專利名稱:一種產(chǎn)冠菌素菌株生長發(fā)育關(guān)鍵溫度的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及調(diào)控發(fā)酵生產(chǎn)植物生長物質(zhì)的方法，尤其涉及一種產(chǎn)冠菌素菌株生長發(fā)育關(guān)鍵溫度的測定方法，可靠地確定描述產(chǎn)冠菌素菌株生長發(fā)育關(guān)鍵溫度(生長起始溫度、最適生長和高溫致死臨界溫度)的方法。
背景技術(shù)：
溫度是生物生命活動(dòng)不可缺少的因素，是影響生命進(jìn)程的基本因子。像細(xì)菌一類的變溫生物，本身產(chǎn)熱量低，代謝熱和環(huán)境熱比起來所起的作用較小，菌株的體溫隨著外界環(huán)境溫度變化而改變。在自然選擇和人工選擇壓力下，大多數(shù)細(xì)菌不同生態(tài)菌株，在一定條件下，都有一個(gè)特定的溫度適應(yīng)范圍。在一定時(shí)空范圍內(nèi)，細(xì)菌把這種對溫度的適應(yīng)性，表現(xiàn)為在種群水平上生態(tài)學(xué)參數(shù)的差異，可以通過實(shí)驗(yàn)室恒溫培養(yǎng)、數(shù)學(xué)建模來量化菌株的溫度特征。
目前，有許多數(shù)學(xué)模型可以用來作為這種量化的工具。與線性數(shù)學(xué)模型相比，“溫度-發(fā)育速率”非線性模型由于在建模過程中，一般都具有較為堅(jiān)實(shí)的生理、生化信息等基礎(chǔ)，因而常常被廣泛應(yīng)用。但是在不同條件下，各種數(shù)學(xué)模型的適應(yīng)性有著明顯的差別。
冠菌素(Coronatine，COR, C18H25NO4)是一種新型高效的生物源植物生長物質(zhì)，多由丁香假單胞菌屬的植物致病菌變種分泌于胞外，能有效促進(jìn)植物次級代謝產(chǎn)物的生物合成，提高植物抗逆性，活性比茉莉酸高100 10000倍。因此，冠菌素合成有著廣闊的市場前景。目前，獲得冠菌素的途徑主要有化學(xué)合成和生物合成?；瘜W(xué)合成冠菌素的過程繁雜，得率僅有6.98%，合成費(fèi)用高。生物合成冠菌素主要通過植物疫病的致病菌發(fā)酵產(chǎn)生。冠菌素產(chǎn)生菌株的經(jīng)典菌株為Pseudomonas syringae pv.glycinea PG4180,早期研究表明經(jīng)典菌株不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。因此新菌株的選育成為后期研究的基礎(chǔ)，但大部分產(chǎn)冠菌素菌株為植物病原菌，獲得相對困難，因此對于經(jīng)典菌株的誘變選育成為研究熱點(diǎn).[0005]張國棟、李召虎和吳慧玲等利用紫外和亞硝基胍等物理化學(xué)誘變法提高傳統(tǒng)菌株的冠菌素產(chǎn)量。焦睿利用了 Tn5轉(zhuǎn)座子對冠菌素產(chǎn)生菌株丁香假單胞菌大豆致病變種(P.syringae.pv.glycinea) PG4180進(jìn)行誘變；Bender等向hRcC基因中加入抗卡那霉素基因，獲得APVl菌種，它可以適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)冠菌素的溫度(26°C)要求，并且菌種沒有致病性；吳曉玉等分別以菌株對萘代謝的溫度敏感性及對紅霉素抗性為篩選標(biāo)志，依次采用亞硝基胍、5-溴尿嘧啶、紫外線、吖啶橙與紫外線混合等誘變方式，經(jīng)系列推理選育，獲得產(chǎn)冠菌素能力為100μ g/mL的突變菌株，比野生菌株產(chǎn)量提高了 7.3倍。誠然，紫外誘變與亞甲基胍結(jié)合誘變使冠菌素產(chǎn)量得到了一定提高，然而也曝露出了工作量大、效率低的問題，這是傳統(tǒng)誘變育種的共同問題，而且無論如何誘變選育，到目前為止，所獲得的新菌株耐受溫度仍然停留28°C (與野生菌株的冠菌素發(fā)酵極限溫度一致)，因此要獲得適宜工業(yè)應(yīng)用的菌株，篩選耐溫新型冠菌素產(chǎn)生菌株極為必要。
申請人:前期成功篩選到一株桑丁香 假單胞菌株(Pseudomonas syringaeP V.mori)M4-13(CGMCC N0.3621)具有產(chǎn)冠菌素特性，且在高溫(32°C )下檢測到冠菌素的產(chǎn)生(專利公開號CN 101948764A)。這表明溫度不僅是冠菌素生物合成關(guān)鍵因素，也是菌株本身生長關(guān)鍵因子，對其溫度特征描述、界定與保護(hù)成為這方面技術(shù)所必須部分，但目前未見確定產(chǎn)冠菌素菌株生長發(fā)育關(guān)鍵溫度(生長起始溫度、最適生長和高溫致死臨界溫度)方法的報(bào)道與專利，而目前已經(jīng)發(fā)表的這方面應(yīng)用論文都沒有考慮到模型參數(shù)在擬合后的顯著性，以及生長起始溫度、最適生長和高溫致死臨界溫度獲得的可靠性檢測，這往往造成擬合獲得的參數(shù)不切合實(shí)際。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題:
針對以上問題，本發(fā)明的目的是為了便于調(diào)控和優(yōu)化植物生長物質(zhì)冠菌素的發(fā)酵過程，提供一種產(chǎn)冠菌素菌株生長發(fā)育關(guān)鍵溫度的測定方法。通過此方法，來描述桑丁香假單胞菌株(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13 (CGMCC N0.3621)生長起始溫度、最適生長和高溫致死臨界溫度。
技術(shù)方案:
一種產(chǎn)冠菌素菌株生長發(fā)育關(guān)鍵溫度的測定方法，步驟為:
(I)菌株培養(yǎng)
將菌株在LB固體平板上涂布，32°C培養(yǎng)ld，挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基中32°C試管培養(yǎng)1山將菌液稀釋20000倍，再次涂布，挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基中32°C試管培養(yǎng)ld，將菌液轉(zhuǎn)移到含有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶內(nèi)，在14°C 40°C范圍內(nèi)選取不同溫度條件下，搖床280r/min培養(yǎng)。
(2)構(gòu)建菌體濃度-溫度生長曲線
每隔Ih取3mL發(fā)酵液并回注液體培養(yǎng)基3mL，于550nm處分光光度計(jì)法測定菌液吸光度，繪制菌株在不同培養(yǎng)溫度下的生長曲線，建立菌體濃度-溫度生長曲線。
(3)溫度處理點(diǎn)生長速率
以菌體濃度-溫度生長曲線對數(shù)期的斜率m(菌體濃度由分光光度法測得，λ =
550)，下列公式:
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)冠菌素菌株生長發(fā)育關(guān)鍵溫度的測定方法，其特征在于步驟為: (1)菌株培養(yǎng): 將保藏號 CGMCC N0.3621 的桑丁香假單胞菌株(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌株在LB固體平板上涂布，32°C培養(yǎng)ld，挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基中32°C試管培養(yǎng)Id,將菌液稀釋20000倍，再次涂布，挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基中32°C試管培養(yǎng)ld，將菌液轉(zhuǎn)移到含有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶內(nèi)，在14°C 40°C范圍內(nèi)選取不同溫度條件下，搖床280r/min培養(yǎng)； (2)構(gòu)建菌體濃度-溫度生長曲線 每隔Ih取3mL發(fā)酵液并回注液體培養(yǎng)基3mL，于550nm處分光光度計(jì)法測定菌液吸光度，繪制菌株在不同培養(yǎng)溫度下的生長曲線，建立菌體濃度-溫度生長曲線； (3)溫度處理點(diǎn)生長速率 以菌體濃度-溫度生長曲線對數(shù)期的斜率m，菌體濃度由分光光度法測得，λ =550，由下列公式:
專利摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)冠菌素菌株生長發(fā)育關(guān)鍵溫度的測定方法，包括(1)菌株培養(yǎng)，(2)構(gòu)建菌體濃度-溫度生長曲線，(3)溫度處理點(diǎn)生長速率，(4)溫度速率模型選擇與擬合。溫度是產(chǎn)冠菌素菌株生長關(guān)鍵因素，也是生產(chǎn)上調(diào)控和優(yōu)化發(fā)酵過程的關(guān)鍵因素。本發(fā)明提供菌種生長發(fā)育關(guān)鍵溫度(生長起始溫度、最適生長和高溫致死臨界溫度)的測定方法，可以穩(wěn)健地提供菌種種群溫度特征，為今后冠菌素菌株選育提供穩(wěn)健可靠的實(shí)用技術(shù)。
文檔編號C12Q1/02GKCN102517370 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201110343220
公開日2013年8月7日 申請日期2011年11月3日
發(fā)明者王俊, 吳福安, 梁垚, 成杰 申請人:江蘇科技大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),