情況:1.亂序?qū)φ战M；2.NF-kB基因敲減組；3.NF-kB合并RIZl雙敲減組。
【具體實(shí)施方式】
[0012]為了更全面地理解和應(yīng)用本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例，做進(jìn)一步說明。
[0013]—、NF-kB抑制劑在腫瘤細(xì)胞中對該分子活性的作用
[0014]在腫瘤細(xì)胞HepG2 中，NF_kB 用其抑制劑 Pyrrolidine dith1carbamate (PDTC)處理。I3DTC濃度為lOOmicromolar。處理時(shí)間為12小時(shí)。Western-blotting實(shí)驗(yàn)顯示在PDTC處理的情況下，NF-kB細(xì)胞核中量下降，說明NF-kB活性下降(圖1)。
[0015]二、構(gòu)建NF-kB基因敲減及亂序?qū)φ盏哪[瘤細(xì)胞系
[0016]根據(jù)NF-kB p65的基因序列，我們設(shè)計(jì)出含有如下干擾序列GGACATATGAGACCTTC的shRNA，我們同時(shí)設(shè)計(jì)了含亂序?qū)φ招蛄蠫CTCGCCTGTCTACTAACT的shRNA，并將兩種shRNA分別轉(zhuǎn)入pLK0.1質(zhì)粒載體，在293FT細(xì)胞上包裝增殖成慢病毒。用含有shRNA的慢病毒對腫瘤細(xì)胞ifepG2進(jìn)行感染，并于感染72小時(shí)后進(jìn)行嘌呤霉素篩選，建立穩(wěn)定的NF-kB基因敲減及亂序?qū)φ盏哪[瘤細(xì)胞系。Western-blotting實(shí)驗(yàn)顯示NF_kB在敲減細(xì)胞中其表達(dá)量和活性均較亂序?qū)φ占?xì)胞為少(圖1)。
[0017]三、RIZl基因甲基化和表達(dá)的測定
[0018](I)RIZl基因甲基化的測定。DNA提自上述TOTC處理的和NF-kB敲減的腫瘤細(xì)胞系和它們的相應(yīng)對照細(xì)胞。DNA先經(jīng)亞硫酸氫鹽處理，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。對于未甲基化的 RIZl 基因，所用引物為:forward primer:5’ -TGGTGGTTATTGGGTGATGGT-3’，reverse primer:5’ -ACTATTTCACCAACCCCAAGA-3’。對于甲基化的 RIZl 基因，所用引物為 forward primer:5 ‘-GTGGTGGTTATTGGGCGACGGC-3，， reverse primer:5 ‘-GCTATTTCGCCGACCCCGACG-3’。將上述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。我們的結(jié)果顯示，在對照細(xì)胞中，所有RIZl基因均甲基化(圖2)。在TOTC處理和NF-kB基因敲減的腫瘤細(xì)胞中，部分RIZl基因去甲基化(圖2A)。
[0019](2)RIZ1基因表達(dá)的測定。
[0020]采用定量PCR的方法對RIZl基因表達(dá)進(jìn)行測定。RNA提自上述TOTC處理的和NF-kB敲減的腫瘤細(xì)胞和它們的相應(yīng)對照細(xì)胞。RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以生成cDNA。隨后進(jìn)行定量 PCR 檢測。對 RIZl 基因所用引物為:forward primer:5’-TCTGCTGTTGACAAGACCC-3’，reverse primer:5’ -GCATCAATGCACATCCATC-3’。對 GAPDH 基因(內(nèi)參對照)所用引物為 -forward primer:5， -CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3，， reverse primer:5’ -TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’。PCR結(jié)束后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出基因表達(dá)量。結(jié)果顯示，在I3DTC處理和NF-kB基因敲減的腫瘤細(xì)胞中，RIZl基因恢復(fù)表達(dá)(圖2B) ο
[0021 ]四、DNMTlmRNA 的測定
[0022]采用定量PCR的方法對DNMTl的表達(dá)進(jìn)行測定。提取上述已構(gòu)建的肝癌細(xì)胞系的RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以生成cDNA。隨后進(jìn)行定量PCR檢測。對DNMTl基因所用引物為:forward primer:5，-AACCTTCACCTAGCCCCAG-3，，reverse primer:5’-CTCATCCGATTTGGCTCTTCA_3’。對GAPDH基因(內(nèi)參對照)所用引物為:forward primer:5， -CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3，， reverse primer:5， -TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3，。 PCR 結(jié)束后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出基因表達(dá)量。結(jié)果顯示，在TOTC處理和NF-kB基因敲減的腫瘤細(xì)胞中，DNMTl表達(dá)下降(圖3)。
[0023]五、建立裸鼠皮下種植腫瘤模型
[0024]BALB/c-nu雌性裸鼠，隨機(jī)分成亂序?qū)φ战M，NF_kB基因敲減組，和NF_kB合并RIZl雙基因敲減組。每只小鼠皮下注射0.2ml的相應(yīng)的細(xì)胞PBS懸液，細(xì)胞濃度為2 X 17個(gè)/ml ο接種5天后開始測量腫瘤長度(a)和寬度(b)。腫瘤體積按公式aXb2/2計(jì)算。接種30天后處死裸鼠，稱取腫瘤重量。
[0025]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制NF-kB活性，能夠有效的抑制RIZl基因的甲基化，從而恢復(fù)RIZl基因的表達(dá)，最終抑制人腫瘤細(xì)胞的增殖，其抑瘤率為84.9% (圖4)。當(dāng)我們同時(shí)敲減RIZl基因時(shí)，這一抑制腫瘤作用明顯受損(圖4)。這一發(fā)現(xiàn)可為基因特異性治療腫瘤并應(yīng)用于臨床提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.通過抑制NF-kB來治療存在有RIZl基因異常的腫瘤的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤存在有RIZl基因的基因異常。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中RIZl基因異常包括基因表達(dá)的缺失和下降。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中RIZl基因表達(dá)的缺失和下降是由于DNA甲基化所致。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的應(yīng)用，其中抑制NF-kB形式包括NF-kB基因沉默或NF_kB活性的抑制劑。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中NF-kB基因沉默中為使用shRNA對基因進(jìn)行敲減。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中NF-kB基因沉默的特征為，所用shRNA的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒(含慢病毒)，腺病毒，腺相關(guān)病毒。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中NF-kB活性的抑制劑為Pyrrolidinedith1carbamate。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征為，所述的腫瘤包括肝癌，肺癌，胃癌，結(jié)腸癌，乳腺癌，前列腺癌，腎癌，宮頸癌，食管癌，甲狀腺癌，卵巢癌，鼻咽癌，和白血病。
【專利摘要】本發(fā)明涉及NF-kB在治療RIZ1基因異常的腫瘤的應(yīng)用。本發(fā)明首次提出NF-kB在腫瘤細(xì)胞中的異常活化導(dǎo)致RIZ1基因甲基化并使RIZ1基因的表達(dá)缺失或下降，針對NF-kB的特異性抑制或基因沉默是治療這些有RIZ1基因異常的腫瘤的新靶向。本發(fā)明為有針對性的治療腫瘤提供了一種新的應(yīng)用手段。
【IPC分類】A61K48/00, A61P35/00, A61K31/7105
【公開號】CN105169412
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】馮功, 韓立偉
【申請人】馮功, 韓立偉
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月25日