專利名稱:一種交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體的提供了一種交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體(oxdc-CLEAs)的制備方法。
背景技術(shù)：
草酸(H00C-C00H)以草酸鹽的形式廣泛的分布在植物、微生物和人在內(nèi)的生物體內(nèi)。人體內(nèi)沒有降解草酸鹽的相關(guān)酶，人們在食用某些高草酸含量的食物如菠菜，莧菜，草莓，橘子，李子，花生醬，高粱和茶葉等會容易造成草酸鹽在人體內(nèi)積累，從而引發(fā)如尿結(jié)石、腎結(jié)石、高草酸尿、低血鈣癥等多種病理狀態(tài)。泌尿性系統(tǒng)結(jié)石病嚴(yán)重影響著人類的健康，根據(jù)地理環(huán)境的不同其發(fā)病率在3% 15%，而且還呈上升到趨勢，結(jié)石病治療后易復(fù)發(fā)，治愈后復(fù)發(fā)率高達(dá)60% 80% (董婷婷等，利用乳酸菌降解草酸預(yù)防結(jié)石的研究進(jìn)展，中國微生態(tài)學(xué)雜志，2011，23 (3):266)。對部分病人的結(jié)石成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)難溶的草酸.丐高達(dá) 80% (Fredric L.Coe 等，Kidney stone disease, The Journal of ClinicalInvestigation, 2005,115(10):2598-2608)，可見草酸鹽是導(dǎo)致結(jié)石癥的重要原因。目前對高草酸鹽水平引起結(jié)石癥的治療方法都不是非常理想，主要通過限制草酸的攝入量來預(yù)防結(jié)石，而且許多原發(fā)性的高草酸尿患者需要密集的透析和器官移植，這大大增加了患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)壓力，因此需要尋求一種安全的從體內(nèi)去除草酸鹽的方法。通過服用某種酶制劑降解攝入體內(nèi)的草酸鹽，是緩解泌尿性系統(tǒng)草酸鹽結(jié)石病癥，降低患者痛苦的有效方法。
草酸脫羧酶(EC 4.1.1.2)催化轉(zhuǎn)化草酸為甲酸和C02，是生物體內(nèi)催化降解草酸及草酸鹽的主要催化酶之一，對底物草酸具有較強(qiáng)的專一性。草酸脫羧酶主要存在于木材腐敗真菌中，如漆斑菌(Myrothecium Verrucari)、金針燕(Flammulina velutipes)、黑曲霉(Aspergillus niger)、雙抱蘑燕(Agaricus bisporus)等，細(xì)菌中枯草桿菌(Bacillussubtilis)的草酸脫羧酶研究報道較多。草酸脫羧酶在醫(yī)療，食品，工業(yè)生產(chǎn)和生物監(jiān)測等領(lǐng)域都有非常大的應(yīng)用潛力(曹茂新等，草酸脫羧酶及其應(yīng)用，中國生物工程雜志，2005(增)170-175)。針對草酸鹽結(jié)晶引起的結(jié)石癥，目前已有一些使用草酸脫羧酶進(jìn)行預(yù)防與治療的報道，其中較有實(shí)用價值的是對草酸脫羧酶純品進(jìn)行結(jié)晶交聯(lián)固定化，制備交聯(lián)草酸脫羧酶結(jié)晶體制劑(oxdc-CLECs)(結(jié)晶化的草酸脫羧酶和使用方法，中國專利公開號:CN 101583375A)，但oxdc-CLECs的制備必須首先經(jīng)過酶蛋白的結(jié)晶操作，所需的酶純化程度和結(jié)晶條件都很高，操作困難，費(fèi)用較高。2000年荷蘭Delft大學(xué)的Sheldon小組提出了交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)的制備方法(Linqiu Cao等，Cross-Linked EnzymeAggregates:A Simple and Effective Method for the Immobilization of PenicillinAcylase, Org.Lett.,2000,2(10): 1361-1364)，該方法經(jīng)過聚集和交聯(lián)兩個過程。其中，酶聚集過程是非共價的結(jié)合，沒有造成酶三級結(jié)構(gòu)的破壞，再通過雙功能試劑的交聯(lián)制備固定化酶聚集體，使其保持有效結(jié)構(gòu)和催化活性。此外，酶聚集體的形成的過程中還可以去除粗酶中大部分雜蛋白，實(shí)現(xiàn)酶的初步純化，因此CLEAs實(shí)質(zhì)上可將酶的純化與固定化合并為一個單兀操作。(Burcu Selin Aytar Preparation of cross-linked tyrosinaseaggregates, Proeess Bioehemistry, 2008,43:125-131)。與交聯(lián)酶結(jié)晶體(CLECs)的制備方法相比，交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)方法具有對酶的純化度要求不高，操作簡單，成本低廉，設(shè)備簡單，單位體積活性大，固定化酶空間效率高等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對目前制備交聯(lián)草酸脫羧酶結(jié)晶體酶制劑存在的不足，提供了一種交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體(oxdc-CLEAs)的制備方法。該方法用乙醇、丙酮或硫酸銨對草酸脫羧酶進(jìn)行沉淀分離，并使用交聯(lián)試劑制備交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體，酶活力回收在90%以上。本發(fā)明方法使用設(shè)備簡單，操作簡單，成本低廉。對比游離草酸脫羧酶，oxdc-CLEAs的耐酸性、耐熱性、耐胰蛋白酶的降解能力均有較大提高，可用于制備預(yù)防和治療草酸鹽潔凈引起結(jié)石病的酶制劑。
本發(fā)明的技術(shù)方案:一種交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的制備方法。包括重組草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)，草酸脫羧酶的沉淀分離，交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的制備三部分。工藝步驟如下:
(I)重組草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)
將產(chǎn)草酸脫羧酶基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌生長至0D_為0.8時，加入MnCl2及IPTG誘導(dǎo)草酸脫羧酶表達(dá)，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液重懸菌體后進(jìn)行超聲破碎細(xì)菌，離心收集上清為粗酶液。
(2)草酸脫羧酶的沉淀分離
向草酸脫羧酶粗酶液緩慢加入適當(dāng)濃度的預(yù)冷硫酸銨、乙醇或丙酮，置于冰箱過夜，離心收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液重新溶解，獲得純化草酸脫羧酶。純化酶液利用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定分析。
`[0010](3)交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的制備
取分離純化酶液加入10% 50%乙醇于4°C冰箱沉淀過夜，得到草酸脫羧酶聚集體懸浮液。添加BSA0.lmg/L 1.50mg/L,加入交聯(lián)劑戍二醒溶液,在pH3 9,4°C條件下于交聯(lián)反應(yīng)0.5 3.5h。離心棄上清并用磷酸鹽緩沖液反復(fù)清洗沉淀，直至清洗液檢測不出任何活力即得到交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體，重懸于磷酸鹽緩沖液4°C冰箱保存。
草酸脫羧酶的活力檢測:反應(yīng)液含76mmol/L草酸鉀,50mmol/L pH 4.0朽1檬酸緩沖液，37°C水浴2min，加入草酸脫羧酶液開始反應(yīng)，IOmin后加入等體積的0.2mol/L磷酸氫二鉀使體系PH上升至中性終止反應(yīng)。終止反應(yīng)液體系加入輔酶NAD+以及甲酸脫氫酶，分光光度法340nm檢測分析甲酸脫羧酶催化反應(yīng)速度，計算甲酸的生成量。酶活力單位定義為:每分鐘催化轉(zhuǎn)化草酸產(chǎn)生I μ mo I甲酸的酶量。
交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體活性測定方法同游離草酸脫羧酶酶活力測定方法，反應(yīng)在120rpm震蕩條件下進(jìn)行。
交聯(lián)固定化酶活回收率:回收的交聯(lián)固定化酶的酶活力與用于交聯(lián)固定化的酶的總活力之比。
蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
①采用硫酸銨或有機(jī)溶劑沉淀法沉淀分離草酸脫羧酶，分離效率高，操作簡單，成本低，獲得草酸脫羧酶純度較高。
②利用交聯(lián)酶聚集體法(CLEAs)交聯(lián)固定草酸脫羧酶，把酶的純化和固定化合并成一個單元操作，不需要制備高純度酶交聯(lián)用酶，操作簡單，節(jié)約成本。
③交聯(lián)酶聚集體法制備得到交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體，耐酸性，耐熱性，耐胰蛋白酶降解能力均有提高，可作為酶制劑應(yīng)用于防治草酸鹽結(jié)晶導(dǎo)致的結(jié)石病。


圖1不同沉淀劑沉淀分級草酸脫羧酶的SDS-PAGE，圖中泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分別為粗酶液、25%乙醇、30%乙醇、25%丙酮、30%丙酮、蛋白質(zhì)marker、30%硫酸銨、40 %硫酸銨、60 %硫酸銨、粗酶液。
圖2游離草酸脫羧酶與交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的最適pH
圖3游離草酸脫羧酶與交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的最適反應(yīng)溫度
圖4游離草酸脫羧酶與交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的耐熱性
圖5 65°C游離草酸脫羧酶與交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的熱穩(wěn)定性
圖6游離草酸脫羧酶與交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體對胰蛋白酶的耐受性
具體實(shí)施方式
為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
實(shí)例1:
(I)重組草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)
將基因工程菌E.coli BL21 (DE3)/pET32a/YvrK接于含氨芐青霉素(0.lmg/ml)的LB培養(yǎng)基中37°C，250r/min進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)菌生長至OD6tltl為0.8時，加人6mmol/L的MnCl2,0.4mmol/L的IPTG，30°C誘導(dǎo)表達(dá)8h，離心收集細(xì)菌沉淀，按每克濕重菌體加IOmL磷酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH8.0)重懸菌體，超聲破碎細(xì)菌后，離心收集上清為粗酶液。
(2)草酸脫羧酶的沉淀分離
在IOml的試管中加入5ml粗酶液，逐滴滴加預(yù)冷無水乙醇至乙醇濃度為10% 50%，置于4°C冰箱過夜，離心收集沉淀，用50mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液重溶，獲得純化
草酸脫羧酶。
酶活力檢測及蛋白濃度分析表明，乙醇沉淀可除去粗酶液中66.2%的蛋白，酶活回收達(dá)91.2%，純化倍數(shù)為2.7倍。
(3)交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的制備
-在IOml離心管加入5ml純化酶液，逐滴滴加無水乙醇至乙醇濃度為20% 50 %，置于4 °C冰箱過夜，添加BSA至0.25mg/L 1.25mg/L,逐滴滴加戊二醛溶液至0.01% 0.15%，在pH3 9，4°C條件下交聯(lián)反應(yīng)0.5 3.5h，離心棄上清，用50mmol/LpH8.0磷酸鹽緩沖液洗滌至上清無酶活性，即得交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體。
測定該交聯(lián)酶聚集體的活力為780U/g，酶活力回收為65.7%。
實(shí)例2:
(I)重組草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表 達(dá)同實(shí)例I
(2)草酸脫羧酶的沉淀分離[0039]在IOml的試管中加入5ml粗酶液，逐滴滴加預(yù)冷丙酮至濃度10% 50%，置于4°C冰箱過夜，離心收集沉淀，用50mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液重溶，獲得純化草酸脫羧酶。
酶活力檢測及蛋白濃度分析表明，丙酮沉淀可除去粗酶液中73.6%的蛋白，酶活回收達(dá)79.2%，純化倍數(shù)為2.84倍。
(3)交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的制備
在IOml離心管加入5ml純化酶液，逐滴滴加無水乙醇至乙醇濃度為20% 50%，置于4 °C冰箱過夜，添加BSA至0.lmg/L 1.0mg/L,逐滴滴加戊二醛溶液至0.05 % 0.12%,在pH3 9,4°C條件下交聯(lián)反應(yīng)0.5 3.5h,離心棄上清,用50mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液洗滌至上清無酶活性，即得交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體。
測定該交聯(lián)酶聚集體的活力為650U/g，酶活力回收為52.8%。
實(shí)例3:
(I)重組草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)同實(shí)例I
(2)草酸脫羧酶的沉淀分離
在IOml的試管中加入5ml粗酶液，逐滴滴加預(yù)冷飽和硫酸銨至濃度20% 80%，置于4°C冰箱過夜，離心收集沉淀，用50mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液重溶，獲得去純化酸脫羧酶。
(3)交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的制備
在IOml離心管加入5ml純化酶液，逐滴滴加無水乙醇至乙醇濃度為10% 50%，置于4 °C冰箱過夜，添加BSA至1.0mg/L 1.5mg/L,逐滴滴加戊二醛溶液至0.01 % 0.08%,在pH3 9,4°C條件下交聯(lián)反應(yīng)0.5 3.5h,離心棄上清,用50mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液洗滌至上清無酶活性，即得交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體。
實(shí)例4:
(I)重組草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)同實(shí)例I
(2)草酸脫羧酶的沉淀分離同實(shí)例I
(3)交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的制備同實(shí)例I
(4)游離酶與交聯(lián)酶聚集體的性質(zhì)比較
①最適pH
在pH2.5至pH7.0的不同檸檬酸緩沖液反應(yīng)體系中分別測定游離酶與交聯(lián)酶聚集體的酶活力，以活性最高數(shù)據(jù)為100%酶活力，計算相對酶活力。
結(jié)果表明:交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的反應(yīng)pH范圍比草酸脫羧酶寬泛，在pH2.5的時候交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體還有80%的酶活力，而游離草酸脫羧酶的酶活力不到10 %，說明交聯(lián)聚集后的酶對酸性環(huán)境耐受能力更強(qiáng)。
②最適反應(yīng)溫度
反應(yīng)檸檬酸緩沖液ρΗ4.0，在不同溫度下分別測定酶活力，以活性最高數(shù)據(jù)為100%酶活力，計算不同溫度下的相對酶活力。
結(jié)果表 明:游離草酸脫羧酶和交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的最適反應(yīng)溫度均在47°C左右。
③耐熱性
游離酶與交聯(lián)酶聚集體在不同溫度下熱處理30min后測酶活力，觀察處理后酶活力的變化。將游離酶和交聯(lián)酶聚集體置于65°C水浴，每半小時取樣檢測殘余酶活。
結(jié)果表明:游離草酸脫羧酶的變性失活溫度低于65°C，交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的變性失活溫度高于70°C ;將游離草酸脫羧酶與交聯(lián)酶聚集體分別置于65°C水浴，每隔半小時測酶活力，3.5h內(nèi)，交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體酶活基本無損失，游離草酸脫羧酶在65°C下逐漸發(fā)生變性失活，半衰期tl/2為2h。
④對胰蛋白酶的耐受性
分別取4.5ml游離酶和交聯(lián)酶聚集體，加入2.5g/L的胰蛋白酶溶液0.5ml，37°C水浴，定時取樣檢測剩余酶活力，以原始活性數(shù)據(jù)為100%酶活力，觀察游離酶和交聯(lián)酶聚集體對抗胰蛋白酶消化的能力。
結(jié)果表明:交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體對胰蛋白酶消化的耐受能力顯著高于游離草酸脫羧酶，其中，使用胰蛋白酶處理48h后，交聯(lián)草酸脫羧酶殘余酶活力仍大于80%，而游離草酸脫羧酶殘余酶活力低于50%。通 過制備交聯(lián)酶聚集體，可提高草酸脫羧酶抵抗胰蛋白酶消化的能力，適用于開發(fā)藥用酶制劑。
權(quán)利要求
1.一種交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的制備方法，包括:重組草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)，草酸脫羧酶的分離純化，制備交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的步驟；其特征在于:使用乙醇、丙酮或硫酸銨對粗酶液中的草酸脫羧酶進(jìn)行沉淀分離，使用乙醇制備草酸脫羧酶聚集體懸浮液，使用交聯(lián)酶聚集體方法對草酸脫羧酶聚集體進(jìn)行交聯(lián)固定化；其中，交聯(lián)固定化反應(yīng)條件為:使用戊二醛濃度0.01% 0.15%, pH3 9，添加BSA濃度0.lmg/L 1.5mg/L，反應(yīng)溫度40C，交聯(lián)反應(yīng)時間0.5 3.5h。
2.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于:使用乙醇、丙酮或硫酸銨對粗酶液中的草酸脫羧酶進(jìn)行沉淀分離，乙醇濃度為10% 50%、丙酮濃度為10% 50%，硫酸銨濃度為20% 80%。
3.如權(quán)利要求
1所述的方法 ，其特征在于:使用10% 50%乙醇制備草酸脫羧酶聚集體懸浮液。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種交聯(lián)酶聚集體法(CLEAs)交聯(lián)固定草酸脫羧酶的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明包括重組草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)，草酸脫羧酶的分離純化和交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體的制備三部分。本發(fā)明的特點(diǎn)在于用乙醇、丙酮或硫酸銨對粗酶液中的草酸脫羧酶進(jìn)行沉淀分離，使用乙醇制備草酸脫羧酶聚集體，使用0.01％～0.15％的戊二醛在添加BSA0.1mg/L～1.5mg/L、pH3～9、4℃條件下交聯(lián)反應(yīng)0.5～3.5h，制備交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體，交聯(lián)固定化酶的酶活力回收達(dá)90％以上。本發(fā)明實(shí)驗操作簡單，成本低廉，獲得的交聯(lián)草酸脫羧酶聚集體穩(wěn)定性比游離草酸脫羧酶明顯提高，可應(yīng)用于開發(fā)針對草酸鹽結(jié)石病的酶制劑。
文檔編號C12R1/19GKCN102492683 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201110390880
公開日2013年6月12日 申請日期2011年12月1日
發(fā)明者林日輝, 梁躍, 黃文勤 申請人:南寧奕德環(huán)境科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan