專利名稱:合成被保護(hù)的3′－氨基核苷單體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及合成可用于合成制備寡核苷酸類似物的被正交保護(hù)的(orthogonally protected)3’-氨基核苷單體的有效方法，并涉及通過這些方法制備的被正交保護(hù)的單體。
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背景技術(shù)：
依據(jù)于與靶核酸序列或蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合，已經(jīng)廣泛地研究了寡核苷酸和寡核苷酸類似物作為治療藥物的用途。已經(jīng)設(shè)計(jì)出了結(jié)構(gòu)上經(jīng)修飾的寡核苷酸類似物，其缺少了天然(磷酸二酯連接的)寡核苷酸對(duì)核酸酶的易感性，且在一些情況中，其表現(xiàn)出了其他有益的性能，例如與靶的結(jié)合力增加或結(jié)合的特異性增強(qiáng)。一種此類型的寡核苷酸類似物是N3’→P5’二氨基磷酸酯連接的寡核苷酸(phosphorodiamidate-linkedoligonucleotide)(Gryaznov and Chen，1994；Chen et al.，1994)。這些化合物是抗核酸酶的，其與互補(bǔ)RNA或雙鏈DNA靶形成了穩(wěn)定雙鏈，并且已經(jīng)證實(shí)在體外和體內(nèi)都具有顯著的序列特異的反義活性(Gryaznov et al.，1995；Escude et al.，1996；Gryaznov et al，1996；Giovannangeli et al，1997；Skorski et al，1997)。相關(guān)的N3’→P5’硫代氨基磷酸酯寡核苷酸保留了N3’→P5’氨基磷酸酯的高RNA結(jié)合親和力，并且也表現(xiàn)出提高了的酸穩(wěn)定性(Pongracz and Gryaznov，1999；Gryaznov et al，2001)。某些N3’→P5’硫代氨基磷酸酯寡核苷酸已經(jīng)顯示出有治療前途的端粒酶抑制活性(Gryaznov et al，2003；Asai et al，2003；Wang et al，2004)。
對(duì)N3’→P5’氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的逐步的、序列控制的制備采用了3’-氨基核苷單體，其中在添加過程中保護(hù)3’-氨基，然后被脫保護(hù)以添加更多的單體，以便生成寡核苷酸鏈(見，例如Gryaznovand Chen，1994；Pongracz and Gryaznov，1999)。因?yàn)橥ǔＴ诤铣蛇^程中被保護(hù)的核苷堿基上的基團(tuán)是伯胺，所以保護(hù)這些基團(tuán)中所具有的3’-氨基的需要已經(jīng)使得這些單體的制備變得復(fù)雜化?，F(xiàn)有的方法(見例如Nelsonet al，1997)需要多個(gè)步驟的保護(hù)，并通常涉及3’-羥基向3’-疊氮基(-N3)的轉(zhuǎn)化，之后被還原成了3’-胺。這些方法耗時(shí)、昂貴并造成單體總產(chǎn)率低。因此，需要提高這些合成法的效率，這將有助于N3’→P5’氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的制備。

發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備具有被保護(hù)的核苷堿基和被保護(hù)的3’-氨基的腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、或胞嘧啶核苷單體的方法，其中堿基和3’-氨基是被正交保護(hù)的。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法包括以下步驟(a)提供3’-氨基-3’-脫氧腺嘌呤核苷、3’-氨基-3’-脫氧胞嘧啶核苷或3’-氨基-3’-脫氧鳥嘌呤核苷的單體，所述單體的5’-羥基、核苷堿基和3’-氨基是未被保護(hù)的。
(b)選擇性地將3’-氨基與第一保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)；將5’-羥基與第二保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)；以及將核苷堿基與第三保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)；其中，可以在不使核苷堿基脫保護(hù)的條件下從3’-氨基去除第一保護(hù)基團(tuán)，且可以在不使核苷堿基或3’-氨基脫保護(hù)的條件下從5’-羥基去除第二保護(hù)基團(tuán)。方法還可以包括步驟(c)在不使核苷堿基或3’-氨基脫保護(hù)的條件下從5’-羥基去除保護(hù)基團(tuán)。
第一保護(hù)基團(tuán)可以是酸不穩(wěn)定的基團(tuán)，例如三芳基甲基例如三苯甲基(三苯甲基)、單甲氧基三苯甲基(MMT)、或二甲氧基三苯甲基(DMT)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一保護(hù)基團(tuán)是可以被堿性胺例如DBU或哌啶去除的9-芴甲氧羰基(Fmoc)或其衍生物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，被優(yōu)選地應(yīng)用于腺嘌呤核苷或胞嘧啶核苷單體的第二保護(hù)基團(tuán)或第三保護(hù)基團(tuán)是?；绫郊柞；?，以及(c)的條件包括氫氧化物離子的弱處理。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二保護(hù)基團(tuán)是堿不穩(wěn)定的三烷基硅醚，例如三甲基硅(TMS)醚，第三保護(hù)基團(tuán)是?；约?c)的條件包括以氫氧化物離子進(jìn)行弱處理。
