專利名稱:卡特拉鏈霉菌nb20及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護(微生物農(nóng)藥)領(lǐng)域，具體涉及一種卡特拉鏈霉菌NB20及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物病原菌(包括真菌、細菌、病毒等)引起的植物病害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大的經(jīng)濟損失。香蕉是世界著名的熱帶水果，也是華南地區(qū)四大名果之一，香蕉產(chǎn)業(yè)在華南地區(qū)的農(nóng)業(yè)和社會發(fā)展中起著重要的作用。香蕉采后果實腐爛一直是制約我國香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一，腐爛損失高達15% 30%,而由香蕉炭疽病菌iColletotrichum SMAsae)引起的炭疽病(anthracnose)是導(dǎo)致香蕉果實腐爛的重要原因之一，嚴重影響著我國香蕉的北運和出口。目前多采用殺菌劑浸果防治香蕉果實腐爛，以延長貨架期。隨著人們環(huán)保意識的增強和病原菌抗藥性的出現(xiàn)，生物防治已經(jīng)成為控制香蕉果實采后病害的研究熱點。
植物周圍不僅存在病原菌，而且還存在著大量的非病原菌，其中有的還是病原菌的拮抗微生物。這些拮抗微生物可通過與病原菌的抗生作用、競爭作用、重寄生作用及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等機理來抑制病原菌，達到防治植物病害的目的。此外，拮抗微生物對環(huán)境安全，不像化學(xué)農(nóng)藥那樣造成環(huán)境污染以及對人畜的毒害，同時拮抗微生物不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，有些還具有促進植物生長的作用，且實際生產(chǎn)工藝簡單。因此，利用拮抗微生物來防治植物病害的研究正越來越受到國內(nèi)外的重視。目前，人們已經(jīng)分離到多種對各種不同植物病害有不同程度防治效果的拮抗微生物，其中有些己經(jīng)進入實際應(yīng)用階段，產(chǎn)生了相當?shù)纳鐣б婧铜h(huán)境效益。
除了運用化學(xué)農(nóng)藥和植物提取物防控植物病害外，在微生物方面，也有關(guān)于利用枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌等拮抗微生物進行植物病害防治的報道，如中國專利文獻:一種植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，
公開日:2004/06/23,公開號為:1506455 ;—株可產(chǎn)生鐵載體的植物病原真菌拮抗菌及其應(yīng)用，
公開日:2008/07/30，公開號為:101230327 ;—株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的應(yīng)用，
公開日:2008/08/27，公開號為:101250495 ;—種銅綠假單胞菌DlO及其制備方法與應(yīng)用，
公開日:2010/04/28，公開號為:101698828A ;—種枯草芽孢桿菌A16及其制備方法與應(yīng)用，
公開日:2010/04/28，公開號為:101698829A。其它文獻:羅萍等.香蕉炭疽菌拮抗生防菌株的篩選及鑒定.現(xiàn)代食品科技，2011-4-19 ;陳旭玉等.香蕉炭疽病拮抗細菌的分離和初步鑒定.微生物學(xué)雜志，2011-01-18 ;許曼琳等.芽孢桿菌兩菌株對香蕉炭疽病菌的抑制作用及其機制.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009-08-21 ;趙志穎等.香蕉炭疽病生防拮抗菌篩選及其作用機制.福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998-06-12 ;何紅 等.辣椒內(nèi)生枯草芽孢桿菌BS-2和BS-1防治香蕉炭疽病.福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002-12-30。未見有關(guān)于卡特拉鏈霉菌在植物病害防治方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
[0005]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一株具有可抑制包括香蕉炭疽病菌在內(nèi)的多種植物病原菌的放線菌菌株。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的:
