預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)新發(fā)作自身免疫糖尿病的基于微球的組合物的制作方法
【專利說明】預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)新發(fā)作自身免疫糖尿病的基于微球的組合 物
[0001] 本申請是國際申請日2007年8月6日、國際申請?zhí)朠CT/US2007/075292于2009 年2月3日進(jìn)入中國國家階段、申請?zhí)?00780028951. 8、發(fā)明名稱"預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)新發(fā)作 自身免疫糖尿病的基于微球的組合物"的申請的分案申請。
[0002] 發(fā)明描述
[0003] 本申請要求2006年8月4日提交的美國臨時申請No. 60/835, 742和2006年11 月8日提交的美國臨時申請No. 60/864, 914的優(yōu)先權(quán)。上述各申請的全部內(nèi)容在此引入作 為參考。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 總的來說，本公開涉及在N0D小鼠中預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)自身免疫糖尿病病癥的反義 方法。這包括通過注射微球投送AS-寡核苷酸以獲得引起負(fù)調(diào)節(jié)活性的治療效果，具體是 在非肥胖型糖尿?。∟0D)小鼠模型中。微球使用完全水性的條件制造，該微球中結(jié)合有一 種或多種反義（AS)寡核苷酸。
[0006] 微粒、微球和微囊是固體或半固體的顆粒，其直徑小于1毫米，也可以小于100微 米，它們可以由各種不同的材料形成，包括合成聚合物、蛋白和多糖。微球已經(jīng)被用于許多 不同的應(yīng)用中，主要是分離、診斷和藥物投送。
[0007] 有許多不同的技術(shù)可用于從合成聚合物、天然聚合物、蛋白和多糖制造這些顆粒， 包括相分離、溶劑蒸發(fā)、乳化和噴霧干燥。一般來說，聚合物形成這些微球的支撐結(jié)構(gòu)，而 目標(biāo)藥物結(jié)合在聚合物結(jié)構(gòu)中。用于形成微球的示例性聚合物包括在Ruiz等的美國專 利 No. 5, 213, 812、Reid 等的美國專利 No. 5, 417, 986、Tice 等的美國專利 No. 4, 530, 840、 Tice等的美國專利No. 4, 897, 268、Tice等的美國專利No. 5, 075, 109、Singh等的美國專 利 No. 5, 102, 872、Boyes 等的美國專利 No. 5, 384, 133、Tice 等的美國專利 No. 5, 360, 610、 以及南方研究所（Southern Research Institute)的歐洲專利申請公布No. 248, 531中描 述的乳酸和乙醇酸的均聚物或共聚物（PLGA);在Ilium的美國專利No. 4, 904, 479中描述 的嵌段共聚物例如Tetronic? 908和泊洛沙姆（poloxamer)407 ;以及在Cohen等的美國專 利No. 5, 149, 543中描述的聚磷腈。使用例如這些聚合物生產(chǎn)的微球表現(xiàn)出荷載效率差，通 常僅能在聚合物結(jié)構(gòu)中結(jié)合少量百分比的目標(biāo)藥物。因此，為了獲得療效，通常必須施用相 當(dāng)大量的這些類型的微球。此外，這些聚合物一般是疏水性的，對目標(biāo)藥物的溶解有負(fù)性影 響。在這種情況下使用的典型聚合物包括聚乳酸乙醇酸（PLGA)。
[0008] 醫(yī)療團(tuán)體的目標(biāo)是將核酸投送到動物細(xì)胞中以治療各種疾病，包括糖尿病。在許 多方法中，通過加入轉(zhuǎn)染劑，能夠相對有效地將核酸投送到培養(yǎng)細(xì)胞中（體外）。此外，在體 內(nèi)，當(dāng)給動物投送核酸時，內(nèi)源核酸酶的存在將導(dǎo)致核酸高速降解。
[0009] 除了保護(hù)核酸免受核酸酶消化之外，核酸投送載體還必需表現(xiàn)出低毒性，必須被 細(xì)胞有效攝取，并且具有定義明確的、容易制造的配方。臨床試驗中顯示，用于投送的病毒 載體在體內(nèi)能導(dǎo)致嚴(yán)重的不利、甚至是致命的免疫應(yīng)答。此外，這種方法有可能在體內(nèi)有致 突變效應(yīng)。通過將核酸復(fù)合在不同配方的脂質(zhì)復(fù)合物（例如脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì)復(fù)合物） 中進(jìn)行投送，可能具有有毒的效應(yīng)。核酸與各種聚合物或與肽的復(fù)合物顯示出不一致的結(jié) 果，并且這些配方的毒性還沒有解決。核酸還已經(jīng)被包裹在聚合物基質(zhì)中進(jìn)行投送，但是在 這些情況下顆粒的粒度范圍廣，并且治療性應(yīng)用的有效性還沒有被證實。這些早先的方法 能產(chǎn)生與這里所希望的目標(biāo)相反的效果，包括免疫系統(tǒng)的刺激。例如，當(dāng)PLGA被摻入到顆 粒中時，PLGA的存在刺激了免疫系統(tǒng)。
[0010] 因此，對于解決核酸投送中的問題存在著需求，對于微球的開發(fā)和制造微球的新 方法有正在發(fā)展的需求。關(guān)于微球的詳細(xì)情況，特別是關(guān)于它們的制備和性質(zhì)的詳細(xì)情 況,可以在Scott等的美國專利No. 6, 458, 387, Woiszwillo等的美國專利No. 6, 268, 053、 No. 6, 090, 925、No. 5, 981，719 和 No. 5, 599, 719, Woiszwillo 的美國專利 No. 5, 578, 709 以 及Brown等的美國申請公布No. 2006/0024240中找到。這些以及所有在本文中指明的參考 文獻(xiàn)在此引為參考。
[0011] 發(fā)明簡沭
[0012] 按照本公開，寡核苷酸作為微球投送。據(jù)信這樣的投送方法阻止了核酸酶接近微 球內(nèi)的核酸。進(jìn)行反義（AS)寡核苷酸的微球投送以誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞耐受，特別是在N0D小 鼠模型中。使用水性條件制造微球，使得反義（AS)寡核苷酸被結(jié)合。這些微球用于抑制基 因表達(dá)，并用于在N0D小鼠中體內(nèi)預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)自身免疫糖尿病病癥。
[0013] 在本公開的一個方面，合成了靶向⑶40、⑶80和⑶86轉(zhuǎn)錄物的三種AS-寡核苷 酸，制備了寡核苷酸混合物的水溶液，并與水性聚合物溶液合并。形成含有寡核苷酸的微 球，通過注射將它們投送到N0D小鼠中。
[0014] 在本公開的一個方面，提供了用于在哺乳動物中逆轉(zhuǎn)1型糖尿病的方法，包括施 用微球組合物，其中組合物中的微球含有與選自CD40、CD80和CD86初級轉(zhuǎn)錄物的初級轉(zhuǎn)錄 物及其組合是反義的并與它們定向結(jié)合的寡核苷酸。該寡核苷酸選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3,或事實上可以是任何其它以⑶40、⑶80和⑶86為靶標(biāo)的寡核苷酸。
[0015] 本公開的另一個方面涉及保護(hù)哺乳動物胰腺P細(xì)胞免于自身免疫破壞的方法， 包括在哺乳動物中注射微球組合物，其中組合物中的微球含有與選自⑶40、⑶80和⑶86初 級轉(zhuǎn)錄物的初級轉(zhuǎn)錄物及其組合是反義的并與它們定向結(jié)合的寡核苷酸。
[0016] 另一個方面是在哺乳動物中減少T細(xì)胞介導(dǎo)的胰腺炎癥和/或胰腺0細(xì)胞死亡 的方法，包括給哺乳動物施用微球組合物，其中組合物中的微球含有與選自⑶40、⑶80和 CD86初級轉(zhuǎn)錄物的初級轉(zhuǎn)錄物及其組合是反義的并與它們定向結(jié)合的寡核苷酸，其中組合 物以在哺乳動物中有效緩解1型糖尿病癥狀的量施用。在更加限定的方面，該組合物在1型 糖尿病臨床發(fā)作之后施用。在備選的方面，該組合物在1型糖尿病臨床發(fā)作之前施用。在 這些治療性方面，與施用前哺乳動物的血糖水平相比，組合物的施用使哺乳動物中的血糖 水平歸于正常。
[0017] 施用組合物可以再生哺乳動物的0細(xì)胞群，或終止0細(xì)胞種的進(jìn)一步惡化，或這 二者。
[0018] 組合物可以以任何形式施用，在某些示例性方面，以注射形式施用。在特定方面， 組合物與胰島素一起組合施用。在使用組合療法時，可以在施用微球組合物之前、同時或之 后施用胰島素。
[0019] 其它方面還涉及在患有新發(fā)作或臨床前期自身免疫糖尿病的對象中保護(hù)剩余的 3細(xì)胞團(tuán)的方法，包括給對象施用含有微球的組合物，該微球中含有與⑶40、⑶80和⑶86 初級轉(zhuǎn)錄物是反義的并與它們定向結(jié)合的寡核苷酸，其中組合物的施用將哺乳動物的3 細(xì)胞團(tuán)維持在糖尿病發(fā)作前存在的細(xì)胞團(tuán)的至少15%。對象可以是人類對象。對象可以 是人類兒童。治療方法可以包括重復(fù)施用組合物，并且重復(fù)施用增加了哺乳動物的3細(xì)胞 團(tuán)。
[0020] 在具體定義的方法中，微球的30%以及多達(dá)70% w/w是寡核苷酸。這樣的組合物 通?？梢栽谖⑶蚪M合物中含有比例為1:1:1的反義⑶40:反義⑶80:反義⑶86。
[0021] 通過下面的具體說明，本發(fā)明的這些以及其它的方面、目標(biāo)、特點(diǎn)和