在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，第二保護(hù)基團(tuán)是氟化物不穩(wěn)定的硅醚，第三保護(hù)基團(tuán)是?；约?c)的條件包括以氟離子進(jìn)行處理。這些氟化物不穩(wěn)定的硅醚包括例如叔丁基二甲基硅醚、叔丁基二苯基硅醚、二苯甲基硅醚、以及三(異丙基)硅醚。在一個(gè)實(shí)施方式中，氟化物不穩(wěn)定的硅醚是叔丁基二甲基硅(TBDMS)醚。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，方法包括步驟(a)提供3’-氨基-3’-脫氧腺嘌呤核苷、3’-氨基-3’-脫氧胞嘧啶核苷或3’-氨基-3’-脫氧鳥嘌呤核苷的單體，所述單體的5’-羥基、核苷堿基和3’-氨基是未被保護(hù)的；(b)選擇性地將3’-氨基與第一保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)；以及選擇性將核苷堿基與另一保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)；其中，可以在不使核苷堿基脫保護(hù)的條件下從3’-氨基去除第一保護(hù)基團(tuán)。
在這個(gè)方法的實(shí)施方式中，5’-OH基團(tuán)在保護(hù)核苷堿基的條件下仍然基本上是未反應(yīng)的，并且不需要分開的保護(hù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，單體是胞嘧啶單體，第一保護(hù)基團(tuán)是如上所述的保護(hù)基團(tuán)，且所述另一保護(hù)基團(tuán)是?；?，優(yōu)選地是苯甲?；?。優(yōu)選地可以通過與酰酐反應(yīng)的方式摻入?；Ｗo(hù)基團(tuán)。
在其他實(shí)施方式中，單體是鳥嘌呤核苷或腺嘌呤核苷單體，第一保護(hù)基團(tuán)是如上所述的基團(tuán)，而另一保護(hù)基團(tuán)是甲脒基例如二烷基甲脒基。
在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了制備具有游離的5’-羥基和被保護(hù)的3’-氨基的胸腺嘧啶核苷單體的方法，方法包括(a)提供3’-氨基-3’-脫氧胸腺嘧啶核苷單體，所述單體的5’-羥基和3’-氨基是未被保護(hù)的，以及(b)選擇性地將3’-氨基與第一保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)。
第一保護(hù)基團(tuán)可以是酸不穩(wěn)定的基團(tuán)，例如三芳基甲基例如三苯甲基(三苯甲基)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一保護(hù)基團(tuán)是可以被堿性胺例如DBU或哌啶所去除的9-芴甲氧羰基(Fmoc)或其衍生物。
這些合成方法中的起始單體和產(chǎn)物單體包括選自氫、羥基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷基、和氟(fluoro)的2’-基團(tuán)。在選定的實(shí)施方式中，單體包括選自氫、羥基、甲氧基和氟的2’-基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，單體是2’，3’-雙脫氧單體，這樣2’-基團(tuán)就是氫。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有一被保護(hù)的3’-氨基以及一核苷堿基的腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷或尿嘧啶核苷單體，所述核苷堿基(i)是未被保護(hù)的，或(ii)是被保護(hù)的，使得可以在不使核苷堿基脫保護(hù)的條件下使被保護(hù)的3’-氨基脫保護(hù)。在選定的實(shí)施方式中，可以用酸不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)例如三芳基甲基例如三苯甲基(三苯甲基)保護(hù)3’-氨基。在其他實(shí)施方式中，用可被堿性胺例如DBU或哌啶去除的9-芴甲氧羰基(Fmoc)或其衍生物保護(hù)3’-氨基。
在一個(gè)實(shí)施方式中，核苷堿基是未被保護(hù)的；在其他的實(shí)施方式中，用酰基保護(hù)核苷堿基。優(yōu)選地，當(dāng)單體是腺嘌呤核苷或胞嘧啶核苷單體時(shí)，?；潜郊柞；?；當(dāng)單體是鳥嘌呤核苷單體時(shí)，?；钱惗□；?。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方式中，用甲脒基保護(hù)核苷堿基，優(yōu)選地用二烷基甲脒基保護(hù)核苷堿基。
單體的5’-羥基可以是未被保護(hù)的，或者它可以是被保護(hù)的，使得可以在不使核苷堿基或3’-氨基脫保護(hù)的條件下將其脫保護(hù)。例如可以用對(duì)氟離子或弱堿不穩(wěn)定的硅醚保護(hù)5’-羥基，所述硅醚是例如上面所提及的硅醚。
單體優(yōu)選地包括2’-基團(tuán)，其選自氫、羥基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷基、和氟代基。在選定的實(shí)施方式中，單體包括2’-基團(tuán)，其選自氫、羥基、甲氧基和氟代基。在一個(gè)實(shí)施方式中，單體是2’，3’-雙脫氧單體，這樣2’-基團(tuán)就是氫。
當(dāng)結(jié)合附圖閱讀下面的本發(fā)明的具體實(shí)施方式
時(shí)，本發(fā)明的這些和其他的目的和特點(diǎn)將變得更為明了。
圖1是顯示根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方式用于合成3’-氨基腺嘌呤核苷單體、也應(yīng)用于合成3’-氨基胞嘧啶核苷單體的可選擇的示例性方法的方案；圖2A顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式用于合成3’-氨基鳥嘌呤核苷單體的示例性方法；圖2B顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式用于合成3’-氨基鳥嘌呤核苷單體的可選擇的示例性方法；圖2C顯示了根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式用于合成3’-氨基胞嘧啶核苷單體的方法；和圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式用于合成3’-氨基胸腺嘧啶核苷單體的示例性方法。
具體實(shí)施方式I.定義除非另有說明，以下術(shù)語具有下面的含義。
對(duì)于同一分子中的多個(gè)被保護(hù)的官能團(tuán)而言，“被正交保護(hù)的(orthogonally protected)”表示有可能使任何選定的基團(tuán)成員脫保護(hù)而不使其他基團(tuán)脫保護(hù)。
對(duì)于具有多個(gè)未被保護(hù)的官能團(tuán)的分子中的靶官能團(tuán)的保護(hù)而言，“選擇性地被保護(hù)”表示在分子與保護(hù)劑的反應(yīng)中，靶官能團(tuán)比任何非靶官能團(tuán)受到了更大程度的保護(hù)。靶官能團(tuán)的反應(yīng)程度與任何非靶官能團(tuán)的反應(yīng)程度的比例大于1∶1，優(yōu)選地大于2∶1，以及更優(yōu)選地大于3∶1或更高，例如大于9∶1。相同的定義適用于給定的官能團(tuán)與保護(hù)基團(tuán)的“選擇性地反應(yīng)”。
“與保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)”在此等同于“提供保護(hù)基團(tuán)”、“用保護(hù)基團(tuán)保護(hù)”、或“與保護(hù)基團(tuán)試劑反應(yīng)”。
“烷基”指的是由碳和氫組成的完全飽和的非環(huán)狀部分，其可以是線性的或分支的。烷基的實(shí)例是甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基、和異丙基。通常優(yōu)選的烷基是具有1到6個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，例如甲基、乙基、正丁基、異丁基、叔丁基、異戊基、正戊基、和異丙基。在其他實(shí)施方式中，低級(jí)烷基包括具有1到4個(gè)碳原子、或1到2個(gè)碳原子(甲基和乙基)的基團(tuán)。
“環(huán)烷基”指的是飽和的環(huán)狀烴，優(yōu)選地具有4到7個(gè)碳原子，更優(yōu)選地具有5個(gè)或6個(gè)碳原子(即環(huán)戊基或環(huán)己基)。
“烯基”指的是由碳和氫組成的不飽和的非環(huán)狀部分，其可以是線性的或分支的，具有1個(gè)或多個(gè)雙鍵。通常優(yōu)選的烯基是低級(jí)烯基，其具有2到6個(gè)、或2到4個(gè)碳原子。
“炔基”指的是由碳和氫組成的不飽和的非環(huán)狀的部分，其可以是線性的或分支的，含有1個(gè)或多個(gè)三鍵。通常優(yōu)選的炔基是低級(jí)炔基，其具有6個(gè)、或2到4個(gè)碳原子。
“芳基”指的是取代的或未取代的單價(jià)芳基，通常具有單個(gè)環(huán)(例如苯)或兩個(gè)縮合環(huán)(例如萘基)，其中單環(huán)的芳基是優(yōu)選的。術(shù)語包括雜芳基，其是在其環(huán)內(nèi)具有1個(gè)或多個(gè)氮、氧、或硫原子的芳香環(huán)基團(tuán)，例如呋喃基、吡咯基、吡啶基、和吲哚基?！叭〈摹币馑际欠蓟械囊粋€(gè)或多個(gè)環(huán)氫(優(yōu)選地1個(gè)或兩個(gè)環(huán)氫)被優(yōu)選地選自氟、氯、溴、甲基、乙基、甲氧基、鹵代甲氧基、和鹵代甲基的基團(tuán)所取代。用于保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選的芳基是碳環(huán)芳基，其可以是未取代的或者是被低級(jí)烷氧基(除了連接基團(tuán)與被保護(hù)基團(tuán)的取代基)取代的。
“芳烷基”指的是烷基，優(yōu)選地是低級(jí)(C1-C4，更優(yōu)選地C1-C2)烷基，取代基還被芳基(優(yōu)選地是單環(huán)的芳基)取代，實(shí)例是苯甲基(CH2C6H5)和苯乙基。
“酰基”指的是R(C＝O)-形式的取代基，其中R是如上定義的烷基、烯基、炔基、芳烷基、或芳基，并且優(yōu)選地選自低級(jí)烷基和單環(huán)的碳環(huán)芳基。實(shí)例包括苯甲?；?Ph(C＝O)-)、乙?；?CH3(C＝O)-)、和異丁?；?(CH3)2CH(C＝O)-)。
II.合成被保護(hù)單體在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了被正交保護(hù)的3’-氨基-5’-羥基核苷單體的有效合成，所述單體3’-位點(diǎn)上的氨基以及核苷堿基是被正交保護(hù)的，其起始于相應(yīng)的未被保護(hù)的3’-氨基核苷。典型地，然后將產(chǎn)物單體的游離的5’-羥基磷脂?；?，用于合成N3’→P5’-氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯寡核苷酸(見例如圖2B和圖3)。
A.起始材料用于單體合成的起始材料是具有下面的通用結(jié)構(gòu)式的3’-氨基核苷 其中BASE是選自鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)的未被保護(hù)的核苷堿基。例如在用于生成DNA類似物的2’，3’-雙脫氧單體中，2’-取代基X可以是氫。同樣，在用于生成RNA或O-烷基RNA類似物中，X可以是羥基或低級(jí)烷氧基例如甲氧基。2’-取代基也可以是氟(見例如美國專利No.5,684,143)或低級(jí)烷基例如甲基。
可以從位于芬蘭Littoinen的Metkinen Oy商品化地得到用作在此所述合成中的起始材料的3’-氨基-2’，3’-雙脫氧核苷。也可以從不同的來源例如Dalton Chemical Labs(Toronto，Canada)和MP Biomedicals Inc.(Irvine，CA)中商品化地得到3’-氨基-2’，3’-雙脫氧胸腺嘧啶核苷。在文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了3’-氨基-2’，3’-雙脫氧核苷的各種合成制劑(例如Zaitseva etal，1994；Cech et al，1996；Zaitseva et al，1984)。根據(jù)Zaitseva et al，1994，通過酶轉(zhuǎn)糖基作用可以將3’-氨基-2’，3’-雙脫氧胸腺嘧啶核苷轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的腺嘌呤核苷或鳥嘌呤核苷單體。
B1.保護(hù)策略概述本發(fā)明提供了用于將上述核苷轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的堿基被保護(hù)的(對(duì)于A、G、和C而言)、3’-氨基被保護(hù)的單體的有效方法。因?yàn)閴A基上必須被保護(hù)的基團(tuán)也是氨基，過去還沒有成功地在堿基未被保護(hù)的情況下進(jìn)行3’氨基的選擇性保護(hù)，反之亦然，且現(xiàn)有的用于制備這些單體的方法(見例如Nelson et al，1997)都需要多個(gè)保護(hù)步驟，并且通常涉及3’-羥基向疊氮基的轉(zhuǎn)化，其隨后被還原成了3’-胺。
本發(fā)明已經(jīng)提供了用于在存在核苷堿基的情況下選擇性地保護(hù)3’-氨基的有效方法，這樣使得然后可以以正交保護(hù)基團(tuán)(orthogonal protectinggroup)對(duì)核苷堿基進(jìn)行保護(hù)；即，在所選定的能有效去除3’-氨基保護(hù)基團(tuán)(或5’-羥基保護(hù)基團(tuán)，如果存在的話)的條件下，所述正交保護(hù)基團(tuán)不被去除。
另外，在存在5’-羥基時(shí)，也選擇性地保護(hù)3’-氨基，或者反之亦然。因此，給游離的5’-羥基提供保護(hù)基團(tuán)是有可能的，可以在所選定的不會(huì)去除3’-氨基保護(hù)基團(tuán)或堿基保護(hù)基團(tuán)的條件下去除該保護(hù)基團(tuán)。(或者，對(duì)于胸腺嘧啶而言，游離的5’-羥基可以被直接磷脂?；?。
5’-羥基的保護(hù)基團(tuán)可以是例如硅烷基，其在例如弱堿或氟離子的條件下可以被去除，該條件不會(huì)去除用于核苷堿基的保護(hù)基團(tuán)(通常是?；蝓０坊??；蛘撸嗤谋Ｗo(hù)基團(tuán)(例如?；?可以被用于5’-羥基和核苷堿基，其中所采用的將其去除的條件(例如弱堿)將使羥基脫保護(hù)但不使核苷堿基的氨基脫保護(hù)。
在進(jìn)一步的策略中，可以在使5’-羥基不發(fā)生反應(yīng)且因此不需要被保護(hù)的條件下對(duì)核苷堿基進(jìn)行保護(hù)。
在所有的情況中，所采用的核苷堿基的保護(hù)基團(tuán)在寡核苷酸合成中所采用的單體偶聯(lián)反應(yīng)的條件中都是穩(wěn)定的。例如在Gryaznov and Chen(1994)和Pongracz and Gryaznov(1999)中描述了用于由在此所述的單體制備成N3’→P5’氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯的方法。
B2.保護(hù)策略A、G、和C單體對(duì)于腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷或胞嘧啶核苷單體，本發(fā)明提供了制備具有游離的5’-羥基、被保護(hù)的核苷酸堿基、和被保護(hù)的3’-氨基的所述單體的方法，其中堿基和3’-氨基是被正交保護(hù)的，如上所定義的那樣。起始材料是3’-氨基-3’-脫氧腺嘌呤核苷、3’-氨基-3’-脫氧胞嘧啶核苷、或3’-氨基-3’-脫氧鳥嘌呤核苷的單體，所述單體的5’-羥基、核苷堿基、和3’-氨基是未被保護(hù)的。
在一個(gè)通用策略中，方法包括選擇性地將3’-氨基與第一保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)、將5’-羥基與第二保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)、以及將核苷堿基與第三保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)。第一保護(hù)基團(tuán)(用于保護(hù)3’-氨基)是使得在不會(huì)使核苷堿基脫保護(hù)的條件下而可以將其(第一保護(hù)基團(tuán))從3’-氨基去除的保護(hù)基團(tuán)。此外，如果存在，第二保護(hù)基團(tuán)(用于保護(hù)5’-羥基)是使得在不會(huì)使核苷堿基或3’-氨基脫保護(hù)的條件下而可以將其(第二保護(hù)基團(tuán))從5’-羥基去除的保護(hù)基團(tuán)。
根據(jù)上面的通用策略，在保護(hù)了所需的反應(yīng)基團(tuán)之后，如果存在，可以在不會(huì)使核苷堿基或3’-氨基脫保護(hù)的條件下去除5’-羥基中的第二保護(hù)基團(tuán)。然后可以將單體磷脂酰化，例如用于寡核苷酸合成。
第一、第二、和第三保護(hù)基團(tuán)通常是依次使用的，不過第二和第三個(gè)基團(tuán)實(shí)際上可以是相同的，因此可以被用于單個(gè)反應(yīng)。此外，在采用該步驟的策略中，對(duì)5’-羥基的保護(hù)可以發(fā)生在對(duì)3’-氨基的保護(hù)之前或之后。通常在單容器反應(yīng)中進(jìn)行兩個(gè)反應(yīng)，不過優(yōu)選地不同時(shí)添加試劑。優(yōu)選地，首先添加3’-氨基保護(hù)劑，如在下面的實(shí)施例中所舉例說明的那樣。
在選定的實(shí)施方式中，如下面進(jìn)一步的討論的那樣，在如例如在圖1(結(jié)構(gòu)2向結(jié)構(gòu)6的轉(zhuǎn)化)和圖2B中所示的堿基保護(hù)步驟過程中，采用了用堿不穩(wěn)定的硅醚(例如TMS)對(duì)5’-羥基的臨時(shí)保護(hù)。
在其他實(shí)施方式中，用同一試劑保護(hù)5’-羥基和核苷堿基，隨后選擇性地使羥基脫保護(hù)。這樣一種試劑通常是?；瘎├绠惗□；u化物或苯甲酰鹵化物。在圖1的結(jié)構(gòu)2向3的轉(zhuǎn)化中顯示了這種類型的示例性方案，隨后在選擇性地使羥基脫保護(hù)的溫和條件下，用堿進(jìn)行處理(3向6的轉(zhuǎn)化)。
如上所述，用于保護(hù)3’-氨基的第一保護(hù)基團(tuán)是在能去除第二保護(hù)基團(tuán)(對(duì)于5’-羥基)(如果存在)的條件下是穩(wěn)定基團(tuán)，同時(shí)在不會(huì)去除第三保護(hù)基團(tuán)(對(duì)于核苷堿基)的條件下是不穩(wěn)定基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一保護(hù)基團(tuán)是酸不穩(wěn)定的，例如三芳基甲基例如三苯甲基(三苯甲基)、單甲氧基三苯甲基(MMT)、或二甲氧基三苯甲基(DMT)。
另一個(gè)用作第一保護(hù)基團(tuán)的基團(tuán)是9-芴甲氧羰基(Fmoc)，其通過堿性胺的非水解性裂解是可以被去除的，所述堿性胺例如為DBU、嗎啉、或哌啶。氫氧化物堿(例如NaOH)不適用于這個(gè)目的，因?yàn)樵撛噭┩ǔＲ踩コ朔肿又械钠渌Ｗo(hù)基團(tuán)。也可以使用通過相似的機(jī)制可以被去除的Fmoc的衍生物。這些衍生物包括那些其中Fmoc的芴基(通常是2和/或7位點(diǎn)上的芴基)通常被基團(tuán)例如低級(jí)烷基取代(這不會(huì)影響裂解機(jī)制)的、或者被吸電子基團(tuán)例如鹵素取代(其增加了保護(hù)基團(tuán)的堿不穩(wěn)定性)的衍生物(Carpino et al.，1980)。也包括在Carpino et al.，1989中所述的硫雜蒽二氧化物類似物。
