10<210>26<211>36<212>PRT<213>人<400>26Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys1 5 10 15Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn20 25 30Ala Ser Leu Leu35<210>27<211>19<212>PRT<213>人<400>27Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu1 5 10 15Leu Ser Ala
<210>28<211>18<212>PRT<213>人<400>28Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr Asp Leu Glu1 5 10 15Leu Asn<210>29<211>10<212>PRT<213>人<400>29Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu1 5 10<210>30<211>26<212>PRT<213>人<400>30Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro1 5 10 15His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser20 25<210>31<211>14<212>PRT<213>人<400>31Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr Thr1 5 10<210>32<211>19<212>PRT<213>人<400>32Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly1 5 10 15
Leu Ser Gln<210>33<211>20<212>PRT<213>人<400>33Leu Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val1 5 10 15Ala Ala Arg Val20<210>34<211>18<212>PRT<213>人<400>34Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu1 5 10 15Met Ser<210>35<211>12<212>PRT<213>人<400>35Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys1 5 10<210>36<211>27<212>PRT<213>人<400>36Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu1 5 10 15Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys20 25<210>37<211>12<212>PRT
<213>人<400>37Lys Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln1 5 10<210>38<211>12<212>PRT<213>人<400>38Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser1 5 10<210>39<211>30<212>PRT<213>人<400>39Lys Tyr Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn1 5 10 15Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu20 25 30<210>40<211>24<212>PRT<213>人<400>40Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr1 5 10 15Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn20<210>41<211>29<212>PRT<213>人<400>41Asp Glu Cys Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val1 5 10 15Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Cys20 25
<210>42<211>19<212>PRT<213>人<400>42Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly1 5 10 15Leu Ala Gly<210>43<211>27<212>PRT<213>人<400>43Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys1 5 10 15Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu20 25<210>44<211>24<212>PRT<213>人<400>44Lys Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu1 5 10 15Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp20<210>45<211>17<212>PRT<213>人<400>45Lys Lys Lys Gly Glu Lys Arg Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys1 5 10 15Ala<210>46<211>14
<212>PRT<213>人<400>46Lys Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile1 5 10<210>47<211>14<212>PRT<213>人<400>47Asp Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile Glu1 5 10<210>48<211>30<212>DNA<213>人<400>48gcacctgtac gatcactgaa ctgcacgctc 30<210>49<211>32<212>DNA<213>人<400>49ctccacctcc aggacaggat atggagcaac aa 32<210>50<211>30<212>DNA<213>人<400>50agcacctctc aagcagaaaa catgcccgtc 30<210>51<211>45<212>DNA<213>人<400>51cagtacatca aggctaactc caagttcatc ggtatcactg agctg 45<210>52<211>33<212>DNA<213>人<400>52gttgacacca ccagaaaaaa tgttgactcc ctt 33
<210>53<211>291<212>DNA<213>人<400>53gttgacacca ccagaaaaaa tgttgactcc cttggctacg gcgcacctgt acgatcactg 60aactgcacgc tcggctacgg cgttgacacc accagaaaaa atgttgactc ccttggctac 120ggcctccacc tccagggaca ggatatggag caacaaggct acggccagta catcaaggct 180aactccaagt tcatcggtat cactgagctg ggctacggca gcacctctca agcagaaaac 240atgcccgtcg gctacggcgt tgacaccacc agaaaaaatg ttgactccct t 291<210>54<211>9<212>DNA<213>人<400>54ggctacggc 9<210>55<211>16<212>PRT<213>人<400>55Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 1權(quán)利要求
1.含5到40個氨基酸的來源于細(xì)胞因子的肽，其特征在于其至少有一個氨基酸含有至少一個原子與所述細(xì)胞因子對應(yīng)受體的一個原子之間的距離d小于5埃，該間距d根據(jù)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)計(jì)算，排除以下-包含在h RANTES、MIP 1α和MIP 1β的第二和第三個半胱氨酸之間的肽，以及-包含在IFNα的123位和140位氨基酸之間的肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其特征在于其兩個連續(xù)氨基酸都含有至少一個原子與所述細(xì)胞因子對應(yīng)受體的一個原子之間的距離d小于5埃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，其特征在于該肽選自以下細(xì)胞因子的片段TGFβ、IL1β、VEGF、TNFα、IFNα和γ、IL4、5、6、10、12、13、15、18、23、IP10、MIP 1α和1β以及Rantes。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的肽，其特征在于該肽選自以下細(xì)胞因子的片段TGFβ、IL1β、VEGF、TNFα、IFNγ、IL4、5、6、10、12、13、15、18、23。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的肽，其特征在于d小于4埃。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的肽，其特征在于該細(xì)胞因子肽的3個或4個連續(xù)的氨基酸符合這個相同的間隔標(biāo)準(zhǔn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的肽，其特征在于其含有小于30個的氨基酸。
8.權(quán)利要求1所述的肽或其片段，其選自或者來源于下列名稱的肽hIL1β(人白介素1β)1-APVRSLNCTL-10(SEQ ID No.1)29-LHLQGQDMEQQ-39(SEQ ID No.2)123-STSQAENMPV-132(SEQ ID No.3)hvEGF(人血管內(nèi)皮生長因子)73-IMRIKPHQGQHIGEMS-83(SEQ ID No.4)hTNFα(人腫瘤壞死因子α)20-PQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEG-54(SEQ ID No.5)80-ISRIAVSYQTKVNLLS-95(SEQ ID No.6)124-FQLEKGDRLSAEINR-138(SEQ ID No.7)hIFNγ(人干擾素γ)1-MQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGIKN-36(SEQ ID No.8)118-MAELSPAAKTGKRKRS-133(SEQ ID No.9)hIL10(人白細(xì)胞介素10)20-PNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKE-50(SEQ ID No.10)hIL4(人白細(xì)胞介素4)5-ITLQEIIKTLNSL-17(SEQ ID No.11)70-AQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAG-95(SEQ ID No.12)hIL12p40(人白細(xì)胞介素12亞單位p40)80-LLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCE-110(SEQ ID No.13)135-KSSRGSSDPQG-145(SEQ ID No.14)hIL18(人白細(xì)胞介素18)1-YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTD-35(SEQ ID No.15)68-CEKISTLSCEN-78(SEQ ID No.16)141-EDELGDRSIMFTVQNED-157(SEQ ID No.17)hIP10(人干擾素γ可誘導(dǎo)蛋白)39-VEIIATMKKKGEKRCLNPESKA-60(SEQ ID No.18)hIL5(人白細(xì)胞介素5)1-IPTSALVKETLALLSTHRTLLIANET-26(SEQ ID No.19)96-LQEFLGVMNTEWI-108(SEQ ID No.20)hTGFβ2(2型人轉(zhuǎn)化生長因子β)25-KRDLGWKWIHE-35(SEQ ID No.21)87-TILYYIGKTPKIEQ-100(SEQ ID No.22)hIL15(人白細(xì)胞介素15)1-ANWVNVISDLKKI-13(SEQ ID No.23)74-SSNGNVTESGCKECEELEKKNIKEFLQSFVHIVQMF-111(SEQ ID No.24)hIL6(人白細(xì)胞介素6)28-KQIRYILDGISA-39(SEQ ID No.25)114-RAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLL-149(SEQ ID No.26)hMIP1α(人巨噬細(xì)胞炎性蛋白α)51-ADPSEEWVQKYVSDLELSA-69(SEQ ID No.27)hMIP1β(人巨噬細(xì)胞炎性蛋白β)52-ADPSESWVQEYVYDLELN-69(SEQ ID No.28)hIL13(人白細(xì)胞介素13)8-TALRELIEEL-17(SEQ ID No.29)57-CSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSS-82(SEQ ID No.30)hIL23(人白細(xì)胞介素23)52-GHMDLREEGDEETT-65(SEQ ID No.31)115-LLPDSPVGQLHASLLGLSQ-133(SEQ ID No.32)160-LLRFKILRSLQAFVAVAARA-179(SEQ ID No.33)hRANTES(人調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)的趨化因子)51-ANPEKKWVREYINSLEMS-68(SEQ ID No.34)hIFNα(人干擾素α)12-RRTLMLLAQMRK-23(SEQ ID No.35)95-LEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRK-121(SEQ ID No.36)
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)肽的衍生物，該衍生物通過所述肽一個或者多個氨基酸的缺失、替換、增加、環(huán)化、立體化學(xué)改變(使用D型氨基酸)或者官能化(例如?；?而得到。
10.免疫原性化合物，其特征在于它含有權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的肽或者肽衍生物，應(yīng)該認(rèn)識到該化合物不含有所述細(xì)胞因子的其他表位；且其特征在于其能夠在受試者體內(nèi)產(chǎn)生識別天然細(xì)胞因子的抗體。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的或者包含在IFNα的123到140位氨基酸之間的肽或者肽衍生物或者免疫原性化合物，其用于人或者動物體的治療方法。
12.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的或者包含在IFNα的123到140位氨基酸之間的肽或者肽衍生物或者免疫原性化合物用于制備治療或者預(yù)防用藥物的用途，該藥物用于治療或者預(yù)防與細(xì)胞因子過量或者存在有關(guān)的疾病。
13.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的或者包含在IFNα的123到140位氨基酸之間的肽或者肽衍生物或者免疫原性化合物用于制備治療或者預(yù)防用藥物的用途，該藥物用于治療自身免疫疾病。
14.藥物組合物，其包含至少一種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的或者包含在IFNα的123到140位氨基酸之間的肽或者肽衍生物或者免疫原性化合物作為活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及由5到40個氨基酸組成的來源于細(xì)胞因子的肽，其中至少一個氨基酸含有至少一個原子與所述細(xì)胞因子對應(yīng)受體的一個原子之間的距離小于5埃，距離d根據(jù)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行估算；肽的衍生物或者含有肽或者其衍生物的免疫原性化合物；肽或者肽衍生物或者免疫原性化合物用于制備治療或者預(yù)防藥物的用途，其目的在于治療或者預(yù)防與細(xì)胞因子過量或者存在有關(guān)的疾病或者治療自身免疫疾??；含有以上提及的肽或者肽衍生物或者免疫原性化合物作為活性成分的藥物組合物。
文檔編號H04L12/28GK1649898SQ03810060
公開日2005年8月3日 申請日期2003年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月10日
發(fā)明者讓－弗蘭西斯·薩古里 申請人:維克斯咨詢公司