專利名稱:通過使用融合蛋白生產(chǎn)酰胺化肽的方法
技術領域:
本發(fā)明涉及通過重組方法、特別地但不僅僅進行羧基末端修飾如酰胺化作用生產(chǎn)肽的方法。
“肽”是不太準確地應用于通過氨基和羧基末端連接的氨基酸鏈,專指三到一百以上但也可能更多成分的序列的術語。有許多天然產(chǎn)生的肽的例子作用為激素、信使、生長因子、抗微生物劑、表面活性劑等,也可預期多種醫(yī)藥和其它用途。
目前,至少有三種肽的主要來源,從天然資源中提取、化學合成和來源于用重組DNA構建體轉化的有機體。使用轉化有機體途徑的優(yōu)點是其合成方法的生物保真性、合成化學上不適宜序列的能力、對化學方法的避免、使用溶劑等,以及特別地對于較長肽的成本-有效性。
通過重組技術制備肽的缺點是所用的有機體在合成以及如果需要分泌短序列氨基酸時顯得不理想。所以,許多為工業(yè)應用考慮的方法利用了融合蛋白,其中短肽序列制成在另一蛋白上氨基或羧基末端的延伸。盡管這些融合蛋白可大量生產(chǎn),并常通過采用簡化融合蛋白純化的特殊性質(zhì)加以純化,但在回收肽時會遇到困難。蛋白是化學穩(wěn)定的分子并因此需要特異切割策略以回收具有確定的氨基和羧基末端的完整肽。
可看到一大系列的蛋白切割技術。它們從特異氨基酸處的化學切割到使用序列特異性酶進行酶切?;瘜W切割的實施例包括在甲硫氨酸殘基之后用溴化氰切割以及在天冬酰胺-甘氨酸的氨基酸對之間用羥胺切割。適于在特異蛋白序列切割的酶的例子包括可在(天冬氨酸)4-賴氨酸序列之后進行切割的腸激酶,以及在堿性氨基酸賴氨酸或精氨酸之后進行切割的凝血酶。
這兩種切割策略的普遍問題是由于肽中內(nèi)部位點存在和產(chǎn)生真正氨基末端的需要而發(fā)生的序列限制。例如,溴化氰只在肽中沒有內(nèi)部甲硫氨酸時有用,并且凝血酶可在堿性氨基酸后的大量不同位點切割。酶切割從加工經(jīng)濟學角度來看還有其它問題。酶必須來自可接受的有效來源(腸激酶的常見來源是小牛腸道內(nèi)皮)并能獲得經(jīng)濟上可接受的量。
羧基末端酰胺化是在許多具有潛在商業(yè)利益的生物活性肽中發(fā)現(xiàn)的常見翻譯后修飾。例子包括降鈣素、爪蟾抗菌肽等。在許多例子如降鈣素中,天然酰胺化的肽的活性幾乎是非酰胺化肽的二千倍。
有許多不同的化學和物理方法設計用來產(chǎn)生羧基末端酰胺化肽。然而,象任何其它加工步驟一樣,每一步從增加終產(chǎn)物的總花費角度考慮都有缺點。
本發(fā)明描述了用于在重組系統(tǒng)中生產(chǎn)作為融合蛋白氨基末端延伸的肽的方法。我們提供新的方法,其中肽從融合蛋白上的切割和肽的修飾如羧基酰胺化可在單獨的步驟中通過一系列相連接的反應完成。該方法從生物表達系統(tǒng)的低花費和合成保真性獲益,沒有由分離的切割步驟的需要帶來的缺點。
因此,在第一方面,本發(fā)明提供了生產(chǎn)肽的方法,其中包括以下步驟表達作為融合蛋白一部分的肽,接下來通過?;荏w如含硫還原劑從融合蛋白上釋放肽。適當?shù)?,至少部分融合蛋白是能催化肽作為?;糠洲D移給適當受體如近端硫原子以形成硫代-酯的分子。
在更優(yōu)選的實施方案中,肽經(jīng)過化學修飾,例如在從融合蛋白釋放出來之后在其羧基末端酰胺化。適當?shù)?,酰胺化步驟在適當pH、一定來源的銨離子參與下進行并且酰胺化步驟與肽釋放同時發(fā)生。可用這些方法制備的酰胺化肽的例子包括鮭降鈣素、人降鈣素、促黃體生成素釋放激素、催產(chǎn)素、胃泌素神經(jīng)肽Y、血管升壓素、促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素,生長激素釋放激素、人降鈣素基因相關肽、胃泌素、D-tyr-trp-gly、phe-gly-phe-gly、gly-phe-gly、黑素細胞刺激素前體、Sectetin、促甲狀腺素釋放激素、糊精、P物質(zhì)、胰多肽、縮膽囊素、胃泌素分泌因子、phe-his-ile、phe-tyr-tyr、蛙皮降壓肽(Savagin)、肥大細胞脫粒肽M、雨蛙肽和FMRF酰胺。
然而,也可能在缺乏氨的情況下進行肽的簡單水解,導致自由羧酸末端基團的形成。這使得本發(fā)明的方法適于進行用于醫(yī)藥或其它用途的帶有自由羧基末端的肽的商業(yè)生產(chǎn)。這些肽的例子包括Hirulog、爪蟾抗菌肽、胸腺素α-1、腦肽(brain naturetic peptide)、心房肽(atrialnaturetic peptide)或殺菌/通透性-增加蛋白。
本發(fā)明的方法例如可利用設計用來制備作為融合蛋白的蛋白的、商業(yè)上可獲得的表達載體。該載體包含修飾的自剪切蛋白即intein,使得可能通過簡單的化學反應將蛋白從融合伴侶上釋放出來。本發(fā)明利用修飾的化學條件/步驟以導致融合蛋白的切割從而釋放所需要的能通過如羧基末端的酰胺化作用而得到修飾的肽。
Inteins是在氨基和羧基末端表達的側翼蛋白序列。氨基和羧基末端序列已命名為exteins以符合外顯子和內(nèi)含子的DNA命名法。一個看來典型的inteins新興家族的成員是來自酵母的VMA1基因產(chǎn)物。它的分子量約為50kDa并在氨基末端(半胱氨酸)和羧基末端(組氨酸和天冬酰胺)包含必需氨基酸。并且,羧基末端exteins必須以半胱氨酸開始。在釋放完成后的一些點,氨基末端的肽鍵斷裂并且extein轉移到鄰近半胱氨酸的硫原子上以形成硫代-酯。然后該鍵在羧基末端extein的起始與半胱氨酸互換,然后在鄰近天冬酰胺的參與下在intein的該末端與肽鍵互換。這些協(xié)同反應的總效應是兩個exteins無縫隙地連接并釋放intein。
對其中intein的任一末端的必需基團和exteins的近端已經(jīng)過系統(tǒng)性替換的一系列突變體進行分析之后將呈現(xiàn)對這些反應的詳盡理解。該認識使得其中氨基末端extein可由任何其它蛋白替換并且自剪切功能已喪失的突變inteins的設計成為可行。但是,最終融合蛋白的切割仍可能通過加入外部化學試劑如還原劑二硫蘇糖醇完成。融合蛋白通過加入的逐漸在溶液中水解為游離酸的還原劑釋放為硫代-酯。
降鈣素是適于用本發(fā)明描述的方法制備的在醫(yī)學和商業(yè)上重要的肽的例子。它包含32個氨基酸并在羧基末端酰胺化。其功能活性和氨基酸序列在物種之間高度保守。因此原先主要從天然來源獲得但現(xiàn)在通過直接合成制備的鮭降鈣素廣泛應用于臨床。過去,治療集中于乳腺派杰病和低鈣血中風癥。然而,最近有治療絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的更大量物質(zhì)的需要。該應用需要大量物質(zhì),使生產(chǎn)花費成為日益重要的因素。
為使用intein載體制備降鈣素,需要制備編碼降鈣素序列的互補寡核苷酸,它的側翼是設計用來在修飾的intein的適當5’位點進行插入的限制性位點。這些位點必須經(jīng)過選擇以使肽的編碼序列與表達蛋白的剩余部分在同一編碼框中。適當?shù)墓押塑账崮芡ㄟ^為那些本領域技術人員所熟知的任一方法制備,包括最明顯的直接合成和用設計為包含方便的限制性位點的引物從天然序列進行聚合酶鏈式反應擴增。之后將該DNA構建體轉化入適當?shù)谋磉_系統(tǒng)并收獲最終的融合蛋白。
在進一步改良的系統(tǒng)中融合蛋白還包含一個標記,可通過親和或其它層析方法對融合蛋白并因此對肽進行鑒定和/或純化。適當標記的例子包括特異幾丁質(zhì)結合區(qū)或其部分、酸性或堿性氨基酸的重復,多聚組氨酸序列、谷胱甘肽S轉移酰和溶菌酶。例如,intein的羧基末端可與特異幾丁質(zhì)結合區(qū)融合。該物質(zhì)緊密結合到裝有幾丁質(zhì)珠的填充柱上并可用于完整融合蛋白的親和純化。大量洗滌之后,柱子用適當?shù)那懈顒┨幚聿⑾疵撫尫诺陌须摹?br>
盡管上述基于intein的載體是設計用于大腸桿菌中的,但任何能在商業(yè)范圍內(nèi)運作的表達系統(tǒng)都是合適的。其它載體可設計在特定表達系統(tǒng)中最佳使用。例如,如果選擇哺乳動物表達系統(tǒng),其蛋白編碼區(qū)應有針對該特定系統(tǒng)的最佳密碼子選擇。表達也可通過使用較小親和標記如上述的酸性或堿性氨基酸重復進行鑒定和/或純化而得到改進,以使污染蛋白可通過離子交換層析或在金屬螯合介質(zhì)中包埋多聚組氨酸序列純化而得以消除??筛纳茝牟溉閯游锵到y(tǒng)(目前的大腸桿菌載體是設計用于細胞內(nèi)蛋白合成)分泌的進一步修飾將是在降鈣素上添加分泌前導序列以促進向介質(zhì)中或轉基因動物的乳中的分泌。適當?shù)?,該前導序列應在分泌過程中由天然的加工酶去除。
可用于表達肽融合蛋白的表達系統(tǒng)的實施例包括細菌(大腸桿菌、枯草桿菌等)、酵母(釀酒酵母、P.pastoralis等)、昆蟲細胞(草地夜蛾)、哺乳動物表達系統(tǒng)(中國倉鼠卵巢,幼倉鼠腎等)、于乳或其它體液中的轉基因哺乳動物表達(優(yōu)選地豬、母牛、綿羊、山羊、兔等)和植物(馬鈴薯、玉米等)。在大腸桿菌的表達系統(tǒng)中,起始甲硫氨酸會留在表達產(chǎn)物里。因此,當所感興趣的肽是在其序列中不包含多余的甲硫氨酸時,該起始甲硫氨酸可用溴化氰去除。這樣的肽的一個例子是降鈣素。
對于這些系統(tǒng)中的任何一個以及細胞內(nèi)或細胞外合成,表達可通過適當選擇前導序列、密碼子使用、intein或其突變體和純化策略而得以優(yōu)化。技術人員會認識到本發(fā)明并不依賴intein的任何特別的表現(xiàn)形式或任何物種作為來源。例如,使用整個intein分子并不是必需的,大量序列可能與所需的方法并不相關并且可能分子的大部分在功能上都是不需要的。確實,“intein”定義之外的其它蛋白也可能將位于靶肽羧基末端的肽鍵轉移給適當?shù)牧虼蓟鶊F從而建立有伴隨酰胺化作用的切割所需的硫代-酯基團。
硫代-酯與肽鍵或氧-酯鍵相比是相對具有反應活性的化學基團,并因此易于在溫和的反應條件下轉變?yōu)轷0?。在融合肽可轉變?yōu)轸然┒缩0返恼G懈詈歪尫磐緩街杏袃蓚€點。第一點并可能是最適當?shù)狞c是在肽通過添加硫醇試劑已從融合伴侶上釋放出來之后。優(yōu)選的試劑是二硫蘇糖醇但任何含硫還原劑也能有效發(fā)揮作用。該反應本質(zhì)上是硫醇-交換反應,其中在肽的羧基末端之間形成的硫醇-酯并將intein半胱氨酸的硫轉移給二硫蘇糖醇的硫原子之一。象任何化學反應一樣,在位于intein氨基末端的半胱氨酸胺和相同氨基酸殘基的硫之間的?;苿臃磻且粋€平衡。相對于上述的酵母intein,該平衡在利于胺集團時移動并且硫代-酯是次要成分。
加入的硫醇試劑去除該硫代-酯并因此而驅動反應向產(chǎn)生更多硫代-酯的方向進行直至所有肽均有效釋放為自由的硫代-酯。釋放硫代-酯對于水的水解(將會產(chǎn)生不需要的游離酸)是相對穩(wěn)定的并因此適于通過任何利于增加酰胺形成的化學條件而進行的切割。
其中肽顯示為硫代-酯的第二點是intein本身,但如上所述,該物質(zhì)是次要成分。但是,還是可能設計化學條件使得同時釋放作為酰胺化物質(zhì)的肽。
預期可有利于伴隨酰胺化作用的硫代-酯切割的條件很多并且下列內(nèi)容僅是為了說明可能的試劑和反應的代表性選擇。在化學上,酰胺可通過用氨和相關化合物裂解硫代-酯形成。這需要羰基的正電荷增強(這是相鄰硫原子的效應)的條件并需要氨中氮的弧對電子。在水溶液中,由鹽例如磷酸銨或硫酸銨提供的正電荷銨離子與不帶電荷的氨即反應性物質(zhì)產(chǎn)生平衡,并且在氫離子濃度降低時游離氨的濃度升高。因此可以預期提高酰胺產(chǎn)物形成的反應盡管可能在相對低的pH值如pH4.0到6.0開始,但會在pH在6.0到9.0或甚至10.0的范圍內(nèi)增加時反應得更快,其中平衡向利于氨形成的方向顯著移動。
最佳的范圍將在肽底物自身所能耐受的最高pH和反應仍能以可接受的速率繼續(xù)進行的最低pH之間進行折衰。該最佳范圍將由肽本身的序列和其它融合伴侶特性的相關因素以及與加工過程相關的問題特別是純化所決定。相似的條件和限制因素可能使用,看切割/酰胺化反應是同時還是相繼發(fā)生。本領域技術人員可預期有許多其它化學條件,無論是在水溶還是非水溶系統(tǒng)中,都能實現(xiàn)所需反應。以上僅表示對適當方法的說明并不意味著排除其它可能的方法。
本發(fā)明現(xiàn)在以下列實施例加以描述,這將不應在任何方面對本發(fā)明構成限制。實施例1甘氨酸延伸的鮭降鈣素1.1.克隆策略載體pCYB1,從New England Biolabs獲得,含有用于翻譯起始的NdeI位點和直接與intein相鄰的SapI位點,用于克隆和表達甘氨酸延伸的鮭降鈣素(sCT-G)。sCFG的編碼序列合成為103堿基和104堿基的兩個互補單鏈寡核苷酸。優(yōu)化密碼子以在大腸桿菌中表達。兩鏈的退火產(chǎn)生與NdeI(5’末端)和SapI位點(3’末端)互補的突出端。雙鏈寡核苷酸插入到以NdeI和SapI消化的pCYB1中。融合基因的表達受控于Plac啟動子并且由于載體上lacq基因的存在通過IPTG進行調(diào)節(jié)。1.2.融合蛋白的表達和分析將含有sCFG的pCYB1載體轉化至DH5α中,讓細胞生長,用IPTG誘導,收獲并通過超聲裂解。表達的融合蛋白從幾丁質(zhì)瓊脂糖中獲得并經(jīng)洗滌然后在SDS-PAGE樣品緩沖液中煮沸。上清在16%的SDS-PAGE膠中電泳并且蛋白通過考馬斯染色目測或電印跡到PVDF膜上用于N-末端測序。序列分析顯示SCT-G N-末端在Ser 2和Thr 6兩個位置被截短。1.3.融合蛋白的切割和肽酰胺化幾丁質(zhì)瓊脂糖結合的融合蛋白用20mM Hepes pH8.0,40mMDTT(切割緩沖液A)或加有3.0M碳酸氫銨的切割緩沖液A(切割緩沖液B)進行洗滌并于4℃放置過夜。釋放的sCT-G從柱上洗下來并結合到陽離子交換樹脂上再用鹽梯度洗脫而獲得。用胰蛋白酶消化后C18RP-高效液相層析的分析顯示用切割緩沖液B形成的產(chǎn)物包含大于90%的酰胺化C-末端而用切割緩沖液A獲得的產(chǎn)物是羧基C-末端和假定來自于intein N-末端的由單獨Cys殘基延伸的加合物的混合物(
圖1)。實施例2促黃體生成素釋放激素(LHRH)2.1克隆策略克隆除了包含LHRH編碼序列的寡核苷酸外,準確按照SCT-G中所描述的進行(Tan,L.和Rousseau,P.,Biochem.Biophys.Res.Com.1091061-1071(1982))。2.2融合蛋白表達及分析如sCT-G中所述。N-末端測序證明LHRH在N-末端通過從大腸桿菌起始信號中保留的單獨的Met殘基而延伸。2.3.融合蛋白切割和肽酰胺化LHRH融合蛋白用與sCT-G融合蛋白相同的方式處理直至最終的陽離子捕獲步驟。柱洗滌直接應用于電噴射質(zhì)量分光計并且重建數(shù)據(jù)以給出母離子的質(zhì)量(圖2)。來自于切割緩沖液B的LHRH(如實施例1所述)導致質(zhì)量1331Da伴隨Met延伸的、酰胺化的分子的母離子。來自于切割緩沖液A的LHRH(如實施例1所述)給出質(zhì)量1332Da伴隨Met延伸的游離酸的母離子。1Da的不同預計是酰胺和羧酸之間的質(zhì)量差異。實施例3人糊精的克隆來自New England BioLabs(NEB)的IMPACTI(Intein介導的以親和幾丁質(zhì)結合標記進行的純化)蛋白純化系統(tǒng)提供4個大腸桿菌表達載體,它們之間可用的克隆位點有所不同。人糊精用NEB載體pCYB1克隆,它包含NdeI位點用于翻譯起始和直接與intein相鄰的SapI位點。
人糊精序列合成為分別是115和116堿基的兩條互補單鏈寡核苷酸。優(yōu)化密碼子以在大腸桿菌中表達。兩條鏈的退火產(chǎn)生與NdeI(5’末端)和SapI位點(3’末端)互補的突出端。雙鏈寡核苷酸可直接插入到事先用NdeI和SapI消化的pCYB1中。
PCYB15’CAT ATG GCT AGC...........................GGC TCT TCC TGC TTT 3’3’GTA TAC CGA TCG...........................CCG AGA AGG AGC AAA 5’NdeISapI人糊精NdeI BspMICATATGAAATGCAACACCGCGACCTGCGCGACCCAGCGCCTGGCGGTATACTTTACGTTGTGGCGCTGGACGCGCTGGGTCGCGGACCGCMboI DdeIAACTTCCTGGTGCATAGCAGCAACAACTTCGGCGCGATCCTGAGCTTGAAGGACCACGTATCGTCGTTGTTGAAGCCGCGCTAGGACTCGAGCACCAACTGGGCAGCAACACCTATTGCTTTTCGTGGTTGACCCGTCGTTGTGGATAACGAAA實施例4在大腸桿菌中表達融合蛋白及融合蛋白純化和釋放肽的基本方法在細菌中表達需要用表達構建體使用一系列標準方法的任一方法轉化細胞(Maniatis等,同上)。細胞生長之后,常常用誘導啟動子如β-半乳糖苷酶啟動子和小分子誘導劑如IPTG的結合來誘導靶融合蛋白的表達。融合蛋白經(jīng)細胞收獲和裂解后回收并用親和層析進行純化。最經(jīng)常地,該過程包括使澄清的細胞裂解物通過具有展現(xiàn)與融合蛋白結合的配體的適當親和介質(zhì)的柱。污染物在融合蛋白特異洗脫或原位結合融合蛋白切割之前從介質(zhì)中洗去。例如,用實施例2和3所述的Impact載體,含有溶菌酶的融合蛋白將通過陽離子交換層析進行純化。在這種情況下,原位的切割可能不是選擇,除非可以發(fā)現(xiàn)切割條件并不提高融合蛋白的洗脫。在這些情況下,在溶液相中切割是需要的。對與介質(zhì)結合的融合蛋白的切割可簡化肽的隨后純化。
切割融合蛋白可通過直接加入硫醇酰基-受體如10mM DTT完成以獲得硫代-酯中間產(chǎn)物,該中間物接下來通過用pH高于6.0的氨鹽處理轉變?yōu)轷0?。通過添加適當?shù)氖荏w硫醇和氨鹽的混合物,切割和轉變?yōu)轷0返耐瑫r進行也是可能的。
然后對釋放的肽進一步純化,如果需要,可使用傳統(tǒng)的技術如溶劑分配和高效液相層析。
權利要求
1.用于生產(chǎn)肽的方法,包括以下步驟表達作為融合蛋白一部分的肽,然后通過?;荏w如含硫還原劑從融合蛋白上釋放肽。
2.如權利要求1所述的方法,其中至少部分融合蛋白是能催化肽作為?;糠洲D移給適當受體如近端硫原子以形成硫代-酯的分子
3.如權利要求1或權利要求2所述的方法,其中肽從融合蛋白釋放出來后在其羧基末端酰胺化。
4.如權利要求3所述的方法,其中酰胺化步驟在適當pH、一定來源的銨離子參與下進行。
5.如權利要求3或權利要求4所述的方法,其中酰胺化步驟與肽的釋放同時發(fā)生。
6.如權利要求1至5中任一項所述的方法,其中肽是鮭降鈣素、人降鈣素、促黃體生成素釋放激素、催產(chǎn)素、胃泌素神經(jīng)肽Y、血管升壓集、促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素、生長激素釋放激素、人降鈣素基因相關肽、胃泌素、D-tyr-trp-gly、phe-gly-phe-gly、gly-phe-gly、黑素細胞刺激激素前體、Sectetin、促甲狀腺素釋放激素、糊精、P物質(zhì)、胰多肽、縮膽囊素、胃泌素分泌因子、phe-his-ile、phe-tyr-tyr、蛙皮降壓肽、肥大細胞脫粒肽M、雨蛙肽或FMRF酰胺。
7.如權利要求6所述的方法,其中肽是鮭降鈣素或人降鈣素。
8.如權利要求2至7中任一項所述的方法,其中融合蛋白包含至少部分修飾的intein序列。
9.如權利要求8所述的方法,其中intein序列或其部分的修飾導致自剪切功能的喪失。
10.如權利要求8或權利要求9所述的方法,其中intein序列或其部分來自酵母的VMA1基因。
11.如權利要求1或權利要求2所述的方法,其中肽通過水解從融合蛋白中釋放出來。
12.如權利要求11所述的方法,其中肽是Hirulog、爪蟾抗菌肽、胸腺素α-1、腦肽、心房肽或殺菌/通透性-增加蛋白。
13.如權利要求1至12中任一項所述的方法,其中融合蛋白包含可用于通過親和或其它層析方法進行融合蛋白鑒定和/或純化的標記。
14.如權利要求13的方法,其中標記是親和標記。
15.如權利要求14所述的方法,其中親和標記包含特異幾丁質(zhì)結合區(qū)或其部分、酸性或堿性氨基酸的重復、多聚組氨酸序列、谷胱甘肽合成酶和溶菌酶。
16.如權利要求1至15中任一項所述的方法,其中融合蛋白在細菌、酵母、包括所有植物的植物組織、昆蟲細胞、哺乳動物細胞或在轉基因哺乳動物的體液中表達。
17.如權利要求15所述的方法,其中融合蛋白在大腸桿菌或枯草桿菌中表達。
18.如權利要求17所述的方法,其中融合蛋白在大腸桿菌中表達并且如果肽在其序列中不包含甲硫氨酸就用溴化氰處理肽。
19.如權利要求15所述的方法,其中融合蛋白在釀酒酵母或P.pastoralis中表達。
20.如權利要求15所述的方法,其中融合蛋白在中國倉鼠卵巢細胞或幼倉鼠腎細胞中表達。
21.如權利要求15所述的方法,其中融合蛋白在轉基因馬鈴薯組織或轉基因玉米組織中表達。
22.如權利要求15所述的方法,其中融合蛋白在轉基因豬、母牛、綿羊、山羊或兔的乳中表達。
23.如權利要求15所述的方法,其中融合蛋白在昆蟲細胞如草地夜蛾細胞中表達。
24.如權利要求1至23中任一項所述的方法,其中編碼融合蛋白的序列也包括分泌前導序列。
25.如權利要求24所述的方法,其中分泌前導序列在分泌過程中由天然加工酶去除。
26.編碼如權利要求1、2、6-15、24或25中任一項所定義的融合蛋白的DNA構建體。
27.如權利要求26所述的DNA構建體,是載體形式。
28.用如權利要求26或權利要求27所定義的DNA構建體轉化或轉染的宿主細胞。
29.如權利要求28所述的宿主細胞,通過權利要求16至21的任意一個或多個特點修飾。
30.轉基因的非人類哺乳動物,在其基因組中已摻入如權利要求26所定義的DNA構建體。
31.如權利要求29所述的轉基因哺乳動物,是轉基因豬、母牛、綿羊、山羊或兔。
全文摘要
本發(fā)明提供通過重組方法、特別地但并不僅僅進行羧基末端修飾如酰胺化作用生產(chǎn)肽的方法。
文檔編號H04L12/28GK1254379SQ98804740
公開日2000年5月24日 申請日期1998年5月1日 優(yōu)先權日1997年5月1日
發(fā)明者I·R·克丁漢姆 申請人:Ppl治療(蘇格蘭)有限公司