專利名稱:一種羧肽酶(Aus CpA)基因的克隆及重組酶的制備的制作方法
一種羧肽酶(Aus CpA)基因的克隆及重組酶的制備技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的一種羧肽酶及其基因序列，羧肽酶基因工程菌的構(gòu)建，以其重組羧肽酶的表達(dá)及酶活測(cè)定方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
[0002]羧肽酶(Carboxyp印tidase)是一類肽鏈端水解酶，作用于肽鏈的游離羧基末端釋放單個(gè)氨基酸，其在醫(yī)藥和食品工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)藥領(lǐng)域，可用于重組人胰島素的生產(chǎn)，腫瘤抗體導(dǎo)向酶的前藥治療，以及作為診斷急性胰腺炎輕重程度的血清標(biāo)記等；在食品工業(yè)上，羧肽酶可作用于苦味肽，水解肽鏈羧基端的疏水性氨基酸，達(dá)到脫苦的目的。另外，羧肽酶還可用于多肽的氨基酸測(cè)序。羧肽酶有小麥羧肽酶、動(dòng)物羧肽酶和微生物羧肽酶，其中，動(dòng)物來(lái)源的羧肽酶主要存在于豬和牛等的胰臟中，數(shù)量非常有限，價(jià)格昂貴，其應(yīng)用因此而受到限制。而微生物來(lái)源的羧肽酶來(lái)源廣泛，目前已在酵母和霉菌中檢測(cè)到羧肽酶的存在。因此，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)羧肽酶具有廣闊的應(yīng)用前景。[0003]曲霉(Aspergillus)中存在的羧肽酶主要為絲氨酸羧肽酶，主要存在液泡中，在酸性環(huán)境下，它們同時(shí)具有末端蛋白水解酶、酯酶和脫酰胺酶的活性，參與多肽和蛋白質(zhì)的加工、修飾與降解等多個(gè)重要環(huán)節(jié)。亞夫爾在其發(fā)明專利(公開(kāi)號(hào)CN95191058.2)中報(bào)道了編碼黑曲霉羧肽酶的基因，其產(chǎn)生的羧肽酶存在于液泡中，可降解異源蛋白。Ichishima 等人分離得到的一株黑曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)羧肽酶，酶活為360mU/mL濾液。Krishnan等人用清酒曲培養(yǎng)基固體發(fā)酵培養(yǎng)黑曲霉產(chǎn)羧肽酶酶活為60. 5U/mg。Morita等人用土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基固體發(fā)酵生產(chǎn)羧肽酶0，酶活為463. 0mkat/kg(27. 780U/mg)。綜上所述，羧肽酶廣泛存在于曲霉中，但目前無(wú)論是液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵，微生物產(chǎn)羧肽酶活力均較低，導(dǎo)致了羧肽酶的生產(chǎn)和應(yīng)用成本高，從而限制了該酶的廣泛應(yīng)用。[0004]基因工程羧肽酶純度高、不含其他蛋白酶，不含動(dòng)物源性的任何物質(zhì)，終產(chǎn)物不需進(jìn)行病毒等的檢疫等，不含胰蛋白酶抑制劑-PMSF，同時(shí)，利用基因工程菌生產(chǎn)羧肽酶不受動(dòng)、植物原料來(lái)源的限制、不表達(dá)需要大面積的占地種植，也不受季節(jié)氣候的影響，不破壞資源，不污染環(huán)境，是一種安全、高效、高產(chǎn)、高質(zhì)的高新技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種羧肽酶及其基因序列，羧肽酶工程菌的構(gòu)建，以其重組羧肽酶的高效表達(dá)方法，經(jīng)生物信息學(xué)分析確定該酶屬于蛋白酶Sl家族，命名為Aus CpA, 相應(yīng)的基因序列命名為Aus cpA0 Aus CpA具有較好的活性和穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)的潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案一種來(lái)源于A.USamii EOOl的羧肽酶，其全基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :1，全基因獲取的過(guò)程如圖1所示。[0007]A.usamii EOOl已在文獻(xiàn)
宇佐美曲霉木聚糖酶基因xyn II在不同畢赤酵母中的分泌表達(dá)，生物加工過(guò)程，第6卷第2期，2008年3月
中公開(kāi)，本發(fā)明人承諾該微生物在20 年內(nèi)向公眾發(fā)放。[0008]所述的羧肽酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO :2。[0009]所述的羧肽酶基因的克隆及表達(dá)方法[0010](I)A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列的合成[0011]首先對(duì)Aspergillus terreus>Aspergi 1 Ius clavatus禾口 AspergiIlus niger 的羧肽酶的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，找出兩段約10個(gè)氨基酸的保守序列。然后對(duì)它們的mRNA 進(jìn)行同源比對(duì)，尋找出對(duì)應(yīng)的核苷酸序列后設(shè)計(jì)兩條簡(jiǎn)并引物AucpA-3Fl和AucpA-3F2 ；[0012]AucpA-3Fl 5' -TTGAGAAYCCDTACTCGT-3‘[0013]AucpA-3F2 5‘ -ACTGGAGARAGTTAYGCG-3‘[0014]提取A. usamii EOOl 的總 RNA，按照 TaKaRa 生產(chǎn)的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 中的說(shuō)明書進(jìn)行RT-PCR，經(jīng)過(guò)兩輪PCR可以得到羧肽酶基因3'端cDNA序列。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AucpA3 ‘，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列。[0015](2)A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列的合成[0016]以A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列設(shè)計(jì)兩條擴(kuò)增5‘端cDNA序列的反向引物 AucpA-5Rl 和 AucpA-5R2 ；[0017]AucpA-5Rl 5‘ -ACTGACCAATACAGGGAT-3‘[0018]AucpA-5R2 5‘ -AGCAGCGGATATGTAAGGA-3‘[0019]按照TaKafei生產(chǎn)的5' -Full RACE Kit中的說(shuō)明書進(jìn)行5‘ -RACE，最后經(jīng)過(guò)兩輪PCR可以得到羧肽酶基因5'端cDNA序列，將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析， 250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AucpA5'，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列。[0020](3)A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端調(diào)控序列的合成[0021]利用我們前期報(bào)道的T載體介導(dǎo)-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA_5Rl為引物進(jìn)行第一輪PCR，T-PrimerF和AucpA_R2為引物第二輪PCR，經(jīng)過(guò)兩輪PCR得到羧肽酶基因 5'端調(diào)控序列，將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與PUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AucpAP，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端調(diào)控序列。[0022](4)A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端調(diào)控序列的合成[0023]以A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列設(shè)計(jì)兩條擴(kuò)增3‘端調(diào)控序列的正向弓丨物 AucpA-F 1 禾口 AucpA-F2 ；[0024]AucpA-Fl 5' -GGGAATACTATCTACTATGGG-3‘[0025]AucpA-F2 5' -GTGATTATCAGTGCCTGGTG-3‘[0026]利用我們前期報(bào)道的T載體介導(dǎo)-PCR方法，以T-PrimerR和AucpA-Fl為引物進(jìn)行第一輪PCR ；然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板、T-PrimerR和AucpA-F2為引物進(jìn)行第二輪 PCR;將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與PUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AucpA3T，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端調(diào)控序列。[0027](5)A. usamii EOOl羧肽酶基因的生物信息學(xué)分析[0028]將Aus cpA的5'端cDNA與3'端cDNA進(jìn)行序列拼接，得到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至PolyA 的cDNA序列，在NCBI上進(jìn)行開(kāi)放閱讀框架(Open Reading Frame)分析，進(jìn)而推測(cè)出Aus cpA的氨基酸序列，然后進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；將cDNA序列與兩側(cè)調(diào)控序列進(jìn)行拼接，然后進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)和PolyA加尾信號(hào)預(yù)測(cè)。[0029](6)A. usamii EOOl羧肽酶基因內(nèi)含子序列的測(cè)定[0030]以預(yù)測(cè)出的A. usamii EOOl羧肽酶基因的cDNA為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物AucpA_F3 禾口 AucpA-R ；[0031]AucpA-F3 5' -GAATTCATGCTGTTTCGCAGTCTGTT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)；[0032]AucpA-R 5' -GCGGCCGCTTAGGCACTATCAATAGCAG-3 ‘，含 Not I 酶切位點(diǎn)；[0033]以A. usamii EOOl的基因組DNA為模板，AucpA_F3和AucpA-R為引物進(jìn)行PCR， 將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與PUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AucpA-DNA，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出A. usamii EOOl羧肽酶編碼區(qū)的DNA序列；將DNA序列與cDNA用 DNAMAN 6. 0進(jìn)行序列比對(duì)，便能得出A. usamii EOOl羧肽酶基因內(nèi)含子序列。[0034](7)構(gòu)建含有編碼A. usamii EOOl羧肽酶成熟肽基因的表達(dá)質(zhì)粒[0035]以預(yù)測(cè)出的A. usamii EOOl羧肽酶成熟肽基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)一對(duì)引物AucpA-F和 AucpA-R ；[0036]AucpA-F 5' -GAATTCATCCCTGTCGAGGACTAT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)；[0037]AucpA-R 5' -GCGGCCGCTTACAGGGTATCACGCCG-3 ‘，含 Not I 酶切位點(diǎn)；[0038]按照TaKafci 生產(chǎn)的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 中的說(shuō)明書進(jìn)行 RT-PCR 以 Oligo dT-Adaptor Primer為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer M4和AucpA-F 為引物進(jìn)行第一輪PCR ；以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板、AucpA-F和AucpA-R為引物進(jìn)行第二輪PCR ；將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與PUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-Aus cpA,經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。[0039]將測(cè)序結(jié)果正確的pUCm-T-Aus cpA與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-Aus cpA (圖 2)，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。[0040](8)GS115/Aus cpA的構(gòu)建、表達(dá)及活性測(cè)定[0041]用Mc I對(duì)pPIC9K-Aus cpA進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選， 得到高拷貝的重組GS115/Aus cpA,以手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物用茚三酮法進(jìn)行活性分析。[0042]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)[0043]本發(fā)明提供了一種羧肽酶及其基因序列，羧肽酶工程菌的構(gòu)建，以其重組羧肽酶的高效表達(dá)及活性測(cè)定方法。該羧肽酶具有較好的活性和穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)的潛力和經(jīng)濟(jì)意義，也為其它羧肽酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。


[0044]圖1 獲取A. usamiiAus cpA全基因序列的流程圖[0045]圖2 重組質(zhì)粒pPIC9K_Aus cpA構(gòu)建示意圖具體實(shí)施方式
[0046]實(shí)施例1A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列的合成[0047]按照TaKaRa 生產(chǎn)的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 中的說(shuō)明書進(jìn)行 RT-PCR 以 Oligo dT-Adaptor Primer為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer M4和 AucpA-3Fl 為引物進(jìn)行第一輪 PCR(94°C，2min ；94°C，30s，48°C，30s，72°C，90s，30 個(gè)循環(huán)； 72°C, IOmin)；以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板、M13Primer M4和AucpA_F2為引物進(jìn)行第二輪 PCR(94°C，2min ；94°C，30s，48°C，30s，72°C，90s，30 個(gè)循環(huán)；72°C, IOmin)；將兩輪PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與 pUCm-Τ連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AucpA3 ‘，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列。[0048]實(shí)施例2A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列的合成[0049]按照TaKaRa 生產(chǎn)的 5' -Full RACE Kit 中的說(shuō)明書進(jìn)行 5' -RACE 以 5' RACE Outer Primer 和 AucpA_5Rl 為引物進(jìn)行第一輪 PCR (94°C，3min ；94°C，30s，47°C，30s，72°C， lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin)；以第一輪的 PCR 產(chǎn)物為模板、5' RACE Inner Primer 和 AucpA5-R2 為引物進(jìn)行第二輪 PCR(94°C，3min ；94°C，30s，51°C，30s，72°C，lmin，30 個(gè)循環(huán)； 72°C,10min)；將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與PUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AucpA5 ‘，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出A. usamiiEOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列。[0050]實(shí)施例3A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端調(diào)控序列的合成[0051]利用我們前期報(bào)道的T載體介導(dǎo)-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA_5Rl為引物進(jìn)行第一輪 PCR (940C，4min ；94°C，30s，47°C，30s，72°C，lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin)；然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板、T-PrimerF和AucpA_R2為引物進(jìn)行第二輪PCR(94°C，^iin ； 94 °C，30s，51 °C，30s，72 °C，Imin，30 個(gè)循環(huán)；72 °C，1 Omin)；將兩輪 PCR 產(chǎn)物用 1 % 瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AucpAP，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出 A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端調(diào)控序列。[0052]實(shí)施例4A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端調(diào)控序列的合成[0053]利用我們前期報(bào)道的T載體介導(dǎo)-PCR方法，以T-PrimerR和AucpA_3Fl為引物進(jìn)行第一輪 PCR (940C，4min ；94°C，30s，47°C，30s，72°C，lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin)；然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板、T-PrimerR和AucpA_F2為引物進(jìn)行第二輪PCR(94°C，^iin ； 940C，30s, 470C，30s, 72°C，lmin30s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C, IOmin)；將兩輪 PCR 產(chǎn)物用 1 % 瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AuCpA3T，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出 A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端調(diào)控序列。[0054]實(shí)施例5A. usamii EOOl羧肽酶基因的生物信息學(xué)分析[0055]將AucpA的5 ‘端cDNA與3 ‘端cDNA進(jìn)行序列拼接，得到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至PolyA 的cDNA序列，在NCBI上進(jìn)行開(kāi)放閱讀框架(Open Reading Frame)分析，進(jìn)而推測(cè)出AucpA 的氨基酸序列，然后進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；將cDNA序列與兩側(cè)調(diào)控序列進(jìn)行拼接，然后進(jìn)行啟云力子區(qū)域預(yù)測(cè)(http //www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html)禾口 PolyA 力口尾信號(hào)預(yù)測(cè)(http://genes, mit. edu/GENSCAN. html)。[0056]實(shí)施例6A. usamii EOOl羧肽酶基因內(nèi)含子序列的測(cè)定[0057]以A. usamii EOOl的基因組DNA為模板，AucpA_F3和AucpA-R為引物進(jìn)行 PCR(94°C，4min ；94°C，30s，53°C，30s，72°C，2min，30 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin)，將 PCR 產(chǎn)物用 1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與 pUCm-Τ連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AucpA-DNA，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出A. usamii EOOl羧肽酶編碼區(qū)的DNA序列；將DNA序列與cDNA用DNAMAN 6. O 進(jìn)行序列比對(duì)，便能得出A. usamii EOOl羧肽酶基因內(nèi)含子序列。[0058]實(shí)施例7構(gòu)建含有編碼A. usamii EOOl羧肽酶成熟肽基因的表達(dá)質(zhì)粒[0059]按照TaKafci 生產(chǎn)的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O 中的說(shuō)明書進(jìn)行 RT-PCR 以 Oligo dT-Adaptor Primer為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer M4和AucpA-F 為引物進(jìn)行第一輪 PCR(94°C，2min ；94 °C, 30s, 50 "C, 30s, 72 °C，90s，30 個(gè)循環(huán)；72 °C， IOmin)；以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板、AucpA-F和AucpA-R為引物進(jìn)行第二輪PCR(94°C， 2min ;94°〇，308，501，308，721，908，30個(gè)循環(huán)；72°C，10min)；將兩輪 PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-Aus cpA，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果正確的pUCm-T-Aus cpA與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-Aus cpA,并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。[0060]實(shí)施例8GS115/Aus cpA的構(gòu)建、表達(dá)及活性測(cè)定[0061]用Mc I對(duì)pPIC9K-Aus cpA進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選， 得到高拷貝的重組GS115/Aus cpA,以手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物用茚三酮法進(jìn)行活性分析。
權(quán)利要求
1.一種來(lái)源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的羧肽酶，其完整的基因序列為 SEQ ID NO :1ο
2.如權(quán)利要求
1所述的羧肽酶，其氨基酸序列為SEQID NO :2。
3.A. usamii EOOl羧肽酶基因全基因序列獲得的方法(1)A.usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列的合成首先對(duì) Aspergillus terreus、Aspergillus clavatus 禾口 Aspergillus niger 的羧妝酶的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，找出兩段約10個(gè)氨基酸的保守序列。然后對(duì)它們的mRNA 進(jìn)行同源比對(duì)，尋找出對(duì)應(yīng)的核苷酸序列后設(shè)計(jì)兩條簡(jiǎn)并引物AucpA-3Fl和AucpA-3F2 ；AucpA-3Fl 5' -TTGAGAAYCCDTACTCGT-3‘AucpA-3F2 5 ‘ -ACTGGAGARAGTTAYGCG-3‘按照TaKaRa生產(chǎn)的RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O中的說(shuō)明書進(jìn)行RT-PCR 以O(shè)ligo dT-AdaptorPrimer為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13PrimerM4和AucpA_3Fl 為引物進(jìn)行第一輪 PCR(94°C，2min ；94 °C, 30s, 48 "C, 30s, 72 °C，90s，30 個(gè)循環(huán)；72 "C, IOmin)；以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板、M13Primer M4和AucpA_F2為引物進(jìn)行第二輪 PCR(940C，2min ；94°C，30s, 48°C，30s, 72°C，90s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin)；將兩輪 PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與 pUCm-Τ連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AucpA3 ‘，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列；(2)A.usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列的合成以A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列設(shè)計(jì)兩條擴(kuò)增5‘端cDNA序列的反向引物 AucpA-5Rl 和 AucpA-5R2 ；AucpA-5Rl 5' -ACTGACCAATACAGGGAT-3‘AucpA-5R2 5' -AGCAGCGGATATGTAAGGA-3‘按照 TaKaRa 生產(chǎn)的 5‘ -Full RACE Kit 中的說(shuō)明書進(jìn)行5' -RACE:以5' RACE Outer Primer和AucpA-5Rl為引物進(jìn)行第一輪 PCR(94°C，3min ；94°C，30s，47°C，30s，72°C，lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C, IOmin)；以第一輪的 PCR 產(chǎn)物為模板、5' RACE Inner Primer 和 AucpA5_R2 為引物進(jìn)行第二輪 PCR(94 °C，3min ； 94°C，30s，51°C，30s, 72°C，lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin)；將兩輪 PCR 產(chǎn)物用 1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接， 轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AuCpA5 ‘，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出 A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列；(3)A.usamii EOOl羧肽酶基因5'端調(diào)控序列的合成利用我們前期報(bào)道的T載體介導(dǎo)-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA-5Rl為引物進(jìn)行第一輪 PCR(94"C，4min ；94°C，30s, 47"C，30s, 72"C，lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin)；然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板、T-PrimerF和AucpA_R2為引物進(jìn)行第二輪PCR(94°C，^iin -MV, 30s, 51 °C, 30s, 72°C，lmin, 30個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin)；將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化 JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AucpAP，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端調(diào)控序列；(4)A.usamii EOOl羧肽酶基因的生物信息學(xué)分析將Aus cpA的5'端cDNA與3'端cDNA進(jìn)行序列拼接，得到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至PolyA的 cDNA序列，在NCBI上進(jìn)行開(kāi)放閱讀框架(Open Reading Frame)分析，進(jìn)而推測(cè)出Aus CpA 的氨基酸序列，然后進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；將cDNA序列與兩側(cè)調(diào)控序列進(jìn)行拼接，然后進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)(http //www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html)禾口 PolyA 力口尾信號(hào)預(yù)測(cè)(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)；(5)A.usamiiEOOl羧肽酶基因內(nèi)含子序列的測(cè)定以預(yù)測(cè)出的A. usamii EOOl羧肽酶基因的cDNA為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物AucpA_F3和 AucpA-R ；AucpA-F3 5' -GAATTCATGCTGTTTCGCAGTCTGTT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)；AucpA-R 5' -TTAGGCACTATCAATAGCAG-3‘，含 Not I 酶切位點(diǎn)；以A. usamii EOOl的基因組DNA為模板，AucpA_F3和AucpA-R為引物進(jìn)行PCR(94°C， 4min ；94°C，30s, 53°C，30s, 72°C，2min, 30 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin)，將 PCR 產(chǎn)物用 1 % 瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接， 轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AucpA-DNA，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得出 A. usamii EOOl羧肽酶編碼區(qū)的DNA序列；將DNA序列與cDNA用DNAMAN 6. 0進(jìn)行序列比對(duì)，便能得出A. usamii EOOl羧肽酶基因內(nèi)含子序列；(6)構(gòu)建含有編碼A.usamii EOOl羧肽酶成熟肽基因的表達(dá)質(zhì)粒以預(yù)測(cè)出的A. usami i EOO1羧肽酶成熟肽基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)一對(duì)引物AucpA-F和 AucpA-R ；AucpA-F 5' -GAATTCATCCCTGTCGAGGACTAT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)；AucpA-R 5' -GCGGCCGCTTACAGGGTATCACGCCG-3 ‘，含 Not I 酶切位點(diǎn)；按照TaKaRa生產(chǎn)的RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0中的說(shuō)明書進(jìn)行RT-PCR 以O(shè)ligo dT-Adaptor Primer為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer M4和AucpA-F 為引物進(jìn)行第一輪 PCR(94°C，2min ；94 °C, 30s, 50 "C, 30s, 72 °C，90s，30 個(gè)循環(huán)；72 "C, IOmin)；以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板、AucpA-F和AucpA-R為引物進(jìn)行第二輪PCR(94°C， 2min ;94°〇，308，501，308，721，908，30個(gè)循環(huán)；72°C，10min)；將兩輪 PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA Ladder Marker做對(duì)照，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-Aus cpA，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果正確的pUCm-T-Aus cpA與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-Aus cpA,并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定；(7)GS115/AuscpA的構(gòu)建、表達(dá)及活性測(cè)定用Mc I對(duì)pPIC9K-Aus cpA進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的重組GS115/Aus cpA,以手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物用茚三酮法進(jìn)行活性分析。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種新型羧肽酶及其基因序列，新型羧肽酶工程菌的構(gòu)建，以其重組羧肽酶的高效表達(dá)和純化方法，經(jīng)生物信息學(xué)分析確定該酶屬于蛋白水解酶S1家族，特命名為Aus CpA，相應(yīng)的基因序列命名為Aus cpA。Aus CpA具有較好的活性和穩(wěn)定性，有較大工業(yè)化生產(chǎn)的潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也為其他羧肽酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/66GKCN102492677SQ201110410568
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月12日
發(fā)明者吳靜, 曾研, 鄔敏辰, 閔柔, 黃芳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan