一種大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物鱗莖分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，特別是涉及一種大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物來(lái)源的天然產(chǎn)物曾是藥物或其先導(dǎo)化合物的主要來(lái)源，但因天然植物生長(zhǎng)緩慢、活性成分含量低，致使這類化合物的來(lái)源難以得到保障，難以滿足現(xiàn)實(shí)需求。為了解決這個(gè)矛盾，科學(xué)工作者進(jìn)行了廣泛研究，主要集中在以下幾方面:(I)采用化學(xué)方法進(jìn)行全合成；(2)以容易獲得的化工原料或天然前體為基礎(chǔ)，半合成某些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物；(3)在微生物中表達(dá)天然產(chǎn)物的合成途徑，采用基因工程技術(shù)發(fā)酵方式生產(chǎn)某些活性成分；(4)植物組織培養(yǎng)，定向生產(chǎn)目標(biāo)成分。盡管這些方法都已有許多成功的案例，然而，由于很多天然產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜和獨(dú)特，涉及的生物合成途徑也非常多，而且生物合成多涉及一系列繁雜的酶促反應(yīng)，化學(xué)合成則常常需要多達(dá)數(shù)十步反應(yīng)；植物培養(yǎng)技術(shù)在適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，也面臨著很多問(wèn)題:如脫分化細(xì)胞中的二次代謝產(chǎn)物豐度非常低，甚至根本沒有；植物細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，由于細(xì)胞不均一、基因突變、環(huán)境因素影響等原因，其生理、生化以及遺傳性狀逐漸發(fā)生變化等等。
[0003]由韓國(guó)和英國(guó)學(xué)者開發(fā)的植物分生組織細(xì)胞(干細(xì)胞)培養(yǎng)技術(shù)，為解決上述問(wèn)題提供了一個(gè)全新的方案。根據(jù)目標(biāo)干細(xì)胞的不同，目前較為成功的植物分生組織細(xì)胞(干細(xì)胞)培養(yǎng)方法主要有以下幾種:紅豆杉維管形成層分生組織細(xì)胞，人參儲(chǔ)藏根的維管形成層分生組織細(xì)胞，水稻、玉米的靜止中心。
[0004]大蒜作為一種可食用或供調(diào)味，亦可入藥的重要經(jīng)濟(jì)作物，關(guān)于它的分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)目前尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，即建立一種采用大蒜未分裂的鱗莖分生組織細(xì)胞進(jìn)行無(wú)限增殖的方法。
[0006]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]一種大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0008]I)大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞分離
[0009]大蒜鱗莖洗凈去皮，經(jīng)乙醇消毒、汞浸泡后，切取分生組織細(xì)胞，接種于培養(yǎng)基上;
[0010]2)大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞培養(yǎng)
[0011]所述培養(yǎng)基是以去硫酸銨的1/2B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加毒莠定、活性碳、赤霉素、抗壞血酸、檸檬酸、甘氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、結(jié)冷膠而制成；培養(yǎng)條件為在25°C下避光培養(yǎng)。結(jié)冷膠是一種凝膠，作用就是支撐，使液體培養(yǎng)基成為固體培養(yǎng)基。
[0012]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟I)中具體的方法為:用75%乙醇消毒lmin，再用0.1 %升汞浸泡1min ;在經(jīng)過(guò)去皮、乙醇消毒、汞浸泡步驟后均用無(wú)菌水沖洗。
[0013]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟I)中，沿縱軸切開大蒜鱗莖的蒜瓣，切取所述大蒜鱗莖基部分生組織細(xì)胞。
[0014]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟2)中，所述培養(yǎng)基添加的物質(zhì)為:I?2mg/L毒莠定、0.01 %活性碳、0.5mg/L赤霉素、100mg/L抗壞血酸、150mg/L梓檬酸、75mg/L甘氨酸、115mg/L脯氨酸、133mg/L天冬氨酸、175mg/L精氨酸、0.4%結(jié)冷膠。
[0015]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)條件為:25 °C下避光培養(yǎng)，首次培養(yǎng)一個(gè)月后，每?jī)芍芾^代一次。
[0016]有益效果:本發(fā)明提供的一種大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，是一種新的培養(yǎng)方法，這種技術(shù)在大蒜的領(lǐng)域至今沒有應(yīng)用，可作為一種技術(shù)儲(chǔ)備，用于新的其他研究應(yīng)用用途。主要目的是建立植物細(xì)胞銀行，這不僅可以為植物細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性提供一個(gè)切實(shí)有效的解決方法，而且將在植物種質(zhì)資源的保存方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞在培養(yǎng)基上形成的增殖團(tuán)塊的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0019]如圖1所示為根據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法得到的大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞在培養(yǎng)基上形成的增殖團(tuán)塊的示意圖，可以看出，此增殖團(tuán)塊生長(zhǎng)良好且具有良好的成型特性。
[0020]結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
[0021]實(shí)施例1
[0022]I)大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞分離
[0023]將大蒜鱗莖用流水沖洗干凈后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，剝?nèi)ニ馄ぃ瑹o(wú)菌水沖洗2次；75%乙醇消毒lmin，然后用無(wú)菌水沖洗2次；再用0.1 %升萊浸泡lOmin，再無(wú)菌水沖洗3后；用解剖刀沿縱軸切開蒜瓣、切取基部分生組織細(xì)胞，接種于培養(yǎng)基上。
[0024]2)大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞培養(yǎng)
[0025]培養(yǎng)基:以去硫酸銨的1/2B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加lmg/L毒莠定，0.01%活性碳，0.5mg/L赤霉素，100mg/L抗壞血酸，150mg/L梓檬酸，75mg/L甘氨酸，115mg/L脯氨酸，133mg/L天冬氨酸，175mg/L精氨酸，0.4%結(jié)冷膠。
[0026]培養(yǎng)條件:25°C下暗處培養(yǎng)。
[0027]實(shí)施例2
[0028]I)大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞分離
[0029]將大蒜鱗莖用流水沖洗干凈后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，剝?nèi)ニ馄ぃ瑹o(wú)菌水沖洗2次；75%乙醇消毒lmin，然后用無(wú)菌水沖洗2次，再用0.1 %升萊浸泡lOmin，再無(wú)菌水沖洗3后，用解剖刀沿縱軸切開蒜瓣、切取基部分生組織細(xì)胞，接種于培養(yǎng)基上。
[0030]2)大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞培養(yǎng)
[0031]培養(yǎng)基:以去硫酸銨的1/2B5液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加1.5mg/L毒莠定，0.01%活性碳，0.5mg/L赤霉素，100mg/L抗壞血酸，150mg/L梓檬酸，75mg/L甘氨酸，115mg/L脯氨酸，133mg/L天冬氨酸，175mg/L精氨酸，0.4%結(jié)冷膠。
[0032]培養(yǎng)條件:25°C下暗處培養(yǎng)。
[0033]實(shí)施例3
[0034]I)大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞分離
[0035]將大蒜鱗莖用流水沖洗干凈后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，剝?nèi)ニ馄ぃ瑹o(wú)菌水沖洗2次；75%乙醇消毒lmin，然后用無(wú)菌水沖洗2次，再用0.1 %升萊浸泡lOmin，再無(wú)菌水沖洗3后，用解剖刀沿縱軸切開蒜瓣、切取基部分生組織細(xì)胞，接種于培養(yǎng)基上。
[0036]2)大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞培養(yǎng)
[0037]培養(yǎng)基:以去硫酸銨的1/2B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加2mg/L毒莠定，0.01%活性碳，0.5mg/L赤霉素，100mg/L抗壞血酸，150mg/L梓檬酸，75mg/L甘氨酸，115mg/L脯氨酸，133mg/L天冬氨酸，175mg/L精氨酸，0.4%結(jié)冷膠。
[0038]培養(yǎng)條件:25 °C下避光培養(yǎng)。
[0039]在各種添加成分中，毒莠定是一種除草劑，可抑制細(xì)胞的分化。經(jīng)3個(gè)實(shí)施例對(duì)毒莠定進(jìn)行了定性評(píng)估，以改變濃度后能否生長(zhǎng)為指標(biāo)，結(jié)果表明:3個(gè)實(shí)施例均能得到大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞在培養(yǎng)基上形成的增殖團(tuán)塊，實(shí)驗(yàn)結(jié)論說(shuō)明不同濃度的毒莠定對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不大，均能得到理想的結(jié)果。
[0040]至于在各種添加成分中的其他成分，主要作用是脫色，抗污染等作用。
[0041]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞分離 大蒜鱗莖洗凈去皮，經(jīng)乙醇消毒、汞浸泡后，切取分生組織細(xì)胞，接種于培養(yǎng)基上； 2)大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞培養(yǎng) 所述培養(yǎng)基是以去硫酸銨的1/2B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加毒莠定、活性碳、赤霉素、抗壞血酸、檸檬酸、甘氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、結(jié)冷膠而制成；培養(yǎng)條件為在25°C下避光培養(yǎng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟I)中具體的方法為:用75%乙醇消毒lmin，再用0.1 %升萊浸泡1min ;在經(jīng)過(guò)所述去皮、乙醇消毒、汞浸泡步驟后均用無(wú)菌水沖洗。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟I)中，沿縱軸切開大蒜鱗莖的蒜瓣，切取所述大蒜鱗莖基部分生組織細(xì)胞。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟2)中，所述培養(yǎng)基添加的物質(zhì)為:1?2mg/L毒莠定、0.01%活性碳、0.5mg/L赤霉素、100mg/L抗壞血酸、150mg/L梓檬酸、75mg/L甘氨酸、115mg/L脯氨酸、133mg/L天冬氨酸、175mg/L精氨酸、0.4%結(jié)冷膠。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于:所述培養(yǎng)條件為:25°C下避光培養(yǎng)，首次培養(yǎng)一個(gè)月后，每?jī)芍芾^代一次。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大蒜鱗莖分生組織細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，培養(yǎng)的細(xì)胞為大蒜鱗莖基部分生組織細(xì)胞；所用培養(yǎng)基是以去硫酸銨的1/2？B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加了毒莠定，活性碳，赤霉素，抗壞血酸，檸檬酸，甘氨酸，脯氨酸，天冬氨酸，精氨酸。建立此方法主要目的是建立植物細(xì)胞銀行，這不僅可以為植物細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性提供一個(gè)切實(shí)有效的解決方法，而且將在植物種質(zhì)資源的保存方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號(hào)】CN105165619
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】鞠秀云, 蔣繼宏, 曹小迎, 張健, 姜素平
【申請(qǐng)人】江蘇師范大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年10月9日