一種抑制小麥矮腥黑穗病菌生長的化合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物的新用途，闡明藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)與細(xì)菌的生物活性之間的關(guān)系， 更具體的說，是探索化合物對小麥矮腥黑穗病菌的抑菌和殺菌活性。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥矮腥黑穗病菌屬真菌界、擔(dān)子菌亞門、冬孢菌綱、黑粉菌目、腥黒粉菌科、腥黑 粉菌屬。小麥矮腥黑穗病菌在土壤中具有保持多年侵染活性的特點(diǎn)。在無寄主的田間，存 在于土壤中的菌癭，其存活期為4~7年；存在于土表的菌癭，10年之后其中部分孢子仍有萌 發(fā)活性。置于土表和埋入土壤中的菌癭萌發(fā)率分別達(dá)到50%和30%，但埋入土內(nèi)的分散的冬 孢子經(jīng)1年后僅有少量萌發(fā)，2年后僅有痕量萌發(fā)，由此可見，在菌癭內(nèi)部的小麥矮腥黑穗 病菌冬孢子對不良環(huán)境具有更強(qiáng)的抗性。
[0003] 在倉儲條件下，存在于糧食中的小麥矮腥黑穗病菌菌癭碎片經(jīng)4年后萌發(fā)率可達(dá) 到34%，含有小麥矮腥黑穗病菌冬孢子的飼料經(jīng)過家禽類的消化道后存活率平均約為30%。 由此可見，小麥矮腥黑穗病菌冬孢子在不利條件下仍能頑強(qiáng)的存活，加工后的病麥麥麩、下 腳料和農(nóng)家肥等均含有一定數(shù)量的有萌發(fā)活性的冬孢子，增加了小麥矮腥黑穗病菌傳播的 機(jī)會。
[0004] 散落在田間的小麥矮腥黑穗病菌菌癭和冬孢子是主要的侵染源，同時疫麥加工后 的麩皮、下腳料和洗麥水進(jìn)入大田也可造成下一年的侵染，粘附在種子表面和混在種子中 的菌癭播種后成為重要的侵染源，染菌的糧食通過出口可以進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，包裝材料，容 器和運(yùn)輸工具都可能攜帶病菌，一旦這些病菌進(jìn)入有寄主的田間，在環(huán)境適宜的條件下，冬 孢子萌發(fā)后侵入寄主幼苗而引起系統(tǒng)發(fā)病。
[0005] 從病三角可以知道，小麥矮腥黑穗病菌侵染需要3個條件，適宜的環(huán)境條件；易感 病的寄主；一定數(shù)量的有活性的病原菌。通常認(rèn)為，小麥矮腥黑穗病菌在長期持續(xù)的積雪條 件下才可萌發(fā)，但這種說法仍存在分歧。
[0006] 不同品種的冬小麥對小麥矮腥黑穗病菌存在著感病性和抗病性的差異。通過人工 接種發(fā)現(xiàn)，對易感品種，小麥矮腥黑穗病菌侵染菌絲經(jīng)芽鞘進(jìn)入葉原基，而后進(jìn)入莖節(jié)到達(dá) 頂端分生組織和分蘗原始細(xì)胞，當(dāng)小麥生長時，病菌菌絲隨同小麥一起生長，在小麥孕穗期 侵入花序，最終形成菌癭而取代整個麥粒。小麥矮腥黑穗病菌侵染菌絲侵入中抗品種后，在 第一及第二葉原基中活動，始終未進(jìn)入蓮節(jié)頂端分生組織，寄主成熟時不發(fā)病。對于高抗品 種，菌絲體活動只在第一及第二葉原基，始終遠(yuǎn)離壟節(jié)分生組織，寄主成熟時無病穗。通過 對易感小麥品種實(shí)驗(yàn)表明，如果病菌侵染發(fā)生在小麥生長的初葉期至幼蘗期，則侵染率較 高。在麥株逐漸長大時，致病菌侵入分蘗鞘后，難以抵達(dá)分蘗原始細(xì)胞，因此在麥苗生長后 期小麥矮腥黑穗病菌的發(fā)病率明顯降低。
[0007] 小麥矮腥黑穗病菌雖然可以引起春麥發(fā)病，但在小麥矮腥黑穗病發(fā)生區(qū)，從來沒 有春麥發(fā)病的報告，因此小麥矮腥黑穗病菌主要侵染對象為冬小麥。
[0008] 小麥矮腥黒穗病菌是麥類黒穗病中危害最大又極難防治的病害，通常發(fā)病率等于 產(chǎn)量損失率，該病在美國西部7個州發(fā)病較重，一般流行年份小麥減產(chǎn)20%~50%，嚴(yán)重時可 高達(dá)75%，甚至絕產(chǎn)。1972年美國西北部7個州發(fā)病面積為24萬hm2,均減產(chǎn)17%，損失小 麥1. 2萬kg。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明采用體外抗菌試驗(yàn)，研究化合物對小麥矮腥黑穗病菌的生物活性。
[0010] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下： 本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)是發(fā)現(xiàn)化合物對小麥矮腥黑穗病菌有良好的抑菌和殺菌活性，并測量 得到其最小抑菌濃度MIC值和最小殺菌濃度MBC值，屬于首次公開。
[0011] 所述化合物結(jié)構(gòu)特征如下式所示：

【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例，進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明。應(yīng)理解下面實(shí)施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0013] 實(shí)施實(shí)例1 測量最小抑菌濃度MIC值。
[0014] (1)營養(yǎng)肉湯的配制：取營養(yǎng)肉湯30g加1000mL蒸餾水即得。使用前121°C高壓 蒸汽滅菌20min待用。
[0015] (2)營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基的配制：取營養(yǎng)瓊脂45g加1000mL蒸餾水即得。使用前 121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0016] (3)菌株的培養(yǎng)：操作于超凈工作臺上進(jìn)行。吸取已滅菌的液體培養(yǎng)基10mL，放在 已滅菌的試管中，然后用接菌環(huán)挑取一個菌落，加到液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì) 菌培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為16°C。
[0017] (4)菌液配制及計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)后的菌液，釆用10倍稀釋法用液體培養(yǎng)基稀釋，并 用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡上初步觀察計(jì)數(shù)，然后將菌液用液體培養(yǎng)基稀釋，作為加入供試品 中的菌液。細(xì)菌采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，將以上菌液用無菌生理鹽水再稀釋100倍，取 50yL，均勻涂于已鋪有固體培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為16°C。培養(yǎng)后，單個活 細(xì)菌生長形成一個菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可計(jì)算出樣品中的含菌數(shù)。
[0018] 計(jì)算公式為：菌液濃度=nX20X100cfu/mL (5)藥品溶液的配制：稱取化合物，加入滅菌生理鹽水，搖勾，得均勻溶液，備用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0019] (6)最小抑菌濃度（MIC)與最小殺菌濃度（MBC)的測定：采用微量肉湯稀釋法測定 最小抑菌濃度MIC(MinimalInhibitoryConcentration)。MIC為最小抑菌濃度，即藥物 與一定濃度的菌液作用后，能夠抑制可見菌生長的最低濃度。
[0020] 采用二倍稀釋法將藥液用無菌生理鹽水將藥液稀釋系列濃度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同濃度的藥液和100yL 菌液，使最終菌液濃度為1~5X105cfu/mL，第11行以無菌生理鹽水加菌液作為陽性對照，第 12行以不加菌液的無菌生理鹽水為陰性對照，混勻后于16°C培養(yǎng)24h，以肉眼觀察藥物最 低濃度管中無細(xì)菌生長者為該試驗(yàn)藥物的MIC，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0021] 測得最小抑菌濃度MIC值為1yg/mL。
[0022] 實(shí)施實(shí)例2 測量最小殺菌濃度MBC值。
[0023] (1)營養(yǎng)肉湯的配制：取營養(yǎng)肉湯30g加1000mL蒸餾水即得。使用前121°C高壓 蒸汽滅菌20min待用。
[0024] (2)營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基的配制：取營養(yǎng)瓊脂45g加1000mL蒸餾水即得。使用前 121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0025] (3)菌株的培養(yǎng)：操作于超凈工作臺上進(jìn)行。吸取已滅菌的液體培養(yǎng)基10mL，放在 已滅菌的試管中，然后用接菌環(huán)挑取一個菌落，加到液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì) 菌培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為16°C。
[0026] (4)菌液配制及計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)后的菌液，釆用10倍稀釋法用液體培養(yǎng)基稀釋，并 用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡上初步觀察計(jì)數(shù)，然后將菌液用液體培養(yǎng)基稀釋，作為加入供試品 中的菌液。細(xì)菌采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，將以上菌液用無菌生理鹽水再稀釋100倍，取 50yL，均勻涂于已鋪有固體培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為16°C。培養(yǎng)后，單個活 細(xì)菌生長形成一個菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可計(jì)算出樣品中的含菌數(shù)；計(jì)算公式為：菌液濃 度=nX20X100cfu/mL。
[0027] ( 5)藥品溶液的配制：稱取化合物，加入滅菌生理鹽水，搖勾，得均勻溶液，備用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0028] (6)最小抑菌濃度（MIC)與最小殺菌濃度（MBC)的測定：采用微量肉湯稀釋法測定 最小殺菌濃度MBC(MinimalBactericidalConcentration)。在MIC基礎(chǔ)上，從每管吸取 10yL溶液，點(diǎn)于固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)按MIC培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，以完全殺滅細(xì)菌的最低濃度 為最小殺菌濃度(菌落數(shù)小于等于5)。
[0029] 采用二倍稀釋法將藥液用無菌生理鹽水將藥液稀釋系列濃度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同濃度的藥液和100yL 菌液，使最終菌液濃度為l~5X105cfu/mL，第11行以無菌生理鹽水加菌液作為陽性對照， 第12行以不加菌液的無菌生理鹽水為陰性對照，混勻后于16°C培養(yǎng)24h，以肉眼觀察藥物 最低濃度管中無細(xì)菌生長者為該試驗(yàn)藥物的MIC。將上述未見生長細(xì)菌的各孔中的肉湯取 10yL接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，做好標(biāo)記，于16°C培養(yǎng)24h，以仍無細(xì)菌生長的管內(nèi)藥物濃 度記為該藥的MBC，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0030] 測得最小殺菌濃度MBC值為2yg/mL。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抑制小麥矮腥黑穗病菌生長的化合物，其特征在于： (1) 結(jié)構(gòu)特征如下式所示：(2) 其可作為小麥矮腥黑穗病菌的抑制劑和殺菌劑； (3) 其對小麥矮腥黑穗病菌的最小抑菌濃度MIC值為1 μ g/mL ; (4) 其對小麥矮腥黑穗病菌的最小殺菌濃度MBC值為2 μ g/mL。
【專利摘要】本發(fā)明發(fā)現(xiàn)對小麥矮腥黑穗病菌具有抑菌和殺菌活性的化合物。其小麥矮腥黑穗病菌的最小抑菌濃度MIC值為1μg/mL，最小殺菌濃度MBC值為2μg/mL。
【IPC分類】A01P1/00, A01N43/86, A01P3/00
【公開號】CN105165849
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請人】許自協(xié)
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年11月2日