圖1顯示了能用于制備目標(biāo)單體的合成策略的示例性排列。這些方法特別適用于A(腺嘌呤核苷)和C(胞嘧啶核苷)核苷單體。如下面所述的那樣，該方法也可以適用于G(鳥嘌呤核苷)單體，優(yōu)選地方法要進(jìn)行一些修飾。在圖1和2A-B舉例說明的策略中，采用了對(duì)5’-羥基的保護(hù)。下面進(jìn)一步討論的圖2C例舉了其中沒有采用5’-羥基保護(hù)的策略。
如上所述，優(yōu)選的第一保護(hù)基團(tuán)(用于保護(hù)3’-氨基)是酸不穩(wěn)定的基團(tuán)，例如三苯甲基、MMT或DMT，或是對(duì)堿性胺試劑例如DBU不穩(wěn)定的基團(tuán)例如Fmoc。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選的第二和第三保護(hù)基團(tuán)都是芳香?；绫郊柞；?。在這種情況中，在不會(huì)使核苷堿基或3’-氨基脫保護(hù)的條件下能有效地使5’-羥基脫保護(hù)的條件優(yōu)選地包括弱堿處理，例如用氫氧化物例如氫氧化銨處理。這些處理能有效地去除5’-羥基中的酰基，以及將二?；瘔A基轉(zhuǎn)化成單?；瘔A基。圖1圖解了這種方案，其中中間物3被轉(zhuǎn)化成了產(chǎn)物6。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，用于保護(hù)5’-羥基的第二保護(hù)基團(tuán)是堿不穩(wěn)定的三烷基硅醚，優(yōu)選地是TMS，以及第三保護(hù)基團(tuán)(用于保護(hù)核苷堿基)是?；?，例如烷?；?，優(yōu)選地是異丁?；虮郊柞；?。在這種情況中，在不會(huì)使核苷堿基或3’-氨基脫保護(hù)的條件下能有效地使5’-羥基脫保護(hù)的條件也優(yōu)選地包括弱堿處理，例如用氫氧化物例如氫氧化銨處理。該處理能有效地裂解三甲基硅醚，以及如果存在，可以將二?；瘔A基轉(zhuǎn)化成單?；瘔A基。圖1也圖解了該方案的實(shí)例，其中中間物2被轉(zhuǎn)化成了產(chǎn)物6。
另一種特別適用于腺嘌呤核苷和鳥嘌呤核苷單體的優(yōu)選形式的核苷堿基保護(hù)基團(tuán)是甲脒基保護(hù)基團(tuán)，例如二烷基-、二(環(huán)烷基)-、或二(芳烷基)-甲脒基，其中“烷基”優(yōu)選地是C1-C4以及“環(huán)烷基”優(yōu)選地是C5-C6。具體的實(shí)例包括二甲基甲脒基和二芐基甲脒基。在能去除苯甲?；虍惗□；Ｗo(hù)基團(tuán)的更弱的條件下一般都可以從核苷堿基(例如在合成結(jié)束時(shí))中去除這些保護(hù)基團(tuán)。見，例如Vu et al.，1990、Vincent et al.，1999、和/或每個(gè)專利No.5,281,701。如在此所述的，伯胺與二烷基甲酰胺二甲基縮醛的反應(yīng)例如提供了二烷基甲脒基保護(hù)基團(tuán)。通過用水的或醇的氫氧化銨在室溫到約55℃下的處理一般都可以實(shí)現(xiàn)脫保護(hù)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二保護(hù)基團(tuán)(用于保護(hù)5’-羥基)是氟化物不穩(wěn)定的硅醚，以及第三保護(hù)基團(tuán)(用于保護(hù)核苷堿基)是?；绫郊柞；⒒蛉缟纤龅募纂呋?。在這種情況中，在不會(huì)使核苷堿基或3’-氨基脫保護(hù)的條件下能有效地使5’-羥基脫保護(hù)的條件優(yōu)選地包括氟離子例如氟化四丁銨(tetrabutylammonium fluoride，TBAF)的處理。該處理能有效地裂解硅醚，以及如果存在，可以將二?；瘔A基轉(zhuǎn)化成單酰基化堿基。圖1也圖解了該方案的實(shí)例，其中中間物5被轉(zhuǎn)化成了產(chǎn)物6。示例性的氟化物不穩(wěn)定的硅醚包括例如叔丁基二甲基硅醚、叔丁基二苯基硅醚、二苯甲基硅醚、三(異丙基)硅醚、和其他本領(lǐng)域已知的硅醚。
經(jīng)過一些主要與溶解度相關(guān)的修飾，上面的方法也可以用于鳥嘌呤核苷(G)單體。在一個(gè)實(shí)施方式中，如圖2A圖解的那樣，在方法的早期階段，用親脂性基團(tuán)例如TBDMS保護(hù)起始單體7的5’-羥基，以便提高在常用溶劑吡啶中的溶解度。
如上所述，優(yōu)選的第一保護(hù)基團(tuán)(用于保護(hù)3’-氨基)是酸不穩(wěn)定的基團(tuán)例如三苯甲基、DMT、或MMT、或者是對(duì)堿性胺試劑例如DBU不穩(wěn)定的基團(tuán)例如Fmoc。在圖2A的實(shí)施方式中采用了三苯甲基。根據(jù)反應(yīng)條件，除了所需的3’-單三苯甲基化的化合物8外，可以觀察到少量(例如約5％)雙三苯甲基化的化合物9。因此，“選擇性保護(hù)”在此表示具有所需保護(hù)狀態(tài)的分子比其中非靶官能團(tuán)(或者排它的或者除了靶官能團(tuán)外的基團(tuán))受到保護(hù)的分子形成的更多，即比例大于1∶1。優(yōu)選地，比例大于2∶1，更優(yōu)選地大于3∶1，以及最優(yōu)選地大于9∶1。
在一個(gè)實(shí)施方式中，第二保護(hù)基團(tuán)(用于保護(hù)5’-羥基)是氟化物不穩(wěn)定的硅醚，以及更優(yōu)選地是增加中間物的溶解度的基團(tuán)。如圖2A所示的，發(fā)現(xiàn)TBDMS醚能增加在溶劑吡啶中的溶解度。
第三保護(hù)基團(tuán)優(yōu)選地是?；?，例如異丁酰基、或如上所述的甲脒基。在這種情況中，在不會(huì)使核苷堿基或3’-氨基脫保護(hù)的條件下能有效地脫保護(hù)5’-羥基的條件優(yōu)選地包括氟離子例如氟化四丁銨(TBAF)的處理。如圖2A所示，該處理能有效地裂解化合物10中的硅醚，而不影響異丁?；蛉郊谆?。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，如在圖2B所示的，用更極性的溶劑例如DMF溶解初始單體7，反應(yīng)方案在其他方面都與圖1所示的用于保護(hù)腺嘌呤核苷單體1的“臨時(shí)保護(hù)”方案(用TMS醚作為5’羥基保護(hù)基團(tuán))相似。
圖2C圖解了特別適用于胞嘧啶單體的合成策略的實(shí)施方式，其中沒有采用5’-羥基保護(hù)。在這個(gè)反應(yīng)方案中，在例如用三苯甲基選擇性保護(hù)單體12中的3’-氨基之后，堿基的環(huán)外氨基與酰酐例如苯甲酰酐反應(yīng)。溶劑優(yōu)選地含有醇，相信其競爭并抑制了與5’-羥基的反應(yīng)。實(shí)例包括甲醇、乙醇、以及這些溶劑與例如乙腈、DMF、或吡啶的混和物。在利用如實(shí)施例4所述的乙醇中的或9∶1乙腈∶甲醇中的苯甲酰酐的反應(yīng)中，觀察到了很少量的(＜5％)5’-苯甲?；漠a(chǎn)物。然后可以用標(biāo)準(zhǔn)方法將主要的5’-羥基單體14磷脂?；?。
在另一個(gè)特別適用于腺嘌呤核苷或鳥嘌呤核苷單體的實(shí)施方式中，在利用三苯甲基選擇性保護(hù)單體的3’-氨基之后，用二烷基甲脒基、二(環(huán)烷基)甲脒基、或二芐基甲脒基(優(yōu)選地用二甲基甲脒基)保護(hù)堿基的環(huán)外氨基。然后可以用標(biāo)準(zhǔn)方法將預(yù)期在這些步驟中仍為基本上或完全未反應(yīng)的5’-羥基磷脂酰化。
B3.保護(hù)策略T單體在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備具有游離的5’-羥基和被保護(hù)的3’-氨基的胸腺嘧啶核苷單體的方法。合成策略不同于上面所述的方法，其中在寡核苷酸合成的條件下一般都不需要保護(hù)胸腺嘧啶堿基。這種情況中的起始材料是3’-氨基-3’-脫氧胸腺嘧啶核苷單體，所述單體的5’-羥基和3’-氨基是未被保護(hù)的，且該方法包括將所述3’-氨基與第一保護(hù)基團(tuán)選擇性反應(yīng)，使得5’-羥基仍然是基本上未被保護(hù)的。
如在上面所述的合成中，用于保護(hù)3’-氨基的優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)是酸不穩(wěn)定的基團(tuán)，例如三芳基甲基，或者是對(duì)堿性胺試劑例如DBU不穩(wěn)定的基團(tuán)例如Fmoc。在圖3的實(shí)施方式中采用了三苯甲基。
如在下面的實(shí)施例5中所述的那樣，然后將5’-羥基磷酯?；?。要注意，該磷脂?；^程也適用于上面所述的任一5’-羥基、3’-氨基被保護(hù)的以及堿基被保護(hù)的單體。
實(shí)施例下面的實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明，其并不打算限制本發(fā)明。例如，根據(jù)本領(lǐng)域熟練人員的知識(shí)，利用常規(guī)試驗(yàn)，反應(yīng)條件例如溶劑選擇、催化劑(例如三乙胺或二異丙乙胺)、反應(yīng)時(shí)間、和反應(yīng)溫度通常都可以不同于下面所例舉的條件。在一些情況中，添加試劑的次序可以有所不同。除非有其他的說明，適用于這些反應(yīng)中的絕大多數(shù)反應(yīng)的溶劑通常包括極性的疏質(zhì)子溶劑(aprotic solvent)例如吡啶、DMF、乙腈、或其混和物。合適的溫度一般是-10℃到室溫到約55℃的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1由3’氨基-2’，3’-雙脫氧腺嘌呤核苷合成N6-苯甲酰基-3’-氨基三苯甲基-2’，3’-雙脫氧腺嘌呤核苷A.方法1過苯甲?；緩?如圖1所示，1→2→3→6)用干吡啶共蒸發(fā)初始單體3’-氨基-2’，3’-雙脫氧腺嘌呤核苷(1，10mmol)，然后重懸于100ml含有6eq.三乙胺的干吡啶中，攪拌下將混和物加熱到50℃。加入三苯甲基氯化物(1.1 eq.)，繼續(xù)在50℃下攪拌2個(gè)小時(shí)。將所得到的含有3’-三苯甲基化單體2的清澈溶液冷卻到0℃，一滴一滴地加入5eq.苯甲酰氯，并攪拌反應(yīng)混和物1個(gè)小時(shí)，然后將其傾倒到100ml冷5％碳酸氫鈉內(nèi)。用乙酸乙酯提取出沉淀出來的黃色粘性物(yellow gum)，以及蒸發(fā)乙酸乙酯溶液。將所形成的油(3，在5’-羥基上具有一個(gè)苯甲?；约霸趬A基的N6上具有兩個(gè)苯甲?；?溶解于50ml吡啶∶甲醇∶水(65∶35∶5v/v/v)內(nèi)，將溶液冷卻到0℃，并且加入50ml 2M氫氧化鈉。在0℃下攪拌25分鐘之后，用吡啶鹽酸中和反應(yīng)混和物，以及用蒸發(fā)減少混和物的體積。在用乙酸乙酯稀釋之后，分離出有機(jī)層，用飽和碳酸氫鈉洗滌，并在真空中蒸發(fā)。用利用二氯甲烷∶甲醇95∶5v/v溶劑系統(tǒng)的硅膠閃光柱色譜法純化產(chǎn)物。加有游離的5’-羥基和單苯甲酰基化的堿基的產(chǎn)物(6)的分離產(chǎn)率是2.0g(33.6％)。
B.方法2臨時(shí)保護(hù)途徑(如圖1所示，1→2→6)將初始單體3’-氨基-2’，3’-雙脫氧腺嘌呤核苷(1，10mmol)轉(zhuǎn)化成如上所述的3’-氨基被保護(hù)的單體，即通過1.1eq.含有6eq.三乙胺的干吡啶的三苯甲基氯化物在50℃下的處理。
將清澈溶液2冷卻到0℃，逐滴地加入5eq.三甲基氯硅烷，之后攪拌30分鐘，生成了5’-OTMS中間物。然后逐滴加入苯甲酰氯(5eq)，之后在室溫下攪拌2個(gè)小時(shí)，生成了單苯甲?；?或雙苯甲酰化的堿基被保護(hù)的中間物。將反應(yīng)混和物冷卻到0℃，加入20ml冷水，之后攪拌20分鐘以及加入20ml濃縮的氫氧化銨。繼續(xù)攪拌30分鐘，真空下濃縮溶液。用乙酸乙酯收集油狀殘余物，用飽和的碳酸氫鈉洗滌，干燥溶液并在真空下蒸發(fā)。用硅膠色譜法如上純化產(chǎn)物。產(chǎn)物的分離產(chǎn)率是3.6g(60.2％)。
在隨后的方法中，DMF或DMF/吡啶、以及所加入的三乙胺被用作為初始三苯甲基化反應(yīng)的溶液，用方法A或方法B進(jìn)一步反應(yīng)中間物2，以生成產(chǎn)物6(產(chǎn)率約為70％)。發(fā)現(xiàn)在苯甲酰化之前去除三乙胺(例如用水洗滌)可以使產(chǎn)率有所提高，特別是用方法A時(shí)。觀察到該處理阻止了相信是腺嘌呤堿基的環(huán)開放所生成的副產(chǎn)物的形成。通過在進(jìn)一步反應(yīng)之前分離出三苯甲基化產(chǎn)物2也消除了該副產(chǎn)物的形成。
C.方法3TBDMS保護(hù)途徑(如圖1所示，1→2→4→5→6)將初始單體3’-氨基-2’，3’-雙脫氧腺嘌呤核苷(1，10mmol)轉(zhuǎn)化成如上所述的3’-氨基被保護(hù)的單體2，即通過1.1eq.含有6 eq.三乙胺的干吡啶的三苯甲基氯化物在50℃下的處理。
往清澈溶液中加入2 eq.叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMS Cl)，繼續(xù)在室溫下攪拌過夜。將該溶液(3’-三苯甲基氨基-5’-TBDM硅烷氧基中間物4)冷卻到-5℃，逐滴加入3eq苯甲酰氯，之后在室溫下攪拌兩個(gè)小時(shí)，提供了N6-二苯甲?；虚g物5。真空下濃縮溶液，用乙酸乙酯收集油狀殘余物，用飽和的碳酸氫鈉洗滌，干燥溶液并在真空下蒸發(fā)。
將所得到的油狀殘余物溶解于100ml THF，并加入2 eq.TBAF(氟化四丁銨)。室溫下攪拌混和物過夜。往反應(yīng)混和物中加入乙酸乙酯，用碳酸氫鈉、0.5M檸檬酸鈉(pH值4)和鹽鹵洗滌溶液。用硅膠色譜法如上純化產(chǎn)物，生成了3.3g(55.5％)純化合物6。
實(shí)施例2N4-苯甲酰-3’-氨基三苯甲基-2’，3’-雙脫氧胞嘧啶核苷的合成利用任一上面的方法或根據(jù)實(shí)施例4的方法，可以用相似的方式實(shí)現(xiàn)由3’-氨基-2’，3’-雙脫氧胞嘧啶核苷合成N4-苯甲酰-3’-氨基三苯甲基-2’，3’-雙脫氧胞嘧啶核苷。
實(shí)施例3由3’-氨基-2’，3’-雙脫氧鳥嘌呤核苷合成N2-異丁?；?3’-氨基三苯甲基-2’，3’-雙脫氧鳥嘌呤核苷(圖2A)用干吡啶共蒸發(fā)起始材料3’-氨基-2’，3’-雙脫氧鳥嘌呤核苷(7，2g)，然后重懸于100ml干吡啶內(nèi)，加入6eq.二異丙基乙胺。加入叔丁基二甲基氯硅烷(2eq.)，生成了5’-TBDM硅烷氧中間物。在攪拌30分鐘之后，分兩部分加入1.1eq.三苯甲基氯化物，繼續(xù)在室溫下攪拌過夜。用TLC檢測到兩種化合物，更慢流動(dòng)的、更豐富的產(chǎn)物8是所需的5’-TBDMS-3’-氨基三苯甲基-2’，3’-雙脫氧鳥嘌呤核苷。更快流動(dòng)的、更少量的化合物9是堿基被附加地三苯甲基化的產(chǎn)物。用利用甲撐氯∶甲醇∶三乙胺94∶5∶1(v/v/v)溶劑系統(tǒng)的硅膠色譜法分離出單三苯甲基化合物8。
用干吡啶共蒸發(fā)該產(chǎn)物，并將其溶解于100ml吡啶內(nèi)。溶液被冷卻到0℃，并加入1.1eq.異丁酰氯，之后攪拌30分鐘。在甲醇淬火反應(yīng)以及在真空中蒸發(fā)之后，用甲撐氯-碳酸氫鈉進(jìn)行反應(yīng)。用硫酸鈉干燥有機(jī)相，并在真空中將其蒸發(fā)。將油狀殘余物(完全被保護(hù)的單體10)溶解于100ml丁撐氧內(nèi)，加入5eq.氟化四丁銨。室溫下攪拌反應(yīng)混和物過夜，然后用乙酸乙酯稀釋，用碳酸氫鈉洗滌。在用硫酸鈉干燥之后，真空內(nèi)蒸發(fā)溶劑以生成2g 5’-羥基產(chǎn)物11(46.1％)。
在之后的方法中，在DMF/吡啶中、50℃下進(jìn)行對(duì)7的三苯甲基化，通過從二氯甲烷或水中沉淀出主要產(chǎn)物8可以去除副產(chǎn)物9(＜5％)。用圖2B的臨時(shí)保護(hù)方案或過?；磻?yīng)(與實(shí)施例1A類似)保護(hù)核苷堿基。在用CH3CN結(jié)晶之后，分離出產(chǎn)物11，產(chǎn)率分別是約60％和53％。當(dāng)小心地避免?；仍噭┑乃鈺r(shí)，也觀察到提高了產(chǎn)率。
實(shí)施例4由3’-氨基-2’，3’-雙脫氧胞嘧啶核苷合成N4-苯甲酰-3’-氨基三苯甲基-2’，3’-雙脫氧胞嘧啶核苷(如圖2C所示)在存在三乙胺時(shí)，用1∶4吡啶∶DMF中的三苯甲基氯化物與起始材料12的3’氨基進(jìn)行反應(yīng)。用9∶1 CH3CN∶MeOH中的苯甲酰酐在50℃下與中間物13進(jìn)行反應(yīng)。用硅膠色譜法分離出所需的產(chǎn)物14，產(chǎn)率為70％。
實(shí)施例5由3’-氨基-3’-脫氧胸腺嘧啶核苷合成3’-氨基三苯甲基-3’-脫氧胸腺嘧啶核苷酸-5’-(2-氰乙基，N，N-二異丙基)亞磷酰胺，隨后進(jìn)行磷脂?；?如圖3所示)用干吡啶共蒸發(fā)起始材料3’-氨基-3’-脫氧胸腺嘧啶(15，1.3g)，然后溶解于30ml吡啶內(nèi)。往該溶液中加入5eq.二異丙基乙胺或三乙胺，之后攪拌10分鐘，以及加入1到1.1eq.三苯甲基氯化物。在室溫下攪拌反應(yīng)混和物過夜(或者在50℃下攪拌1個(gè)小時(shí))。在TLC沒有檢測到起始材料之后，用甲醇淬火反應(yīng)，并在真空內(nèi)蒸發(fā)溶液。將所得到的油溶解于甲撐氯內(nèi)，用飽和碳酸氫鈉洗滌，硫酸鈉干燥并濃縮。甲撐氯-己烷沉淀得到了2.2g(85％)白色粉末的產(chǎn)物16。
用干吡啶共蒸發(fā)產(chǎn)物16(1.7g)，并將其溶解于100ml干甲撐氯內(nèi)。往該溶液中，加入4eq.二異丙基乙胺，之后加入1.2eq.2-氰乙基-N，N-二異丙基氯亞磷酰胺。用TLC監(jiān)測反應(yīng)，在起始材料消失之后，用飽和碳酸氫鈉洗滌溶液，硫酸鈉干燥并在真空中蒸發(fā)。用利用甲撐氯∶三乙胺10∶1(v/v)溶劑系統(tǒng)的硅膠閃光色譜法純化產(chǎn)物，生成了2g(83.3％)固體泡沫的磷脂?；Ｗo(hù)的單體17。該方法的總產(chǎn)率為70.8％。
盡管參照具體的方法和實(shí)施方式已經(jīng)描述了本發(fā)明，不過可以理解的是，可不脫離本發(fā)明而進(jìn)行各種修飾。
權(quán)利要求
1.一種制備具有被保護(hù)的核苷堿基和被保護(hù)的3’-氨基的腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷或胞嘧啶核苷單體的方法，其中所述堿基和所述3’氨基是被正交保護(hù)的，所述方法包括(a)提供3’-氨基-3’-脫氧腺嘌呤核苷、3’-氨基-3’-脫氧胞嘧啶核苷、或3’-氨基-3’-脫氧鳥嘌呤核苷的單體，所述單體中的5’-羥基、核苷堿基、和3’-氨基是未被保護(hù)的；(b)選擇性地將所述3’-氨基與第一保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)；將所述5’-羥基與第二保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)；以及將所述核苷堿基與第三保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)；其中所述第一保護(hù)基團(tuán)可以在不使所述核苷堿基脫保護(hù)的條件下從所述3’-氨基去除，且所述第二保護(hù)基團(tuán)可以在不使所述核苷堿基或所述3’-氨基脫保護(hù)的條件下從所述5’-羥基去除。
2.權(quán)利要求
1的方法，還包括步驟(c)在不使所述核苷堿基或所述3’-氨基脫保護(hù)的條件下從所述5’-羥基去除所述第二保護(hù)基團(tuán)。
3.權(quán)利要求
1的方法，其中所述第一保護(hù)基團(tuán)是酸不穩(wěn)定的。
4.權(quán)利要求
3的方法，其中所述第一保護(hù)基團(tuán)是三芳基甲基。
5.權(quán)利要求
4的方法，其中所述第一保護(hù)基團(tuán)是三苯甲基。
6.權(quán)利要求
1的方法，其中所述單體是腺嘌呤核苷或胞嘧啶核苷單體。
7.權(quán)利要求
1的方法，其中所述第二保護(hù)基團(tuán)和第三保護(hù)基團(tuán)都是?；?。
8.權(quán)利要求
7的方法，其中所述第二保護(hù)基團(tuán)和第三保護(hù)基團(tuán)都是苯甲?；?。
9.權(quán)利要求
1的方法，其中所述第二保護(hù)基團(tuán)是堿不穩(wěn)定的三烷基硅醚，且所述第三保護(hù)基團(tuán)是?；?。
10.權(quán)利要求
1的方法，其中所述第二保護(hù)基團(tuán)是氟化物不穩(wěn)定的硅醚，且所述第三保護(hù)基團(tuán)是酰基。
11.權(quán)利要求
11的方法，其中所述單體包括選自氫、羥基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷基、和氟的2’基團(tuán)。
12.權(quán)利要求
11的方法，其中所述單體是2’，3’-雙脫氧單體，這樣所述2’基團(tuán)是氫。
13.一種制備具有游離的5’-羥基和被保護(hù)的3’-氨基的胸腺嘧啶核苷單體的方法，所述方法包括(a)提供3’-氨基-3’-脫氧胸腺嘧啶核苷單體，其5’-羥基和3’-氨基是未被保護(hù)的；以及(b)選擇性地將所述3’-氨基與第一保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)。
14.權(quán)利要求
13的方法，其中所述第一保護(hù)基團(tuán)是酸不穩(wěn)定的。
15.權(quán)利要求
14的方法，其中所述第一保護(hù)基團(tuán)是三芳基甲基。
16.權(quán)利要求
14的方法，其中所述第一保護(hù)基團(tuán)是三苯甲基。
17.具有一被保護(hù)的3’-氨基以及一核苷堿基的腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷或胞嘧啶核苷單體，所述核苷堿基(i)是未被保護(hù)的或(ii)是被保護(hù)的，使得可以在不使所述核苷堿基脫保護(hù)的條件下使所述被保護(hù)的3’-氨基脫保護(hù)。
18.權(quán)利要求
17的單體，其中所述核苷堿基是未被保護(hù)的。
19.權(quán)利要求
17的單體，其中所述3’-氨基是以酸不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)的。
20.權(quán)利要求
19的單體，其中所述酸不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)是三芳基甲基。
21.權(quán)利要求
17的單體，其中所述核苷堿基是以?；M(jìn)行保護(hù)的。
22.權(quán)利要求
17的單體，其中所述核苷堿基是以二烷基甲脒基進(jìn)行保護(hù)。
23.權(quán)利要求
17的單體，其具有未被保護(hù)的5’-羥基。
24.權(quán)利要求
17的單體，其具有被保護(hù)的5’-羥基，其中可以在不使所述核苷堿基或所述3’-氨基脫保護(hù)的條件下使所述5’-羥基脫保護(hù)。
25.權(quán)利要求
17的單體，其中所述單體包括選自氫、羥基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷基、和氟的2’基團(tuán)。
26.權(quán)利要求
25的單體，其中所述單體是2’，3’-雙脫氧單體，這樣所述2’基團(tuán)是氫。
27.一種制備具有游離的5’-羥基、被保護(hù)的核苷堿基和被保護(hù)的3’-氨基的腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷或胞嘧啶核苷單體的方法，其中所述堿基和所述3’-氨基是被正交保護(hù)的，所述方法包括(a)提供3’-氨基-3’-脫氧腺嘌呤核苷、3’-氨基-3’-脫氧胞嘧啶核苷、或3’-氨基-3’-脫氧鳥嘌呤核苷的單體，所述單體的5’-羥基、核苷堿基、和3’-氨基是未被保護(hù)的。(b)選擇性地將所述3’-氨基與第一保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)；和(c)選擇性地將所述核苷堿基與其他的保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)；其中可以在不使所述核苷堿基脫保護(hù)的條件下從所述3’-氨基去除所述第一保護(hù)基團(tuán)。
28.權(quán)利要求
27的方法，其中所述單體是胞嘧啶核苷單體。
29.權(quán)利要求
28的方法，其中所述與另一保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)包括與酰酐反應(yīng)。
30.權(quán)利要求
27的方法，其中所述單體是腺嘌呤核苷或鳥嘌呤核苷單體，且所述另一保護(hù)基團(tuán)是二烷基甲脒基、二(環(huán)烷基)甲脒基、或二芐基甲脒基。
31.權(quán)利要求
27的方法，其中所述第一保護(hù)基團(tuán)是酸不穩(wěn)定的。
32.權(quán)利要求
31的方法，其中所述第一保護(hù)基團(tuán)是三芳基甲基。
專利摘要
本發(fā)明涉及被正交保護(hù)的3′－氨基核苷單體以及用于其合成的有效方法。本方法采用了在存在未被保護(hù)的堿基核苷時(shí)對(duì)3′－氨基進(jìn)行選擇性保護(hù)。
文檔編號(hào)C07H19/16GK1997658SQ20058002267
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2005年6月30日
發(fā)明者謝爾蓋·M·格里亞茲諾夫, 克里茲蒂娜·蓬格拉茨, 達(dá)里婭·杰琳斯卡 申請(qǐng)人:杰龍公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan