一種快速同步檢測番茄黃化曲葉病毒及其伴隨中國番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種同步檢測番茄黃化曲葉病毒及其伴隨衛(wèi)星（中國番茄黃化曲葉 病毒衛(wèi)星）的方法，屬植物保護(hù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 番前黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)是番前上一種重要 的病毒病，近年來由其導(dǎo)致的番茄黃化曲葉病在我國番茄產(chǎn)區(qū)大面積的發(fā)生危害，給當(dāng)?shù)?的番茄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失，其中浙江溫州地區(qū)5000余畝番茄被毀。由于該病毒蔓延迅 速、危害慘重、控制困難，已上升為當(dāng)前我國番茄生產(chǎn)上的主要限制因素之一。分類上番茄 黃化曲葉病毒屬雙生病毒科（Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus)，傳播 介體為煙粉虱（Bemisia tabaci)，病毒基因組為單鏈環(huán)狀DNA，大小2.7-2. 8kb。病毒感染 番茄后癥狀主要表現(xiàn)葉片上卷、葉緣及葉脈之間黃化，后期會表現(xiàn)葉片變小、植株矮化等癥 狀，對番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量影響極大，重病田常造成絕產(chǎn)絕收。
[0003] 除了 TYLCV外，導(dǎo)致番茄黃化曲葉病的病原還有多種，如中國番木瓜曲葉病 毒（Papaya leaf curl China virus)、臺灣番前曲葉病毒（Tomato leaf curl Taiwan virus)、中國番前黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf China virus，TYLCCNV)等等，同 時這些病毒也可以通過重組或者假重組的方式產(chǎn)生新的病毒或者病毒復(fù)合物導(dǎo)致番茄黃 化曲葉病。2013年在對江蘇地區(qū)番茄黃化曲葉病調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)了一類新的病毒復(fù)合 物，該復(fù)合物基因組有兩個組分構(gòu)成：番茄黃化曲葉病毒（TYLCV)和中國番茄黃化曲葉病 毒衛(wèi)星（Tomato yellow leaf curl China virus betasatellite，TYLCCNB)。病毒復(fù)合 物（TYLCV+TYLCCNB)在田間會導(dǎo)致更嚴(yán)重的癥狀，同時會造成很多抗TYLCV的番茄品種抗 性喪失，因此該病毒復(fù)合物的發(fā)生對當(dāng)前大面積推廣應(yīng)用的抗TYLCV品種是一個潛在的威 脅。
[0004] TYLCCNB是一種β衛(wèi)星分子，2003年在中國云南省發(fā)現(xiàn)并報道，其基因組也是單 鏈環(huán)狀DNA，大小I. 3Κ。TYLCCNB是一個伴隨衛(wèi)星分子，其自身不能自主完成復(fù)制、侵染和傳 播，必須依賴宿主病毒才能完成，有報道顯示TYLCCNB能加重病害癥狀，同時在抵御寄主防 衛(wèi)反應(yīng)也有作用。
[0005] 針對這一新的病毒類型，有必要盡快展開調(diào)查明確病害發(fā)生危害動態(tài)，因此需要 一種快速有效的檢測方法。在田間，TYLCV單獨(dú)侵染可以導(dǎo)致葉片黃化、葉緣上卷、植株矮 縮等癥狀，而這種癥狀表型又受侵染時期、接種煙粉虱數(shù)量、品種抗性等諸多因素影響，從 而表現(xiàn)癥狀多樣性。與TYLCV單獨(dú)侵染相比，TYLCV+TYLCCNB侵染后會導(dǎo)致更嚴(yán)重的癥狀， 但是在早期二者表型也很難區(qū)分，同時兩種病毒類型有著相似的粒體形狀，相同的傳播介 體及相近的基因組結(jié)構(gòu)，由此也為其檢測鑒別帶來了很大的困難。
[0006] 目前在植物病毒鑒定識別上常采用的方法有：生物學(xué)接種法，血清學(xué)檢測法，電鏡 觀察及分子生物學(xué)方法，在這些方法中一些傳統(tǒng)的檢測方法都不適于這種新病毒類型的快 速檢測，如電鏡觀察（操作繁瑣、病毒粒子大小形狀相近）、生物學(xué)接種鑒定（介體相同、周 期長）、血清學(xué)檢測（需制備血清，檢測受蛋白的特異性及表達(dá)豐度影響）。目前在這類病 毒的檢測上分子生物學(xué)方法是一種廣泛應(yīng)用的方法，由于這是一種新的病毒類型，尚未見 到使用PCR同步檢測兩種組分的方法。本方法針對當(dāng)前這種新的病毒類型在我國的危害現(xiàn) 狀，根據(jù)其序列特征，設(shè)計優(yōu)化引物，只需一次PCR即可實(shí)現(xiàn)兩種病毒組分的鑒別，為當(dāng)前 這種新病毒類型的田間調(diào)查提供了較為簡單的方法。該方法是一種基于PCR的分子檢測方 法，保證了靈敏性和特異性，同時該方法通過優(yōu)化設(shè)計，簡化了操作，節(jié)省了成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，為番茄黃化曲葉病毒及其伴隨的中國番茄黃化 曲葉病毒衛(wèi)星的同步檢測提供了一種快速、簡便、靈敏、特異的方法。
[0008] 1、引物設(shè)計：
[0009] (1)根據(jù) NCBI (http : //www. ncbi. nlm. nih. R〇v/sites/entrez ? db = nucleotide)上已報道的番茄黃化曲葉病毒核酸序列（GU111505)和中國番茄黃化曲葉病 毒衛(wèi)星核酸序列（AM980512)設(shè)計引物，引物序列如下：
[0010] TYmF :5' -TAGTATGAGCAGCCACAGTCTA-3'
[0011] TYmR :5'-GCAGAGAACTCCACGAGAATG-3'
[0012] TycnbF ：5'-AATGCTGGTGACTTTGffTGATG-3'
[0013] TycnbR :5'-CTCAGACACAGGGATAAGGGTA-3'
[0014] (2)引物配對及擴(kuò)增目的核酸條帶的大小如下：
[0015]
[0016] 2、總 DNA 提?。?br>[0017] 取IOmg番前病葉于I. 5mL離心管，加100 μ L 0· 5mol/L NaOH，勾衆(zhòng)后5000rpm離 心5min，上清液用0. lmol/L Tris-HCl (pH8. 0)稀釋100倍，取1 μ L作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。
[0018] 3、PCR 擴(kuò)增：
[0019] PCR反應(yīng)體系包括：
[0020]
[0021] 反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性5min ;95 °C變性45sec、50-58 °C退火45sec、72 °C延伸 lmin，30-40次循環(huán)；最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0022] 4、電泳檢測：
[0023] 取10 μ L PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠在0. 5 X TBE緩沖液和120V電壓條件下電泳 40min，在0. 5 μ g/mL的溴化乙錠（EB)中染色lOmin，染色后于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，在僅感 染番茄黃化曲葉病毒的樣品中可以觀察到一條974bp的核酸條帶，在感染番茄黃化曲葉病 毒和中國番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星的樣品中可以觀察到697bp和974bp兩條核酸條帶。
[0024] 其中所述的退火溫度50-58°C，也可以是52-55°C;所述的循環(huán)次數(shù)30-40次，也可 以是32-35次
[0025] 本發(fā)明的有益效果是根據(jù)番茄黃化曲葉病毒和中國番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星核苷 酸序列設(shè)計引物TYmF/TYmR (檢測番茄黃化曲葉病毒）、TycnbF/