卡特拉鏈霉菌NB20,分類命名為:卡特拉鏈霉菌Sirepio焊Ce1S Aairae,于2011年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號CGMCC N0.5382。本發(fā)明中對上述菌株簡稱為卡特拉鏈霉菌ΝΒ20。該菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本發(fā)明還提供了一種生物菌劑，該生物菌劑含有卡特拉鏈霉菌NB20或含有卡特拉鏈霉菌NB20發(fā)酵液(即培養(yǎng)液)經(jīng)過濾后的無菌濾液，所述無菌濾液優(yōu)選用卡特拉鏈霉菌NB20培養(yǎng)液經(jīng)過離心取得的上清再經(jīng)過細菌過濾器過濾獲得。
該卡特拉鏈霉菌NB20的培養(yǎng)方法,培養(yǎng)條件如下:以大豆粉發(fā)酵液(大豆粉10.0g, NaCl 2.5 g，CaCO3 2.0 g，蛋白胨3.0 g，葡萄糖10.0 g，加水混勻至I L)為培養(yǎng)基，在28 °C、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)4 d，即得到可直接應(yīng)用的菌液。
卡特拉鏈霉菌NB2O在制備防治植物病原菌引起的植物病害菌劑中的應(yīng)用。所述植物病原菌為香蕉炭疽病菌iCoIletotrichum musae)>稻痕病菌iPyriculariaoryzae )、小麥赤霉病菌(bberella zeae )、香蕉枯萎病菌 iFusari um oxysporum f.sp.cMeflse)、蒸枝霜疫霉菌iPeronophythora Iitchii)、甘鹿黑腐病菌iCeratocystisadiposum)、番爺葉霉病菌iFulvia fulKa)、水稻白葉枯病菌iXanthomonas oryzae pv.和/或水稻細菌性條斑病菌Cf.0ryzae pv.0ryzicola)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
經(jīng)過實驗證實 ，本發(fā)明的卡特拉鏈霉菌NB20發(fā)酵液(菌劑)對香蕉炭疽病菌菌絲的抑制率為91.57%。室內(nèi)生防試驗結(jié)果表明，該菌株的發(fā)酵液(菌劑)對香蕉果實炭疽病具有較好的防治效果，達50.90%。此外，該生防菌株對稻瘟病菌、小麥赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌、番茄葉霉病菌、水稻白葉枯病菌和水稻細菌性條斑病菌等重要經(jīng)濟作物病原菌也具有強烈的抑制作用。因此，該菌株是一種對多種植物病原真菌和細菌都具有抑制作用的廣譜的生防菌株，且具有對人畜無害、綠色安全、環(huán)境兼容性好、不容易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點，能夠進行商業(yè)開發(fā)，應(yīng)用前景廣闊。


圖1.菌株NB20的培養(yǎng)形態(tài)，A為培養(yǎng)形態(tài)，a為高氏一號培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果，b為LB培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果，B為菌株NB20的孢子絲形態(tài)。
圖2.菌株NB的16S rDNA序列與相近菌株序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。
圖3.卡特拉鏈霉菌NB20對香蕉果實炭疽病的防治效果，I為CKl ;2 5為菌株NB20實驗組；6 7為CK2。
具體實施方式
實施例1卡特拉鏈霉菌NB20的篩選及鑒定
1、菌株的篩選
(I) 土壤樣品的采集[0019]本實驗從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場果園采集土樣，根據(jù)采集地的地形等采用5點取樣，取樣深度為耕作層或地表以下15 cm，取量200 250 g，每個地點采集的5個樣本均勻混合，裝入滅菌的封口聚乙烯袋，帶回實驗室馬上分離。
(2)樣品懸浮液的制備
將土壤樣品加入滅菌水中激烈震蕩。樣品:水=1:9 (質(zhì)量與體積比)，如:10 g 土壤加入裝有90 mL滅菌水的三角瓶中所得懸浮液濃度為10_/每種樣品各準備5支裝有9 mL滅菌水的試管按10倍梯度稀·釋法，將上述濃度為KT1的懸浮液稀釋成10_2 10_6的系列濃度懸浮液，即從I號試管中吸取1 mL懸浮液放入2號試管(盛有9 mL滅菌水)中，充分震蕩混勻，再從2號試管中吸取1 mL懸浮液放入3號試管(盛有9 mL滅菌水)中，依此類推，直至第6支試管為止，得到系列稀釋濃度的土樣懸浮液。
(3)分離方法
采用高氏I號培養(yǎng)基(加入重鉻酸鉀，終濃度為0.05 g/1000 mL)和低稀釋度土樣懸浮液(10_2 10_4)進行實驗。用移液器分別吸取上述不同稀釋度的溶液0.5 mL，滴加于培養(yǎng)基平板上(3平板/稀釋度)，用滅菌的L型玻棒涂布均勻，稍晾干，作好標記和日期，培養(yǎng)皿倒置，于25 28°C溫箱中培養(yǎng)2 3 d，根據(jù)平板上長出的單菌落挑出到新的含重鉻酸鉀的高氏I號培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，對全部分離到的菌株(稱為待測菌株)進行編號，然后對其拮抗活性進行初篩和復(fù)篩，以獲得本專利菌株。
