專利名稱:破囊壺菌、脂肪酸組合物和其制備方法及用途的制作方法
破囊壺菌、脂肪酸組合物和其制備方法及用途
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及分離的破囊壺菌(thraustochytrid)微生物及其菌株和變體。本發(fā)明還涉及破囊壺菌生物質(zhì)、微生物油、組合物、培養(yǎng)物、生產(chǎn)微生物油的方法和使用分離破囊壺菌、生物質(zhì)及微生物油的方法。
背景領(lǐng)域
脂肪酸基于碳鏈長度和飽和特性分類。短鏈脂肪酸通常具有12個(gè)碳或更少，中鏈脂肪酸通常具有14到18個(gè)碳，長鏈脂肪酸通常具有20個(gè)或更多碳。碳原子間不存在雙鍵時(shí)脂肪酸定義為飽和脂肪酸且在雙鍵存在時(shí)定義為不飽和脂肪酸。僅存在一個(gè)雙鍵時(shí)不飽和長鏈脂肪酸是單不飽和且存在大于一個(gè)雙鍵時(shí)是多不飽和。
多不飽和脂肪酸(PUFA)基于所述脂肪酸甲基末端的第一個(gè)雙鍵位置分類。 Ω-3(η-3)脂肪酸在第三個(gè)碳上包含第一個(gè)雙鍵，而Ω-6(η-6)脂肪酸在第六個(gè)碳上包含第一個(gè)雙鍵。例如，二十二碳六烯酸(“DHA")是Ω-3長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)， 具有22個(gè)碳的鏈長度和6個(gè)雙鍵，通常標(biāo)為〃 22:6 η-3 “。其他Ω-3 LC-PUFA包括標(biāo)為"20:5 η-3"的二十碳五烯酸(〃 EPA")和標(biāo)為〃 22:5 η-3"的Ω-3二十二碳五烯酸 (“DPA η-3" )。DHA和EPA定義為“必需”脂肪酸。Ω-6 LC-PUFA包括標(biāo)為〃 20:4 η_6" 的花生四烯酸(〃 ARA")和標(biāo)為〃 22:5 η-6〃的Ω-6 二十二碳五烯酸(〃 DPA η_6〃)。
Ω-3脂肪酸是生物學(xué)上重要的分子，由于其在細(xì)胞膜的存在而影響細(xì)胞生理學(xué)， 調(diào)節(jié)生物活性化合物的生成和基因表達(dá)，且用作生物合成底物。Roche，H. Μ.，Proc. Nutr. Soc. 58 :397-401 (1999)。例如，DHA占人大腦皮層中脂質(zhì)的約15% _20%、視網(wǎng)膜中脂質(zhì)的約30%-60%，其集中于睪丸和精液中，且是乳汁中的重要成分。Jean-Pascal Berge 和Gilles Barnathan，“來自海洋生物脂質(zhì)的脂肪酸分子生物多樣性，作為生物標(biāo)記的作用，生物活性化合物和經(jīng)濟(jì)方面”(Fatty Acids from Lipids of Marine Organisms Molecular Biodiversity, Roles as Biomarkers, Biologically Active Compounds, and Economical Aspects)，《海 # L *》(Marine Biotechnology) I 49 (T. Scheper H, 2005)。DHA占大腦中Ω-3脂肪酸的多達(dá)97%和視網(wǎng)膜中Ω-3脂肪酸的多達(dá)93%。此夕卜， DHA對胎兒和嬰兒發(fā)育以及維持成人中的認(rèn)知功能是必需的。同上。包括DHA和EPA在內(nèi)的 Ω-3脂肪酸也具有抗炎特性。參見例如同上以及Simopoulos，A.P.，J.Am. Coll.Nutr. 21 495-595(2002)。由于Ω-3脂肪酸不在人體內(nèi)從頭合成，這些脂肪酸必須獲得自營養(yǎng)源。
亞麻籽油和魚油被視作Ω -3脂肪酸的良好膳食來源。亞麻籽油不含EPA、DHA、DPA 或ARA，但含有能使身體生成EPA的基礎(chǔ)成分亞麻酸(C18:3 η-3) 0然而，有證據(jù)顯示代謝轉(zhuǎn)化率可以較慢且可變，特別是在健康受損的機(jī)體中。魚油在脂肪酸組成的類型和水平上差異很大，這取決于具體物種和其飲食。例如，水產(chǎn)養(yǎng)殖的魚往往Ω-3脂肪酸水平低于野生魚。此外，魚油具有含環(huán)境污染物的風(fēng)險(xiǎn)并可能涉及穩(wěn)定性問題和魚腥味或口味。
破囊壺菌是破囊壺菌目(Thraustochytriales)微生物。破囊壺菌包括裂殖壺菌屬(khizochytrium)的成員且被認(rèn)為是包括DHA在內(nèi)的Ω-3脂肪酸的替代來源。參見美國專利第5，130，242號(hào)。這些海洋異養(yǎng)微生物生成的油通常具有比相應(yīng)魚或微藻油更簡單的多不飽和脂肪酸分布。Lewis, Τ. Ε.，Mar. Biotechnol. 1 :580-587 (1999)。據(jù)報(bào)道，破囊壺菌菌株以該生物體所產(chǎn)生總脂肪酸的高百分比生成Ω-3脂肪酸。美國專利第 5，130，242 號(hào)；Huang，J.等，J. Am. Oil. Chem. Soc. 78 :605-610(2001) ；Huang, J.等，Mar. Biotechnol. 5 =450-457(2003)。然而，分離的破囊壺菌在生成LC-PUFA的特性和量上不同， 從而一些前述菌株可能具有的Ω-6脂肪酸水平不理想和/或在培養(yǎng)中表現(xiàn)出低生產(chǎn)率。由此，從營養(yǎng)源中分離出證明有高生產(chǎn)率和理想LC-PUFA分布的破囊壺菌的需求一直存在。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及以ATCC登錄號(hào)ΡΤΑ-9695保藏的破囊壺菌物種的分離破囊壺菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的二十碳五烯酸。
本發(fā)明也涉及具有以ATCC登錄號(hào)ΡΤΑ-9695保藏的破囊壺菌物種特征的分離破囊壺菌微生物，其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的二十碳五烯酸。
本發(fā)明也涉及含有甘油三酯組分的分離破囊壺菌微生物或其衍生菌株，其中所述甘油三酯組分的二十二碳六烯酸含量為至少約40重量％，其中所述甘油三酯組分的二十二碳五烯酸η-6含量為至少約0. 5重量％ -約6重量％，且其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的二十碳五烯酸。
本發(fā)明也涉及與以ATCC登錄號(hào)ΡΤΑ-9695保藏的破囊壺菌物種同種的分離破囊壺菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％ 或更少的二十碳五烯酸。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明衍生自分離破囊壺菌微生物的菌株是突變菌株。
本發(fā)明也涉及以ATCC 登錄號(hào) ΡΤΑ-9695、ΡΤΑ-9696、ΡΤΑ-9697 或 ΡΤΑ-9698 保藏的分離微生物。
本發(fā)明也涉及含任意一種本發(fā)明破囊壺菌微生物或其混合物的破囊壺菌生物質(zhì)。
本發(fā)明也涉及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中至少約50重量％的生物質(zhì)細(xì)胞干重是脂肪酸，且其中至少約50重量％的脂肪酸是Ω-3脂肪酸。在一些實(shí)施方式中，至少約50 重量％的脂肪酸是二十二碳六烯酸。本發(fā)明還涉及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中至少約25 重量％的生物質(zhì)細(xì)胞干重是二十二碳六烯酸。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明也涉及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中約10重量％或更少的脂肪酸是二十碳五烯酸，且其中二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸的重量比為至少約 5 I0
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明也涉及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中約1.5重量％ 或更少的脂肪酸是花生四烯酸，且其中二十二碳六烯酸與花生四烯酸的重量比為至少約 20 1。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明也涉及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其含有的二十二碳六烯酸與二十二碳五烯酸η-6的重量比為至少約10 1。
本發(fā)明也涉及含任意一種本發(fā)明破囊壺菌微生物或其混合物的分離破囊壺菌培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)物包括至少約5%的溶解氧。
本發(fā)明也涉及用于動(dòng)物或人的食品、化妝品或藥物組合物，其包含本發(fā)明破囊壺菌微生物或生物質(zhì)中的任何一種或其混合物。
本發(fā)明也涉及含有至少約70重量％甘油三酯組分的微生物油，其中所述甘油三酯組分的二十二碳六烯酸含量為至少約50重量％，其中所述甘油三酯組分的二十二碳五烯酸n-6含量為約0. 5重量％ -約6重量％。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油還包括占所述甘油三酯組分約1. 5重量％或更少的花生四烯酸含量。
本發(fā)明也涉及含有至少約70重量％甘油三酯組分的微生物油，其中所述甘油三酯組分的二十二碳六烯酸含量為至少約40重量％，其中所述甘油三酯組分的二十二碳五烯酸n-6含量為至少約0. 5重量％ -約6重量％，且其中二十二碳六烯酸與二十二碳五烯酸n-6的比例為大于約6 1。
本發(fā)明也涉及含有至少約70重量％甘油三酯組分的微生物油，其中所述甘油三酯組分的二十二碳六烯酸含量為至少約60重量％。
在一些實(shí)施方式中，所述微生物油甘油三酯組分的至少約20%甘油三酯在所述甘油三酯內(nèi)的兩個(gè)位置上含有二十二碳六烯酸，所述位置選自sn-1、sn-2和sn-3位置中的任意兩個(gè)。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油甘油三酯組分的至少約5%甘油三酯在所述甘油三酯中sn-1、sn-2和sn-3三個(gè)位置都含有二十二碳六烯酸。
在一些實(shí)施方式中，所述微生物油還包括約5重量％或更少的十七酸。
本發(fā)明也涉及用于動(dòng)物或人的食品、化妝品或藥物組合物，其包含本發(fā)明的任何微生物油。在一些實(shí)施方式中，所述食品是嬰兒配方。在一些實(shí)施方式中，所述嬰兒配方適合早產(chǎn)兒。在一些實(shí)施方式中，所述食品是牛奶、飲料、治療性飲品、營養(yǎng)素飲料或其組合。 在一些實(shí)施方式中，所述食品是用于動(dòng)物或人食物的添加劑。在一些實(shí)施方式中，所述食品是營養(yǎng)補(bǔ)充品。在一些實(shí)施方式中，所述食品是動(dòng)物飼料。在一些實(shí)施方式中，所述動(dòng)物飼料是水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。在一些實(shí)施方式中，所述動(dòng)物飼料是牲畜飼料、動(dòng)物園動(dòng)物飼料、役畜飼料、家畜飼料或其組合。
本發(fā)明也涉及含Ω-3脂肪酸的微生物油的生產(chǎn)方法，該方法包括(a)使本發(fā)明的任何一種分離破囊壺菌微生物或其混合物在培養(yǎng)物中生長以生成生物質(zhì)，和(b)從所述生物質(zhì)中提取含Ω-3脂肪酸的油。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)物包括至少約5%的溶解氧。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)物PH維持在約6. 5-約8.5。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)物溫度維持在約17°C -約30°C。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)物包括約5g/L-約50g/L 濃度的葡萄糖。
本發(fā)明也涉及含Ω-3脂肪酸的微生物油的生產(chǎn)方法，該方法包括從本發(fā)明任何一種生物質(zhì)中提取含Ω-3脂肪酸的油。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油用己烷提取方法提取。在一些實(shí)施方式中，微生物油用無溶劑提取方法提取。
在一些實(shí)施方式中，在ρΗ約6. 5-約8. 0的培養(yǎng)基中約17°C -約30°C生長7天后， 從每升本發(fā)明任何培養(yǎng)物中分離的生物質(zhì)干細(xì)胞重為至少約50g，所述培養(yǎng)基包含碳、氮和營養(yǎng)源及約950ppm-約8500ppm氯離子。
在一些實(shí)施方式中，在ρΗ約6. 5-約8. 0的培養(yǎng)基中約17°C -約30°C生長7天后， 本發(fā)明的任何一種分離培養(yǎng)物的Ω -3脂肪酸生產(chǎn)率為至少約2克/升/天，所述培養(yǎng)基包含碳源、氮源和營養(yǎng)素及約950ppm-約8500ppm氯離子。
本發(fā)明也涉及通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的微生物油。[0033]本發(fā)明也涉及采用本發(fā)明的任何分離微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物生產(chǎn)治療炎癥或其相關(guān)病癥的藥物。
本發(fā)明也涉及采用本發(fā)明的任何分離微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物治療炎癥或其相關(guān)病癥。
本發(fā)明也涉及用于治療炎癥或其相關(guān)病癥的本發(fā)明的任何分離微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物。
本發(fā)明也涉及在需要的對象中治療炎癥或其相關(guān)病癥的方法，包括將本發(fā)明的任何分離微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物以及藥學(xué)上可接受載體給予對象。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及分離的破囊壺菌微生物及其菌株和突變體，以及其生物質(zhì)、微生物油、 組合物和培養(yǎng)物。本發(fā)明還涉及從本發(fā)明的破囊壺菌生成微生物油的方法和使用破囊壺菌、生物質(zhì)及微生物油的方法。本文所述的破囊壺菌與現(xiàn)有分離物相比較高產(chǎn)，并生成獨(dú)特脂肪酸分布，其部分特征是高水平的Ω-3脂肪酸，具體是高水平的DHA。
破囊壺菌微生物
本發(fā)明涉及分離的破囊壺菌，包括其突變體、重組體和變體。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及以ATCC登錄號(hào)ΡΤΑ-9695保藏的破囊壺菌。所述分離的破囊壺菌在本文中也稱為裂殖壺菌(Schizochytrium)ATCC ΡΤΑ-9695。ATCC登錄號(hào) ΡΤΑ-9695相關(guān)破囊壺菌于2009年1月7日根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，專利保藏所(Patent D印ository)，弗吉尼亞州馬納薩斯大學(xué)大道10801,20110-2209)。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及以ATCC登錄號(hào)ΡΤΑ-9695保藏的分離的破囊壺菌菌株。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及與以ATCC登錄號(hào)ΡΤΑ-9695保藏的破囊壺菌同種的分離破囊壺菌微生物。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及具有以ATCC登錄號(hào)ΡΤΑ-9695保藏的破囊壺菌特征的分離破囊壺菌微生物或其衍生菌株。以ATCC登錄號(hào)ΡΤΑ-9695保藏的破囊壺菌的特征包括生長和表型特征(表型特征例子包括形態(tài)和增殖特性)、其物理和化學(xué)性質(zhì)(如干重和脂質(zhì)分布)和其基因序列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離破囊壺菌具有與以ATCC登錄號(hào)ΡΤΑ-9695保藏的破囊壺菌幾乎相同的表型特征。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離破囊壺菌具有與以ATCC登錄號(hào)ΡΤΑ-9695保藏的破囊壺菌幾乎相同的生長特性。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的分離破囊壺菌的突變體、變體或重組體， 其中所述突變體、變體或重組體生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的二十碳五烯酸。 突變菌株可通過熟知的方法生成。常用方法包括輻射；高溫處理；誘變劑處理。變異菌株可以是本文所述物種的其他天然產(chǎn)生的分離物和/或亞分離物。重組菌株可通過分子生物學(xué)中表達(dá)外源基因或改變內(nèi)源基因功能或表達(dá)的熟知方法生成。在一些實(shí)施方式中，所述突變、變異或重組菌株比野生型菌株產(chǎn)生更高量的Ω-3脂肪酸，包括DHA和/或ΕΡΑ。在一些實(shí)施方式中，所述突變、變異或重組菌株產(chǎn)生較低量的一種或多種脂肪酸，如較低量的ΕΡΑ、 ARA, DPA η-6或其組合。在一些實(shí)施方式中，在每升培養(yǎng)物中，所述突變、變異或重組菌株產(chǎn)生比野生型菌株更大的細(xì)胞干重。這些突變、變異或重組菌株是本發(fā)明的分離破囊壺菌衍生菌株的例子。
8[0045]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及以ATCC登錄號(hào)PTA-9695保藏的破囊壺菌突變菌株。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述突變菌株是以ATCC登錄號(hào)PTA-9696、PTA-9697或 PTA-9698保藏的菌株。ATCC登錄號(hào)PTA-9696、PTA-9697和PTA-9698相關(guān)破囊壺菌菌株于2009年1月7日根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于美國模式培養(yǎng)保藏所，專利保藏所(Intent D印ository)，弗吉尼亞州馬納薩斯大學(xué)大道10801，20110-2209。這些保藏的突變菌株是以 ATCC登錄號(hào)PTA-9695保藏的破囊壺菌的衍生物。
在一些實(shí)施方式中，包括突變體、變體或重組體在內(nèi)的本發(fā)明的分離破囊壺菌包括分離自破囊壺菌的一個(gè)或多個(gè)組分的脂肪酸分布。所述分離自破囊壺菌的一個(gè)或多個(gè)組分包括總脂肪酸組分、留醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、留醇組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分)和其組合。
破囊壺菌培養(yǎng)物和分離的破囊壺菌生物質(zhì)
本發(fā)明還涉及含一種或多種本發(fā)明的分離破囊壺菌的培養(yǎng)物。接種、培養(yǎng)和回收微菌落的不同發(fā)酵參數(shù)在本領(lǐng)域已知，如美國專利第5，130，242號(hào)所述?？墒褂萌魏纬Ｒ?guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)破囊壺菌。液體或固體培養(yǎng)基可包含天然或人工海水。碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、巖藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、脂肪、油、甘油、 醋酸鈉和甘露醇。氮源包括但不限于蛋白胨、酵母膏、多價(jià)蛋白胨、麥芽膏、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米漿、有機(jī)氮源、谷氨酸鈉、尿素、無機(jī)氮源、乙酸銨、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硫酸鈉。一種典型的培養(yǎng)基示于表1
表1 容器培養(yǎng)基
成分濃度范圍
NaClg/L 12.50-25，5-20，或 10-15
KClg/L 1.00-5，0.25-3,或 0.5-2
MgS04'7H20 g/L 5.00-10, 2-8,或 3-6
(NH4)2SO4 g/L 0.60-10, 0.25-5,或 0.5-3
CaCl2g/L 0.290.1-5，0.15-3,或 0.2-1
T 154(酵母膏)g/L6.00-20,1-15，或 5-10
KH2PO4g/L 1.20.1-10，0.5-5，或 1-3
高壓滅菌后(金屬)
檸檬酸mg/L 3.50.1-100, 1-50,或 2-25
FeSO4 TH2O mg/L 10.300.1-100, 1-50，或 5-25
MnCl2.4H20 mg/L 3.100.1-100, 1-50,或 2-25
ZnSO4 TH2O mg/L 3.100.1-100，1-50,或 2-25
CoCl2-6H20 mg/L 0.040.001-1，0.005-0.5,或 0.01-0.1
Na2MoO4-2H20 mg/L 0.040.001-1, 0.005-0.5,或 0.01-0.1
CuSO4-5H20 mg/L 2.070.1-100, 0.5-50,或 1-25
NiSO4.6H20 mg/L 2.070.1-100，0.5-50，或 1-25
高壓滅菌后(維生素)
硫胺素** mg/L 9.750.1-100, 1-50,或 5-25
維生素 B12** mg/L 0.160.1-100, 0.1-10,或 0.1-1
CaV2-泛酸鹽** mg/L 3.330.1-100, 0.1-50,或 1-10
高壓滅菌后(碳)
葡萄糖g/L 30.05-150, 10-100，或 20-50
氮供料
成分濃度
NH4OH mL/L 21.6 0-150, 10-100,或 15-50
典型的培養(yǎng)條件包括下列
pH約 6.5-約 8.5,約 6.5-約 8.0，或約 7.0-約 7.5
溫度約17-約30攝氏度，約20-約25攝氏度，