(4)拮抗菌的初篩和復(fù)篩
采用平板對峙培養(yǎng)法，檢測上述各種待測菌株對香蕉炭疽病菌等病原菌的抑菌活性。用打孔器在培養(yǎng)好的香蕉炭疽病菌等病原菌的菌落邊緣打取直徑5 _的菌絲塊，接種在PDA平板中央，再將已經(jīng)活化的各種待測菌株接種在香蕉炭疽病菌等病原菌的菌絲塊四周2 3cm處，每個PDA平板接種4個待測菌株，設(shè)置不接種待測菌株的對照，每處理3次重復(fù)。在25 28°C下培養(yǎng):T5 d，然后測量待測菌株與香蕉炭疽病菌等病原菌之間的抑菌帶寬度，作為拮抗活性強弱的指標。
經(jīng)過上述初篩和復(fù)篩，獲得一株對香蕉炭疽病菌等多種病原菌具有強烈抑制作用的菌株，編號為NB20，保存?zhèn)溆谩?br>、鑒定過程實驗數(shù)據(jù)
( 1)形態(tài)學(xué)觀察
在高氏I號培養(yǎng)基上培養(yǎng)，NB20菌株的菌絲濃密，生長初其為乳白色，后變?yōu)樽霞t色?；鶅?nèi)菌絲發(fā)育良好，交織緊密，有大量分枝，無橫隔膜，不斷裂；氣生菌絲生長良好，多分支，可形成孢子鏈，孢子絲直形或波曲，頂端卷曲，孢子圓柱形、表面光滑；在LB培養(yǎng)基上，菌落近圓形，乳黃色，邊緣較整齊，菌體表面有褶皺，產(chǎn)生黑褐色可溶性色素(圖1)。
(2)培養(yǎng)性狀觀察
菌株NB20在所選的8種培養(yǎng)基上，其氣生菌絲和基內(nèi)菌絲的顏色有一定變化，氣生菌絲的顏色多為灰白至牽牛紫色。另外，該菌株只在馬鈴薯塊上形成黑色可溶性色素，在其它培養(yǎng)基上都均不形成可溶性色素。詳細結(jié)果見表I。
表1菌株NB20的培養(yǎng)性狀
權(quán)利要求
1.卡特拉鏈霉菌(5 /.<9/7 ο /^ 5.)ΝΒ20,于2011年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0.5382。
2.權(quán)利要求
1所述卡特拉鏈霉菌ΝΒ20，其特征在于該菌株的16SrDNA序列如SEQ IDNO:1所示。
3.—種生物菌劑，其特征在于含有權(quán)利要求
1或2所述卡特拉鏈霉菌NB20或含有卡特拉鏈霉菌NB20發(fā)酵液經(jīng)過濾后的無菌濾液。
4.權(quán)利要求
1或2所述 卡特拉鏈霉菌NB20的擴大培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)條件如下:以大豆粉發(fā)酵液為培養(yǎng)基，在28 °C、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)4 d； 其中大豆粉發(fā)酵液配方為:大豆粉10.0 g，NaCl 2.5 g，CaCO3 2.0 g，蛋白胨3.0 g，葡萄糖10.0 g，加水混勻至I L。
5.權(quán)利要求
1或2所述卡特拉鏈霉菌NB20在制備防治植物病原真菌和/或植物病原細菌引起的植物病害菌劑中的應(yīng)用，所述植物病原真菌為香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麥赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌或番茄葉霉病菌；所述植物病原細菌為水稻白葉枯病菌或水稻細菌性條斑病菌。
專利摘要
本發(fā)明公開了卡特拉鏈霉菌NB20及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，該菌株于2011年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.5382。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麥赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌、番茄葉霉病菌、水稻白葉枯病菌和水稻細菌性條斑病菌均具有強烈的抑制作用，為廣譜拮抗菌，可用于多種植物病害的防治，尤其是對香蕉果實炭疽病的防治效果較好，且具有對人畜無害、綠色安全、環(huán)境兼容性好、不容易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N1/20GKCN102433281 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201110423430
公開日2013年5月1日 申請日期2011年12月16日
發(fā)明者楊媚, 舒燦偉, 周而勛, 高艷麗, 張德濤, 范家平 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (1),