或約22-約23攝氏度 溶解氧約5-約100%飽和，約10-約80%飽和，
或約20-約50%飽和 控制葡萄糖 :約5-約50 g/L，約10-約40 g/L,或約20-約35 g/L。
在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包括至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %或至少約90 %溶解氧(作為飽和水平的百分比)。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包括約5%-約20%、約 5% -約 50%、約 5% -約 100%、約 10% -約 20%、約 10% -約 50%、約 10% -約 100%、 約20% -約50%、或約20% -約100%溶解氧(作為飽和水平的百分比)。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明破囊壺菌的分離生物質(zhì)。本發(fā)明的分離破囊壺菌生物質(zhì)是通過分離破囊壺菌生物質(zhì)的任何常規(guī)方法獲得的收集細(xì)胞生物質(zhì)，如美國專利第5，130，242 號(hào)和美國申請公開號(hào)2002/0001833所述。
在一些實(shí)施方式中，在pH約6. 5-約8. 5的培養(yǎng)基中約17°C -約30°C生長約7 天后，分離自每升培養(yǎng)物的生物質(zhì)細(xì)胞干重為至少約50g、至少約60g、至少約70g、至少約 80g、至少約100g、至少約120g、至少約140g、至少約160g、至少約180g、或至少約200g，所述培養(yǎng)基包含碳、氮和營養(yǎng)源及約950ppm-約8500ppm氯離子。在一些實(shí)施方式中，在pH約 6. 5、約7、約7. 5、約8. 0或約8. 5的培養(yǎng)基中約17°C、約18°C、約19°C、約20°C、約21°C、 約 22°C、約 23°C、約 M°C、約 25°C、約 ^°C、約 27°C、約 ^°C、約 ^°C、或約 30°C生長約 7 天后，分離自每升培養(yǎng)物的生物質(zhì)細(xì)胞干重為至少約50g、至少約60g、至少約70g、至少約 80g、至少約100g、至少約120g、至少約140g、至少約160g、至少約180g、或至少約200g，所述培養(yǎng)基包含碳、氮和營養(yǎng)源及約950ppm-約8500ppm氯離子。在一些實(shí)施方式中，在pH 約6. 5-約8. 5的培養(yǎng)基中約17°C -約30°C生長約7天后，分離自每升培養(yǎng)物的生物質(zhì)細(xì)胞干重為約50g-約200g，所述培養(yǎng)基包含碳、氮和營養(yǎng)源及約950ppm-約8500ppm氯離子。 在一些實(shí)施方式中，在PH約6. 5、約7、約7. 5、約8. 0或約8. 5的培養(yǎng)基中約17°〇、約181、 約 19°C、約 20°C、約 21°C、約 22°C、約 23°C、約 M°C、約 25°C、約 ^°C、約 27°C、約 ^°C、約 ^°C、或約30°C生長約7天后，分離自每升培養(yǎng)物的生物質(zhì)細(xì)胞干重為約50g-約200g，所述培養(yǎng)基包含碳、氮和營養(yǎng)源及約950ppm-約8500ppm氯離子。
在一些實(shí)施方式中，分離的破囊壺菌培養(yǎng)物在pH約6. 5-約8. 5的培養(yǎng)基中約 17°C -約30°C生長約7天后Ω -3脂肪酸生產(chǎn)率為至少約2克/升/天、至少約4克/升/ 天、或至少約8克/升/天，所述培養(yǎng)基包含碳、氮和營養(yǎng)源及約950ppm-約8500ppm氯離子。在一些實(shí)施方式中，分離的破囊壺菌培養(yǎng)物在PH約6. 5-約8. 5的培養(yǎng)基中約17°C -約 30 0C生長約7天后Ω -3脂肪酸生產(chǎn)率為約1克/升/天-約20克/升/天、約2克/升/ 天-約15克/升/天、約2克/升/天-約10克/升/天、約3克/升/天-約10克/升 /天、或約4克/升/天-約9克/升/天，所述培養(yǎng)基包含碳、氮和營養(yǎng)源及約950ppm-約 8500ppm氯離子。
在一些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵體積(培養(yǎng)體積)為至少約2升、至少約10升、至少約50升、至少約100升、至少約200升、至少約500升、至少約1000升、至少約10，000升、至少約20，000升、至少約50，000升、至少約100，000升、至少約150，000升、至少約200，000 升、或至少約250，000升。在一些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵體積是約2升-約300，000升，約 2升、約10升、約50升、約100升、約200升、約500升、約1000升、約10，000升、約20，000 升、約 50，000 升、約 100，000 升、約 150，000 升、約 200，000 升、約 250，000 升、或約 300，000 升。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含本發(fā)明脂肪酸分布的分離破囊壺菌生物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，至少約50%、至少約60 %、至少約70 %或至少約80 %的生物質(zhì)細(xì)胞干重是脂肪酸。在一些實(shí)施方式中，大于約50%、大于約55%或大于約60%的生物質(zhì)細(xì)胞干重是脂肪酸。在一些實(shí)施方式中，約50% -約60%、約50% -約70%、約50% -約80%、約 55 % -約70 %、約55 % -約80 %、約60 % -約70 %、或約60 % -約80 %重量的生物質(zhì)細(xì)胞干重是脂肪酸。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)中至少約50%、至少約60%、至少約70%或至少約80%重量的脂肪酸是Ω-3脂肪酸。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)中約50%-約 60 %、約50% -約70%、約50% -約80%重量的脂肪酸是Ω-3脂肪酸。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)中至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%重量的脂肪酸是DHA。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)中至少約 50% -約60%、約50% -約70%、或約50% -約80%重量的脂肪酸是DHA。在一些實(shí)施方式中，至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、或至少約60%重量的生物質(zhì)細(xì)胞干重是二十二碳六烯酸。在一些實(shí)施方式中，約25% -約65%、約25% -約50%、約 30% -約40%、或約25% -約35%重量的生物質(zhì)細(xì)胞干重是二十二碳六烯酸。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)中約10 %或更少、約9 %或更少、約8 %或更少、約7 %或更少、約6 %或更少、約5 %或更少、約4 %或更少、約3 %或更少、約2 %或更少、或約1 %或更少重量的脂肪酸是ΕΡΑ。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)中約-約10%、約-約5%、約2% -約 5 %、約3 % -約5 %、或約3 % -約10 %重量的脂肪酸是ΕΡΑ。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)中幾乎沒有ΕΡΑ。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)包含的DHA與EPA重量比為至少約 5 1、至少約7 1、至少約10 1、至少約11 1、至少約14 1、至少約15 1、至少約 17 1、至少約20 1、至少約25 1、至少約50 1、或至少約100 1，其中所述生物質(zhì)中約10%或更少重量的脂肪酸是ΕΡΑ。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)中約0. 1 % -0. 2%、 約 0. 1%-約0.3%、約0. 1%-約0.4%、約0. -約 0. 5%、或約 0. 1%-約 1.5%重量的脂肪酸是ARA。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)中約1.5%或更少、約或更少、約0.5% 或更少、約0. 4%或更少、約0. 3 %或更少、約0. 2 %或更少、或約0. 1 %或更少重量的脂肪酸是ARA。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)幾乎沒有ARA。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)包含的DHA與ARA重量比為至少約20 1、至少約40 1、至少約60 1、至少約80 1、 至少約100 1、至少約150 1、至少約200 1、至少約250 1、或至少約300 1。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)中約0. 5% -約1%、約0. 5% -約2%、約0. 5% -約5%、約 0. 5% -約6%、約-約5%、約-約6%、約2% -約5%、或約2% -約6%重量的脂肪酸是DPA η-6。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)中約6 %或更少、約5 %或更少、約2 %或更少、約或更少、或約0.5%或更少重量的脂肪酸是DPA η-6。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)幾乎沒有DPA η-6。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)包含的DHA與DPA η_6重量比為大
12于約6 1、至少約8 1、至少約10 1、至少約15 1、至少約20 1、至少約25 1、 至少約50 1、或至少約100 1。在一些實(shí)施方式中，所述生物質(zhì)包含脂肪酸，其具有各自占約5 %或更少、約4 %或更少、約3 %或更少、或約2 %或更少重量的亞油酸(18:2 n-6)、 亞麻酸(18:3 n-3)、二十烯酸 00:1 n_9)和芥酸 02:1 n_9)。
本發(fā)明的分離生物質(zhì)的特征與分離生物質(zhì)的內(nèi)源或天然特性，而不是外源引入物質(zhì)相關(guān)。
微生物油
本發(fā)明還涉及生成微生物油的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括使本發(fā)明的破囊壺菌在培養(yǎng)物中生長以生成生物質(zhì)并從該生物質(zhì)中提取含Ω-3脂肪酸的油。所述油可從新收集的生物質(zhì)中提取或從以前收集的在防止酸敗條件下保存的生物質(zhì)中提取?？刹捎靡阎椒ㄅ囵B(yǎng)本發(fā)明的破囊壺菌，從培養(yǎng)物中分離生物質(zhì)，從該生物質(zhì)中提取微生物油，并分析從該生物質(zhì)提取的油的脂肪酸分布。參見例如美國專利第5，130，242號(hào)。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明脂肪酸分布的微生物油。本發(fā)明的微生物油可以是衍生自微生物的任何油，包括例如從所述微生物生物質(zhì)提取而沒有進(jìn)一步加工的粗油；用進(jìn)一步加工步驟如精煉、漂白和/或脫臭處理粗微生物油獲得的精制油；通過稀釋粗制或精制微生物油獲得的稀釋微生物油；或者例如用更多純化方法處理粗制或精制微生物油以增加油中脂肪酸(如DHA)濃度而獲得的富集油。
在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括約0%、至少約0. 1%、至少約0. 2%、至少約0.5%、至少約1%、至少約1.5%、至少約2%、或至少約5%重量的留醇酯組分。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括約0% -約1.5%、約0%-約2%、約0%-約5%、約
-約1. 5%、約0. 2% -約1. 5%、約0. 2% -約2%、或約0. 2% -約5%重量的甾醇酯組分。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括小于約5%、小于約4%、小于約3%、或小于約 2%重量的留醇酯組分。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括至少約65%、至少約70%、 至少約75%、至少約80%、至少約85%、或至少約90%重量的甘油三酯組分。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括約65% -約95%、約75% -約95%或約80% -約95%重量，或約97%重量或約98%重量的甘油三酯組分。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括至少約0. 5%、至少約1%、至少約1. 5%、至少約2%、至少約2. 5%、或至少約5%重量的游離脂肪酸組分。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括約0.5% -約5%、約0.5% -約2.5%、 約 0. 5% -約 2%、約 0. 5% -約 1. 5%、約 0. 5% -約 1%、約 -約 2. 5%、約 -約 5 %、約1. 5 % -約2. 5 %、約2 % -約2. 5 %、或約2 % -約5 %重量的游離脂肪酸組分。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括小于約5%、小于約4%、小于約3%、小于約2%、或小于約重量的游離脂肪酸組分。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括至少約0. 5%、至少約1%、至少約1.5%、至少約2%、或至少約5%重量的甾醇組分。在一些實(shí)施方式中， 所述微生物油包括約0. 5% -約1. 5%、約-約1. 5%、約0. 5% -約2%、約0. 5% -約 5%、約1%-約2(%、或約1(%-約5%重量的甾醇組分。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括小于約5%、小于約4%、小于約3%、小于約2%、或小于約重量的甾醇組分。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括至少約1. 5%、至少約2%、至少約2. 5%、至少約3%、至少約3. 5%、或至少約5%重量的甘油二酯組分。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括約 1. 5% -約 3%、約 2% -約 3%、約 1. 5% -約 3. 5%、約 1. 5% -約 5%、約 2. 5% -約 3%、約2. 5% -約3. 5%、或約2. 5% -約5%重量的甘油二酯組分。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括小于約2%、小于約1.5%、小于約1%、或小于約0.5%重量油的不皂化物。存在于所述微生物油中的脂類如甘油三酯組分，可通過快速層析分離并通過薄層層析(TLC) 分析，或通過本領(lǐng)域已知的其他方法分離和分析。
在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或其選自甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、 甾醇組分、甘油二酯組分和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包括至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、或至少約80% 重量的DHA。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或其選自甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、甾醇組分、甘油二酯組分和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包括約40%-約45%、約40%-約 50%、約 40% -約 60%、約 50% -約 60%、約 55%-約 60%、約 40% -約 65%、約 50% -約 65%、約 55% -約 65%、約 40% -約 70%、約 40% -約 80%、約 50% -約 80%、約 55% -約 80 %、約60 % -約80 %、或約70 % -約80 %重量的DHA。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油含有的留醇酯組分包括約45 %或更少、約40 %或更少、約35 %或更少、約30 %或更少、約 25%或更少、約20%或更少、約15%或更少、或約13%或更少重量的DHA。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、留醇組分、甘油二酯組分和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包括約10%或更少、約9%或更少、約8%或更少、約7%或更少、 約6 %或更少、約5 %或更少、約4 %或更少、約3 %或更少、約2 %或更少、或約1 %或更少重量的EPA。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、甾醇組分、甘油二酯組分和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包括約2% -約3%、約2% -約3. 5%, 約 2. 5% -約 3. 5%、2% -約 6%、約 2. 5% -約 6%、約 3. 0% -約 6%、約 3. 5% -約 6%、 約5% -約6%、或約2% -約10%重量的EPA。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自留醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、留醇組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分)和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分幾乎沒有EPA。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自留醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、留醇組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分)和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包含的DHA與EPA的重量比為至少約 5 1、至少約7 1、至少約9 1、至少約10 1、至少約15 1、至少約20 1、至少約 25 1、至少約30 1、或至少約50 1，其中所述微生物油和/或其一個(gè)或多個(gè)組分包括 10%或更少重量的EPA。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自甾醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、留醇組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分)和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包含的DHA與EPA的重量比為至少5 1，但小于約20 1。在一些實(shí)施方式中，DHA與EPA的重量比為約5 1-約18 1、約7 1-約16 1、或約10 1-約 15 1。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自留醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、留醇組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分)和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包括約 0. -約 0. 25%、約 0. 2% -約 0. 25%、約 0. -約 0. 5%、或約 0. -約 1. 5% 重量的ARA。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自留醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、留醇組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分)和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包括約1. 5%或更少、約或更少、約0. 5%或更少、約0. 2%或更少、或約0. 或更少重量的ARA。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自留醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、留醇組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分)和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分幾乎沒有ARA。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自留醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分)和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包含的DHA與ARA的重量比為至少約20 1、至少約30 1、至少約35 1、至少約 40 1、至少約60 1、至少約80 1、至少約100 1、至少約150 1、至少約200 1、 至少約250 1、或至少約300 1。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自留醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、留醇組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分) 和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包括約0. 5%-約1%、約0.5%-約2%、約0.5%-約2.5%、約 0. 5% -約 3%、約 0.5% -約 3.5%、約 0.5% -約 5%、約 0.5% -約 6%、約 -約 2%、 約 2% -約 3%、約 2% -約 3. 5%、約 -約 2. 5%、約 -約 3%、約 -約 3. 5%、約 -約5%、或約-約6%重量的DPA n-6。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自留醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、留醇組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分)和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包括約6%或更少、約5%或更少、約3%或更少、 約2. 5%或更少、約2%或更少、約或更少、或約0.5%或更少重量的DPA n_6。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自留醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、甾醇組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分)和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分幾乎沒有DPA n-6。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自留醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、留醇組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分)和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包含的DHA與DPA n-6的重量比大于約6 1，至少約8 1、至少約10 1、至少約15 1、至少約20 1、至少約25 1、至少約50 1、或至少約100 1。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自留醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、留醇組分、甘油二酯組分、 極性組分(包括磷脂組分)和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包括各自占約5%或更少、約4%或更少、約3 %或更少、約2 %或更少、約1. 5 %或更少、約1 %或更少、或約0. 5 %或更少重量的亞油酸(18:2 n-6)、亞麻酸(18:3 n_3)、二十烯酸QO:1 n_9)和芥酸02:1 n_9)。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或選自留醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、甾醇組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分)和其組合的一個(gè)或多個(gè)組分包括約5%或更少、約4 %或更少、約3 %或更少、約2 %或更少、約1. 5 %或更少、約1 %或更少重量的十七酸(17:0)。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油和/或其一個(gè)或多個(gè)組分包括約0.01%-約 5%、約0. 05% -約3%、或約0. -約重量的十七酸。
所述甘油三酯分子包含3個(gè)中心碳原子((^331-(^332-(^3 ! )，可形成不同的位置異構(gòu)體。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括甘油三酯組分，所述甘油三酯組分中至少約20%、至少約30%、至少約35%、或至少約40%的甘油三酯在該甘油三酯內(nèi)兩個(gè)位置(選自sn-l、sn-2和sn-3位置中的任意兩個(gè))上含有DHA(雙取代DHA)，這是基于HPLC 色譜儀的相對峰面積百分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括甘油三酯組分，所述甘油三酯組分中至少約20 % -約40 %、約20 % -約；35 %、約30 % -約40 %、或約30 % -約 35%的甘油三酯在該甘油三酯內(nèi)兩個(gè)位置(選自sn-1、sn-2或sn-3位置中的任意兩個(gè)) 上含有DHA，這是基于HPLC色譜儀的相對峰面積百分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括甘油三酯組分，所述甘油三酯組分中至少約5%、至少約10%、至少約15%、或至少約 20 %的甘油三酯在所有sn-1、sn-2和sn-3位置上含有DHA (三取代DHA)，這是基于HPLC色譜儀的相對峰面積百分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括甘油三酯組分，所述甘油三酯組分中至少約5% -約20%、約5% -約15%、約10% -約20%、或約10% -約15% 的甘油三酯在所有sn-l、Sn-2和sn-3位置上含有DHA，這是基于HPLC色譜儀的相對峰面積百分?jǐn)?shù)。相反，美國專利第6，582，941號(hào)報(bào)道的TAG物質(zhì)在所有3個(gè)位置上不含DHA。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括甘油三酯組分，所述甘油三酯組分中至少約50%、至少約 55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、或至少約75 %的甘油三酯在甘油三酯內(nèi)選自任一 sn-1、sn-2或sn-3位置的一個(gè)位置上含有DHA，這是基于HPLC色譜儀的相對峰面積百分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方式中，所述微生物油包括甘油三酯組分，所述甘油三酯組分中至少約 50% -約 75%、約 50% -約 70%、約 50% -約 65%、約 60% -約 75%、約 60% -約 70%、 或約60% -約65%的甘油三酯在甘油三酯內(nèi)選自任一 sn-1、sn-2和sn-3位置的一個(gè)位置上含有DHA，這是基于HPLC色譜儀的相對峰面積百分?jǐn)?shù)。
組合物
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明破囊壺菌、本發(fā)明分離生物質(zhì)、本發(fā)明微生物油、或其組合的組合物。
本發(fā)明的破囊壺菌、生物質(zhì)或微生物油可通過任何已知技術(shù)根據(jù)組合物需求而進(jìn)行進(jìn)一步化學(xué)或物理修飾或加工。
破囊壺菌細(xì)胞或生物質(zhì)可在用于組合物前干燥，方法包括但不限于冷凍干燥、空氣干燥、噴霧干燥、隧道干燥、真空干燥(凍干)或類似方法?；蛘撸镔|(zhì)經(jīng)收獲和清洗后能直接用于組合物而不需干燥。參見美國專利第5，130，242和6，812，009號(hào)。
本發(fā)明的微生物油可用作起始材料以更有效生成富含脂肪酸如DHA的產(chǎn)物。例如，可對本發(fā)明的微生物油應(yīng)用本領(lǐng)域已知的不同純化技術(shù)如蒸餾或尿素加合，以生成具有更高濃度DHA或其他脂肪酸的更高效產(chǎn)物。本發(fā)明的微生物油也可用于化學(xué)反應(yīng)以生成所述油中脂肪酸的衍生化合物，如DHA或其他脂肪酸的酯和鹽。
本發(fā)明的組合物可包括一種或多種賦形劑。本文使用的“賦形劑”指用于本發(fā)明組合物以使該組合物具有理想特征的成分或成分的混合物，該組合物包括食物以及藥物、 化妝品和工業(yè)組合物。本發(fā)明的賦形劑加入藥物組合物時(shí)可描述為“藥學(xué)上可接受”的賦形劑，意味著所述賦形劑是在全面醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)以相應(yīng)合理益處/風(fēng)險(xiǎn)比在所需接觸持續(xù)期間適于接觸人和動(dòng)物組織而無過度毒性、刺激、過敏反應(yīng)或其他問題性并發(fā)癥的化合物、物質(zhì)、組合物、鹽和/或劑型。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受”指聯(lián)邦或州政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或者美國藥典(U. S. Pharmacopeia)或其他國際公認(rèn)藥典中列出用于動(dòng)物， 更具體是人?？墒褂貌煌馁x形劑。在一些實(shí)施方式中，所述賦形劑可以是但不限于堿性齊U、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、粘合劑、分離劑、涂層劑、外相成分、控釋成分、溶劑、表面活性劑、濕潤齊IJ、緩沖劑、填充劑、軟化劑、或其組合。除了本文所討論之外，賦形劑可包括但不限于《雷明頓藥學(xué)科學(xué)和實(shí)踐》(Remington :The Science and Practice of Pharmacy)第 21 版， (2005)所列。本文中將賦形劑納入具體分類(例如“溶劑”)用于闡明而不是限制賦形劑作用。一種具體賦形劑可處于多個(gè)類別內(nèi)。
本發(fā)明的組合物包括但不限于食品、藥物組合物、化妝品和工業(yè)組合物。
在一些實(shí)施方式中，所述組合物是食品。食品是動(dòng)物或人消耗的任何食物，且包括固體和液體組合物。食品可以是動(dòng)物或人食物的添加劑。食物包括但不限于普通食物；液體產(chǎn)品，包括牛奶、飲料、治療性飲品和營養(yǎng)素飲料；功能性食品；補(bǔ)充品；保健營養(yǎng)品；嬰
16兒配方，包括早產(chǎn)兒配方；懷孕或哺乳期婦女食品；成人食品；老年食品；和動(dòng)物飼料。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的破囊壺菌、生物質(zhì)或微生物油可直接使用或作為以下一種或多種中的添加劑油、起酥油、涂抹食品、其他脂肪成分、飲料、調(diào)味汁、奶制或豆制品(如牛奶、酸乳、奶酪和冰淇凌)、烤焙物、營養(yǎng)品，例如作為營養(yǎng)補(bǔ)充品(以膠囊或片劑形式)、維生素補(bǔ)充物、膳食補(bǔ)充劑、粉末沖泡飲品、成品或半成品粉末食品、和其組合。
含本發(fā)明微生物油的食物組合物的部分列表包括但不限于豆制品(牛奶、冰淇凌、酸乳、飲品、奶油、涂抹食品、增白劑)；湯和湯混合物；面團(tuán)、糊狀物和烘培食物，包括例如精致烘培制品、早餐谷物、蛋糕、芝士蛋糕、餡餅、紙杯蛋糕、曲奇、條狀食物、面包、花卷蛋糕、餅干、松餅、酥皮糕點(diǎn)、司康、油煎面包塊、薄脆餅干、甜食、甜品小食、派、格蘭諾拉麥片/ 小食條和烤吐司；糖果；硬糖果；巧克力和其他糖果；口香糖；液體食品，例如牛奶、能量飲料、嬰兒配方、碳酸飲料、茶、流質(zhì)食物、果汁、果汁飲料、蔬菜汁飲料；復(fù)合維生素糖漿、餐食替代物、藥膳和糖漿；粉末沖泡飲料混合物；意大利面；加工魚制品；加工肉制品；加工禽制品；肉汁和調(diào)味汁；調(diào)味品(蕃茄醬、蛋黃醬等)；植物油涂抹食品；奶制品；酸乳；黃油；冷凍奶制品；冰淇淋；速凍甜食；凍酸奶；半固體食品如嬰兒食品；布丁和果凍；加工和未加工奶酪；煎餅混合物；食物條，包括能量條；華夫格混合物；沙拉醬；雞蛋替代混合物；堅(jiān)果和堅(jiān)果涂抹食品；咸味休閑食品如薯片、和其他片或脆片、玉米片、墨西哥玉米片、膨化休閑食品、爆米花、椒鹽卷餅、薯?xiàng)l和堅(jiān)果；特色小吃如調(diào)味汁、干果小吃、肉類零食、豬肉皮、健康食物條和年糕/玉米餅。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的微生物油可用于補(bǔ)充嬰兒配方。本發(fā)明的微生物油可單獨(dú)或與產(chǎn)生花生四烯酸(ARA)的微生物衍生的身體精油組合來補(bǔ)充嬰兒配方。產(chǎn)生ARA的微生物是例如高山被孢霉(Mortierella alpina)或舒克里被孢霉(Mortierella sect, schmuckeri)。或者，嬰兒配方可添加本發(fā)明微生物油與富含ARA的油，包括ARASC0 (馬泰克生物科學(xué)公司(Martek Biosciences)，馬里蘭州哥倫比亞)的組合。
在一些實(shí)施方式中，所述組合物是動(dòng)物飼料?！皠?dòng)物”指屬于動(dòng)物界的任何非人生物，包括但不限于水生和陸生動(dòng)物。術(shù)語“動(dòng)物飼料”或“動(dòng)物食物”指用于非人動(dòng)物的任何食物，無論是魚；經(jīng)濟(jì)魚類；觀賞魚；仔魚；雙殼類；軟體動(dòng)物；甲殼動(dòng)物；貝類；蝦；幼蝦； 鹵蟲；輪蟲；鹽水蝦；濾食動(dòng)物；兩棲動(dòng)物；爬行動(dòng)物；哺乳動(dòng)物；家畜；耕畜；動(dòng)物園動(dòng)物； 運(yùn)動(dòng)類動(dòng)物；種畜；比賽類動(dòng)物；表演類動(dòng)物；活化石動(dòng)物(heirloom animals)；稀有或?yàn)l危動(dòng)物；伴侶動(dòng)物；寵物如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠或馬；靈長類動(dòng)物如猴(例如卷尾猴、 恒河猴、非洲綠猴、赤猴、食蟹獼猴和長尾猴)、猿、猩猩、狒狒、長臂猿和黑猩猩；犬科動(dòng)物如狗和狼；貓科動(dòng)物如貓、獅子和虎；馬科動(dòng)物如馬、驢子和斑馬；食用動(dòng)物如奶牛、牛、豬和羊；有蹄動(dòng)物如鹿和長頸鹿；嚙齒動(dòng)物如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠；等等。動(dòng)物飼料包括但不限于水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料、家畜飼料，包括寵物飼料、動(dòng)物園動(dòng)物飼料、役畜飼料、畜牲飼料或其組合。
在一些實(shí)施方式中，所述組合物是人可消耗其肉或制品的任何動(dòng)物的飼料或飼料補(bǔ)充品，如從其獲得肉、蛋或乳汁可為人食用的任何動(dòng)物。喂養(yǎng)這些動(dòng)物時(shí)，可將營養(yǎng)素如 LC-PUFA摻入該動(dòng)物的肉、乳汁、蛋或其他產(chǎn)品以增加這些營養(yǎng)素的含量。
在一些實(shí)施方式中，所述組合物是噴霧干燥物質(zhì)，其可壓碎以形成適當(dāng)大小的顆粒用于浮游動(dòng)物、鹵蟲、輪蟲和濾食動(dòng)物消耗。在一些實(shí)施方式中，喂以所述組合物的浮游動(dòng)物、鹵蟲或輪蟲隨之被仔魚、魚、貝類、雙殼類或甲殼動(dòng)物吃掉。
在一些實(shí)施方式中，所述組合物是藥物組合物。合適的藥物組合物包括但不限于抗炎組合物、冠心病治療藥物、動(dòng)脈硬化治療藥物、化療劑、活性賦形劑、骨質(zhì)疏松藥物、抗抑郁藥、抗驚厥藥、抗幽門螺桿菌藥物、神經(jīng)退行性疾病治療藥物、退行性肝病治療藥物、抗生素、降膽固醇組合物和降甘油三酯組合物。在一些實(shí)施方式中，所述組合物是醫(yī)療食品。 醫(yī)療食品包括在醫(yī)師指導(dǎo)下使用或外部給予的組合物中的食物和用于某一病癥的特定飲食控制的食物，其獨(dú)特營養(yǎng)需求基于公認(rèn)的科學(xué)原理通過醫(yī)學(xué)評估確定。
在一些實(shí)施方式中，所述微生物油可制成劑型。劑型可包括但不限于片劑、膠囊、 囊片、丹劑、丸劑、散劑和顆粒劑、胃腸外劑型，胃腸外劑型包括但不限于溶液劑、混懸劑、乳劑和粉末劑，其含有有效量的所述微生物油。本領(lǐng)域也已知這些制劑還可包含藥學(xué)上可接受稀釋劑、填充劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、表面活性劑、疏水性運(yùn)載體、水溶性運(yùn)載體、乳化齊 、緩沖劑、濕潤劑、保濕劑、增溶劑、防腐劑等。給予形式可包括但不限于片劑、糖衣丸、 膠囊、囊片和丸劑，其含有所述微生物油和一種或多種藥學(xué)上可接受的適當(dāng)載體。
對于口服給藥，所述微生物油可與本領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受載體聯(lián)用。這類載體能使本發(fā)明的微生物油制成片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、混懸劑等， 以便待治療個(gè)體口服攝入。在一些實(shí)施方式中，所述劑型是片劑、丸劑或囊片。獲得口服藥物制品可通過加入固體賦形劑，任選研磨所得混合物，如需要在加入適當(dāng)輔劑后加工顆?；旌衔?，從而獲得片劑或糖衣丸芯體。合適的賦形劑包括但不限于填充劑如糖，包括但不限于乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纖維素制品例如但不限于玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、 土豆淀粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如需要，可加入崩解劑，例如但不限于交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、或藻酸或其鹽如藻酸鈉。能口服使用的藥物制品包括但不限于由明膠制成的推入配合(push-fit)膠囊， 以及由明膠和塑化劑如甘油或山梨醇制成的密封軟膠囊。
在一些實(shí)施方式中，所述組合物是化妝品?；瘖y品包括但不限于乳液、乳霜、洗液、 面膜、肥皂、洗發(fā)水、化妝水、面霜、護(hù)發(fā)素、彩妝用品、沐浴基和分散液?；瘖y試劑可以是醫(yī)用或非醫(yī)用。
在一些實(shí)施方式中，所述組合物是工業(yè)組合物。在一些實(shí)施方式中，所述組合物是一種或多種產(chǎn)品的原材料。產(chǎn)品包括但不限于聚合物；照相感光材料；去垢劑；工業(yè)用油； 或工業(yè)清潔劑。例如，美國專利第7，259，006號(hào)描述了使用含DHA的脂肪和油生成山崳酸和用山崳酸生產(chǎn)照相感光材料。
使用組合物的方法
在一些實(shí)施方式中，所述組合物能用于治療人或動(dòng)物中的某一病癥。
術(shù)語“處理”和“治療”指治療性治療和預(yù)防或防止性措施，其中目標(biāo)是防止或緩解 (減輕)不需要的生理狀況、疾病或失調(diào)，或是獲得有益或需要的臨床結(jié)果。對于本發(fā)明目的，有益或需要的臨床結(jié)果包括但不限于緩解與某一病癥、疾病或失調(diào)相關(guān)的癥狀或征兆； 減輕某一病癥、疾病或失調(diào)的程度；穩(wěn)定某一病癥、疾病或失調(diào)(即其中所述病癥、疾病或失調(diào)不惡化)；延遲所述病癥、疾病或失調(diào)的發(fā)生或進(jìn)展；改善所述病癥、疾病或失調(diào)；緩和 (無論組分或全部且無論能檢測或不能檢測)所述病癥、疾病或失調(diào)；或者改良或改進(jìn)某一病癥、疾病或失調(diào)。治療也包括與若不接受治療的預(yù)期存活期相比，延長存活期。[0090]在一些實(shí)施方式中，用所述組合物治療某一病癥、疾病或失調(diào)，如痤瘡、急性炎癥、 年齡相關(guān)性黃斑部病變、變態(tài)反應(yīng)、阿爾茨海默病、關(guān)節(jié)炎、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫病、血脂異常、乳腺囊腫、惡病質(zhì)、癌癥、心臟再狹窄、心血管疾病、慢性炎癥、冠心病、囊性纖維化、退行性肝病、糖尿病、濕疹、腸胃失調(diào)、心臟病、高甘油三酯水平、高血壓、多動(dòng)癥、免疫疾病、抑制腫瘤生長、炎癥病癥、腸失調(diào)、腎功能障礙、白血病、重郁癥、多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)退化性疾病、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、過氧化物酶體異常、子癇前期、早產(chǎn)、銀屑病、肺異常性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、心臟病風(fēng)險(xiǎn)或血栓。
在一些實(shí)施方式中，所述組合物用于增加妊娠最后三個(gè)月的妊娠期長度。
在一些實(shí)施方式中，所述組合物用于控制血壓。
在一些實(shí)施方式中，所述組合物用于改善或維持認(rèn)知功能。
在一些實(shí)施方式中，所述組合物用于改善或維持記憶。
所述組合物或劑型可通過任何與該組合物或劑型相容的途徑給予對象體內(nèi)。如果某一物質(zhì)由對象引入其體內(nèi)，或如另一人、機(jī)器或裝置將該物質(zhì)引入對象體內(nèi)，則認(rèn)為“給予”了該物質(zhì)。因此，“給予”包括自身給予、通過其他方式給予和間接給予。本文涉及“給予”使用的術(shù)語“持續(xù)”或“連續(xù)”指給予頻率為至少每天一次。然而，應(yīng)注意給予頻率可以大于每天一次且仍為“持續(xù)”或“連續(xù)”，例如每天二次或甚至三次，只要不超過本文指定的劑量水平。給予的方式和方法在本領(lǐng)域已知且技術(shù)人員可參考不同的藥理學(xué)參考文獻(xiàn)用于指導(dǎo)。例如，可查閱“現(xiàn)代藥劑學(xué)”(Modern Pharmaceutics), Banker和Rhodes，美國健康信息Gnforma Healthcare)，第4版(2002)和“Goodman & Gilman的《治療學(xué)的藥學(xué)基石出》，，(Goodman & Gilman' s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics),紐約的麥克勞希爾有限公司(McGraw-Hill Companies, Inc.)，第 10 版(2001)。
“對象”、“個(gè)體”或“患者”指需要診斷、預(yù)后或治療的任何對象，無論是人或非人。 哺乳動(dòng)物對象包括但不限于人；家畜；耕畜；動(dòng)物園動(dòng)物；運(yùn)動(dòng)類動(dòng)物；寵物如狗、貓、豚鼠、 兔、大鼠、小鼠、或馬；靈長類動(dòng)物如猴(例如卷尾猴、恒河猴、非洲綠猴、赤猴、食蟹獼猴和長尾猴)、猿、猩猩、狒狒、長臂猿和黑猩猩；犬科動(dòng)物如狗和狼；貓科動(dòng)物如貓、獅子和虎； 馬科動(dòng)物如馬、驢子和斑馬；食用動(dòng)物如奶牛、牛、豬和羊；有蹄動(dòng)物如鹿和長頸鹿；嚙齒動(dòng)物如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠；等等。術(shù)語對象也涵蓋模型動(dòng)物，例如疾病模型動(dòng)物。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語對象包括經(jīng)濟(jì)上或其他方面有價(jià)值的動(dòng)物，例如經(jīng)濟(jì)上重要的種畜、比賽類動(dòng)物、表演類動(dòng)物、活化石動(dòng)物、稀有或?yàn)l危動(dòng)物、或伴侶動(dòng)物。在一些實(shí)施方式中，對象是人對象。在某些實(shí)施方式中，對象是非人對象。
所述組合物可以“治療有效量”、“預(yù)防有效量”、“治療劑量”、或“預(yù)防劑量”給予。 “治療有效量”或“治療劑量”指在必要的劑量和時(shí)間段內(nèi)有效獲得所需治療結(jié)果的量。治療結(jié)果可以是例如減輕癥狀、延長存活、改善移動(dòng)性等。治療結(jié)果不必是“治愈”?！邦A(yù)防有效量”或“預(yù)防劑量”指在必要的劑量和時(shí)間段內(nèi)有效獲得所需預(yù)防結(jié)果的量。通常，由于預(yù)防劑量在疾病早期之前或期間用于對象，預(yù)防有效量小于疾病晚期治療的治療有效量。
根據(jù)待給予對象的破囊壺菌、生物質(zhì)或微生物油的DHA或其他脂肪酸成分的量， 可將不同劑量的藥物組合物給予對象。術(shù)語“日劑量”、“日劑量水平”、“每日劑量”在本文中指每天(每M小時(shí)段)給予的DHA或其他脂肪酸成分總量。因此，例如給予對象aiig DHA 的日劑量意味著該對象每天接受共ang DHA，無論DHA以含aiig DHA的單個(gè)劑型或是以各
19含0. 5mg DHA的四個(gè)劑型(總共^iig DHA)給予。在一些實(shí)施方式中，每日DHA量以單個(gè)劑型或兩個(gè)劑型給予。本發(fā)明的劑型可一次施用或多次施用。例如，若每日用4片，每片含 0. 5mg DHA，則可每天一次服用所有4片，或每天兩次2片，或每6小時(shí)1片。在一些實(shí)施方式中，日劑量為約IOOmg-約15g DHA。在一些實(shí)施方式中，日劑量為約IOOmg-約250mg、 約 IOOmg-約 500mg、約 IOOmg-約 lg、約 Ig-約 2. 5g、約 Ig-約 5g、約 Ig-約 10g、約 Ig-約 15g、約 5g-約 10g、約 5g-約 15g、約 IOg-約 15g、約 IOOmg-約 10g、約 IOOmg-約 5g、或約 IOOmg-約 2. 5g。
可用不同方案給予本發(fā)明的組合物或劑型。例如，在一些實(shí)施方式中，連續(xù)數(shù)天每日給予，或者每隔一天(每兩天)給予?？梢栽谝惶旎蚨嗵旖o予。
給予所述組合物和劑型可與治療所述病癥的其他方案聯(lián)用。例如，本發(fā)明的方法可與膳食方案(例如低糖飲食、高蛋白飲食、高纖維飲食等)、鍛煉方案、減肥方案、戒煙方案或其組合聯(lián)用。本發(fā)明的方法也可與其他藥品聯(lián)合治療所述病癥。本發(fā)明的組合物或劑型可在其他方案或藥品之前或之后給予。
含組合物的藥盒
本發(fā)明還涉及含一個(gè)或多個(gè)單位的本發(fā)明組合物的藥盒或包裝。藥盒或包裝可包括數(shù)單位的食品、藥物組合物、化妝品或工業(yè)組合物，其含有本發(fā)明的破囊壺菌、生物質(zhì)或微生物油、或其組合。藥盒或包裝也可包括含本發(fā)明破囊壺菌、生物質(zhì)或微生物油、或其組合的添加劑，用于制備食品、化妝品、藥物組合物或工業(yè)組合物。
在一些實(shí)施方式中，所述藥盒或包裝含有根據(jù)本發(fā)明方法給予的一個(gè)或多個(gè)單位的藥物組合物。所述藥盒或包裝可含有一劑量單位，或大于一劑量單位(即多劑量單位)。 如果所述藥盒或包裝中存在多劑量單位，可任選安排該多劑量單位以依序給予。
本發(fā)明的藥盒可任選包含與該藥盒的單位或劑型相關(guān)的說明。這類說明可以是政府監(jiān)管藥品生產(chǎn)、使用或銷售的機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式，這反映其被生產(chǎn)、使用或銷售監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于人給藥以治療某一病癥或失調(diào)。所述說明可以是傳遞根據(jù)本發(fā)明方法使用藥盒中單位或劑型的信息的任何形式。例如，所述說明可以是印刷品，或是預(yù)錄制媒體裝置形式。
在檢查病人過程中，醫(yī)學(xué)專業(yè)人員可確定施用本發(fā)明的一種方法是適合該病人的，或醫(yī)師可確定通過施用本發(fā)明方法的一種方法能改善病人病癥。開出任何方案前，醫(yī)師可告知病人例如與該方案相關(guān)的不同風(fēng)險(xiǎn)和益處。充分告知病人與該方案相關(guān)的所有已知和疑似風(fēng)險(xiǎn)。這類提示可以是口頭以及書面形式。在一些實(shí)施方式中，醫(yī)師可提供關(guān)于該方案的文獻(xiàn)資料給病人，例如產(chǎn)品信息、教材等。
本發(fā)明也涉及教育消費(fèi)者了解治療方式的方法，該方法包括在銷售點(diǎn)分發(fā)劑型與消費(fèi)者信息。在一些實(shí)施方式中，分發(fā)在具有藥劑師或醫(yī)療服務(wù)提供者的銷售點(diǎn)進(jìn)行。
術(shù)語“消費(fèi)者信息”可包括但不限于英語文本、非英語文本、視覺圖像、圖表、電話錄音、網(wǎng)址、客服代表聯(lián)系方式。在一些實(shí)施方式中，消費(fèi)者信息提供指南用于根據(jù)本發(fā)明方法使用劑型、合適使用年齡、提示、禁忌、合適劑量、警告、網(wǎng)址的電話。在一些實(shí)施方式中，本方法還包括提供專業(yè)信息給某一地點(diǎn)的相關(guān)人員，以回答消費(fèi)者關(guān)于根據(jù)本發(fā)明方法使用所述方案的問題。術(shù)語“專業(yè)信息”包括但不限于涉及根據(jù)本發(fā)明方法給予時(shí)方案的信息，信息設(shè)計(jì)成能使醫(yī)學(xué)專業(yè)人員回答消費(fèi)者問題的形式。
“醫(yī)學(xué)專業(yè)人員”包括例如醫(yī)師、醫(yī)師助理、執(zhí)業(yè)護(hù)士、藥劑師和客服代表。[0109]總體上描述本發(fā)明后，可參考本文提供的實(shí)施例進(jìn)一步加以理解。這些實(shí)施例僅用闡明且不用于限制。
實(shí)施例1
鑒定以ATCC登錄號(hào)PTA-9695保藏的分離破囊壺菌以便分類。
在低潮期從潮間帶生境中收集樣品。將水、沉淀物、活植物物質(zhì)和腐敗植物/動(dòng)物殘骸置于50ml無菌管。各樣品組分與水一起平鋪于分離培養(yǎng)基的固體瓊脂板上。分離培養(yǎng)基由以下組成500ml人工海水、500ml蒸餾水、Ig葡萄糖、Ig甘油、13g瓊脂、Ig谷氨酸鹽、0. 5g酵母膏、0. 5g酪蛋白水解物、Iml維生素溶液(100mg/L硫胺素，0. 5mg/L生物素， 0. 5mgB12)、lml 痕量礦物質(zhì)溶液(PII 金屬，每升含有:6. Og FeCl36H20，6. 84g H3BO3,0. 86g MnCl24H20，0. 06g ZnCl2,0. 026 CoC126H20,0. 052g NiSO4H20,0. 002g CuS045H20 和 0. 005g Na2Mo042H20)和各500mg的青霉素G和硫酸鏈霉素。瓊脂板避光20-25 °C孵育。2_4天后， 瓊脂板放大后加以檢測，用無菌牙簽挑出細(xì)胞菌落并重劃線培養(yǎng)于新鮮培養(yǎng)基板。細(xì)胞重復(fù)劃線培養(yǎng)于新鮮培養(yǎng)基上，直到去除污染生物。
將來自瓊脂板的菌落轉(zhuǎn)移到皮氏培養(yǎng)皿中，所述培養(yǎng)皿具有半皿海水和Iml高壓滅菌的新孵化鹽水蝦幼蟲懸浮液。2-3天后鹽水蝦幼蟲嚴(yán)重過度生長，產(chǎn)生孢子囊簇。釋放的游動(dòng)孢子在排出時(shí)具有雙鞭毛，活躍地游離成熟孢子囊，孢子釋放后其在壁上的殘留物清晰可見(相位差)。測得孢子囊直徑為12. 5 μ m-25 μ m,游動(dòng)孢子大小為2. 5 μ m-2. 8ym χ 4. 5 μ m-4. 8 μ m。各單獨(dú)孢子囊有8- 個(gè)孢子。沉淀的游動(dòng)孢子放大并迅速經(jīng)歷二分裂， 產(chǎn)生四分體、八分體并最終形成孢子囊簇。四分體形成在孢子囊成熟前較早期開始。這些特征與裂殖壺菌屬一致。
基于其18s rRNA基因與已知物種的相似性，進(jìn)一步鑒定以ATCC登錄號(hào)PTA-9695 保藏的分離破囊壺菌。以ATCC登錄號(hào)PTA-9695保藏的破囊壺菌的總基因組DNA通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備(Sambrook J.和Russell D. 2001.《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular Cloning A Laboratory Manual)，第 3 版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory I^ress)，紐約冷泉港)并用于PCR擴(kuò)增18s rRNA基因。用前述引物完成該18s rRNA基因的 PCR 擴(kuò)增(Honda 等，J. Eukaryot. Microbiol. 46 (6) 1999)。用染色體 DNA 摸板的 PCR 條件如下0. 2μ M dNTPs，0. IuM 各引物，8% DMS0，200ng 染色體 DNA，2. 5U PfuUltra II 融合HS DNA聚合酶(司查塔基公司(Stratagene))和IX PfuUltra 緩沖劑(司查塔基公司)，50yL總體積。PCR操作包括以下步驟(1)95°C 2分鐘；(2)95°C 45秒；(3)55°C 30 秒；(4) 720C 2分鐘；(5)重復(fù)步驟2-4，40輪；(6) 72°C 5分鐘；和(7)保持于6°C。
用上述染色體模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生具有預(yù)期大小的獨(dú)特DNA產(chǎn)物。根據(jù)廠商說明將所述PCR產(chǎn)物克隆到pJET1.2/鈍端(i^rmentas)載體中，用提供的標(biāo)準(zhǔn)引物確定插入序列。
表2顯示以ATCC登錄號(hào)PTA-9695保藏的破囊壺菌的18s rRNA序列與國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)電子數(shù)據(jù)庫中DNA序列的比對。簡要地，通過VectorNTI程序(英杰公司(Invitrogen))的“AlignX“程序內(nèi)評分矩陣“swgapdnamt “( 一種DNA比對標(biāo)準(zhǔn)) 測定“相同性％”。從NCBI電子數(shù)據(jù)庫的基本局部比對搜索工具(BLAST)計(jì)算結(jié)果獲得“覆蓋％ ”，“覆蓋％ ”是比對區(qū)段內(nèi)含有的查詢長度的百分?jǐn)?shù)。
表2 18s rRNA序列的比較[0118]
權(quán)利要求
1.一種以ATCC登錄號(hào)PTA-9695保藏的破囊壺菌的分離破囊壺菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的二十碳五烯酸。
2.一種具有以ATCC登錄號(hào)PTA-9695保藏的破囊壺菌特征的分離破囊壺菌微生物，其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的二十碳五烯酸。
3.一種含有甘油三酯組分的分離破囊壺菌微生物或其衍生菌株，其中所述甘油三酯組分的二十二碳六烯酸含量為至少約40重量％，其中所述甘油三酯組分的二十二碳五烯酸 n-6含量為至少約0. 5重量％ -約6重量％，且其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的二十碳五烯酸。
4.一種與以ATCC登錄號(hào)PTA-9695保藏的破囊壺菌同種的分離破囊壺菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的二十碳五烯酸。
5.如權(quán)利要求
1到4中任一項(xiàng)所述的分離破囊壺菌微生物，其特征在于，所述衍生菌株是突變菌株。
6.一種以ATCC登錄號(hào)PTA-9695保藏的分離的破囊壺菌微生物。
7.一種以ATCC登錄號(hào)PTA-9696保藏的分離的破囊壺菌微生物。
8.一種以ATCC登錄號(hào)PTA-9697保藏的分離的破囊壺菌微生物。
9.一種以ATCC登錄號(hào)PTA-9698保藏的分離的破囊壺菌微生物。
10.一種含有前述權(quán)利要求
中任一項(xiàng)所述的破囊壺菌微生物或其混合物的破囊壺菌生物質(zhì)。
11.一種分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中，至少約50重量％的所述生物質(zhì)的細(xì)胞干重是脂肪酸，且其中至少約50重量％的脂肪酸是Ω -3脂肪酸。
12.如權(quán)利要求
11所述的分離破囊壺菌生物質(zhì)，其特征在于，所述至少約50重量％的所述脂肪酸是二十二碳六烯酸。
13.一種分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中，至少約25重量％的所述生物質(zhì)的細(xì)胞干重是二十二碳六烯酸。
14.如權(quán)利要求
10到13中任一項(xiàng)所述的分離破囊壺菌生物質(zhì)，其特征在于，約10重量％或更少的所述脂肪酸是二十碳五烯酸，且其中二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸的重量比為至少約5 1。
15.如權(quán)利要求
10到14中任一項(xiàng)所述的分離破囊壺菌生物質(zhì)，其特征在于，約1.5重量％或更少的所述脂肪酸是花生四烯酸，且其中二十二碳六烯酸與花生四烯酸的重量比為至少約20 1。
16.如權(quán)利要求
10到15中任一項(xiàng)所述的分離破囊壺菌生物質(zhì)，其特征在于，所述生物質(zhì)還含有重量比為至少約10 1的二十二碳六烯酸與二十二碳五烯酸n-6。
17.一種含有權(quán)利要求
1到9中任一項(xiàng)所述的破囊壺菌微生物或其混合物的分離破囊壺菌培養(yǎng)物。
18.如權(quán)利要求
17所述的分離破囊壺菌培養(yǎng)物，其特征在于，所述破囊壺菌培養(yǎng)物還包括至少約5%的溶解氧。
19.一種用于動(dòng)物或人的食品、化妝品或藥物組合物，其包括權(quán)利要求
1到16中任一項(xiàng)所述的破囊壺菌微生物或破囊壺菌生物質(zhì)或其混合物。
20.一種含有至少約70重量％甘油三酯組分的微生物油，其中，所述甘油三酯組分的二十二碳六烯酸含量為至少約50重量％，其中所述甘油三酯組分的二十二碳五烯酸n-6含量為約0.5重量％ -約6重量％。
21.如權(quán)利要求
20所述的微生物油，其特征在于，所述微生物油中所述甘油三酯組分的花生四烯酸含量為約1. 5重量％或更少。
22.—種含有至少約70重量％甘油三酯組分的微生物油，其中，所述甘油三酯組分的二十二碳六烯酸含量為至少約40重量％，其中所述甘油三酯組分的二十二碳五烯酸n-6含量為至少約0. 5重量％ -約6重量％，且其中二十二碳六烯酸與二十二碳五烯酸n-6的比例為大于約6 1。
23.一種含有至少約70重量％甘油三酯組分的微生物油，其中，所述甘油三酯組分的二十二碳六烯酸含量為至少約60重量％。
24.如權(quán)利要求
20到23中任一項(xiàng)所述的微生物油，其特征在于，所述甘油三酯組分的至少約20 %甘油三酯在所述甘油三酯內(nèi)的兩個(gè)位置上含有二十二碳六烯酸，所述位置選自 sn-U sn-2和sn-3位置中的任意兩個(gè)。
25.如權(quán)利要求
20到23中任一項(xiàng)所述的微生物油，其特征在于，所述甘油三酯組分的至少約5%甘油三酯在所述甘油三酯中sn-1、sn-2和sn-3三個(gè)位置上都含有二十二碳六烯酸。
26.如權(quán)利要求
20到23中任一項(xiàng)所述的微生物油，其特征在于，所述微生物油還包括約5重量％或更少的十七酸。
27.一種用于動(dòng)物或人的食品、化妝品或藥物組合物，其包括權(quán)利要求
20到沈中任一項(xiàng)所述的微生物油。
28.如權(quán)利要求
19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是嬰兒配方。
29.如權(quán)利要求
觀所述的食品，其特征在于，所述嬰兒配方適合早產(chǎn)兒。
30.如權(quán)利要求
19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是牛奶、飲料、治療性飲品、 營養(yǎng)素飲料或其組合。
31.如權(quán)利要求
19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是用于動(dòng)物或人食物的添加劑。
32.如權(quán)利要求
19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是營養(yǎng)補(bǔ)充品。
33.如權(quán)利要求
19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是動(dòng)物飼料。
34.如權(quán)利要求
33所述的動(dòng)物飼料，其特征在于，所述動(dòng)物飼料是水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。
35.如權(quán)利要求
33所述的動(dòng)物飼料，其特征在于，所述動(dòng)物飼料是牲畜飼料、動(dòng)物園動(dòng)物飼料、役畜飼料、家畜飼料或其組合。
36.一種含Ω-3脂肪酸的微生物油的生產(chǎn)方法，所述方法包括(a)使權(quán)利要求
1到9中任一項(xiàng)所述的分離破囊壺菌微生物或其混合物在培養(yǎng)物中生長以生成生物質(zhì)，和(b)從所述生物質(zhì)中提取含Ω-3脂肪酸的油。
37.如權(quán)利要求
36所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)物包括至少約5%的溶解氧。
38.如權(quán)利要求
36所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)物pH維持在約6.5-約8. 5。
39.如權(quán)利要求
36所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)物溫度維持在約17°C-約30°C。
40.如權(quán)利要求
36所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)物包括約5g/L-約50g/L濃度的葡萄糖。
41.一種含Ω-3脂肪酸的微生物油的生產(chǎn)方法，所述方法包括從權(quán)利要求
10到16中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)中提取含Ω-3脂肪酸的油。
42.如權(quán)利要求
41所述的方法，其特征在于，所述含Ω-3脂肪酸的微生物油用己烷提取方法提取。
43.如權(quán)利要求
41所述的方法，其特征在于，所述含Ω-3脂肪酸的微生物油用無溶劑提取方法提取。
44.如權(quán)利要求
36到43中任一項(xiàng)所述的方法或者權(quán)利要求
17或18所述的分離破囊壺菌培養(yǎng)物，其特征在于，所述從每升培養(yǎng)物中分離的生物質(zhì)細(xì)胞干重在PH約6. 5-約8. 0 的培養(yǎng)基中約17°C -約30°C生長約7天后為至少約50g，所述培養(yǎng)基包含碳、氮和營養(yǎng)源及約950ppm-約8500ppm氯離子。
45.如權(quán)利要求
36到43中任一項(xiàng)所述的方法或者權(quán)利要求
17或18所述的分離破囊壺菌培養(yǎng)物，其特征在于，所述Ω -3脂肪酸生產(chǎn)率在ρΗ約6. 5-約8. 0的培養(yǎng)基中約17°C -約 30°C生長約7天后為至少約2克/升/天，所述培養(yǎng)基包含碳、氮和營養(yǎng)源及約950ppm-約 8500ppm氯離子。
46.一種通過權(quán)利要求
36到45中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的微生物油。
47.權(quán)利要求
1到16、20到沈、46中任一項(xiàng)所述的分離微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物在生產(chǎn)治療炎癥或其相關(guān)病癥的藥物中的應(yīng)用。
48.權(quán)利要求
1到16、20到沈、46中任一項(xiàng)所述的分離微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物在治療炎癥或其相關(guān)病癥中的應(yīng)用。
49.如權(quán)利要求
1到16、20到沈、46中任一項(xiàng)所述的分離微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物，用于治療炎癥或其相關(guān)病癥。
50.一種在需要的對象中治療炎癥或其相關(guān)病癥的方法，所述方法包括將權(quán)利要求
1 到16、20到沈、46中任一項(xiàng)所述的分離微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物以及藥學(xué)上可接受載體給予對象。
專利摘要
本發(fā)明涉及分離的破囊壺菌微生物以及其菌株和突變體。本發(fā)明還涉及生物質(zhì)、微生物油、組合物、培養(yǎng)物、生成微生物油的方法、和使用分離破囊壺菌、生物質(zhì)及微生物油的方法。
文檔編號(hào)C12N15/82GKCN102428185SQ200980159422
公開日2012年4月25日 申請日期2009年3月19日
發(fā)明者J·M·漢森, J·W·普菲弗三世, K·E·阿普特, P·W·伯赫恩斯, R·澤克爾, T·L·斯托爾 申請人:馬太克生物科學(xué)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan