.41(m，lH)，8. 14(d，J= 7.5Hz，lH)，7.59(d，J= 7.5Hz， 1H)，7. 24-7. 46(m，8H)，6. 79-7. 22(m，11H)，5. 66-5. 75(m，1H)，5. 05(s，2H)，4. 22-4. 34(m， 1H)，4. 01-4. 16 (m，2H)，3. 37-3. 45 (m，2H)，3. 14-3. 29 (m，2H)，2. 62-2. 80 (m，2H)，2. 58 (s， 3H) ;13C-NMR(75MHz，DMS0-d6) :S/ppm= 196. 42,171. 53,171. 44,170. 51，160. 82,157. 53， 142. 94,142. 62,139. 62,137. 67,136. 41，130. 44,129. 63 (2C)，129. 38 (2C)，128. 86 (2C)， 128. 52 (2C)，128. 43(2C)，128. 22 (2C)，128. 06,126. 71，125. 91，123. 98, 114. 94(2C)， 113. 89,112.66,100. 73,69. 65,63. 45,54. 13,48. 24,42. 28,35. 79,31. 22,21. 010
[0044] 實(shí)施例12評(píng)價(jià)化合物7a_f?抗細(xì)胞增殖活性
[0045] 本發(fā)明的化合物7a_f用含1 %DMSO的PBS配制，先用S180 (小鼠肉瘤細(xì)胞）和 HL60(人白血病細(xì)胞）篩選。然后選擇化合物7b為代表考察它們對(duì)腫瘤細(xì)胞A549(人肺癌 細(xì)胞），Bel-7402 (人肝癌細(xì)胞），H印G2 (人肝癌細(xì)胞），SW480 (人結(jié)腸癌細(xì)胞）和HCT-8 (人 回盲腸腺癌細(xì)胞）及非腫瘤細(xì)胞L02(人正常肝細(xì)胞）增殖的影響。
[0046] 分別將生長(zhǎng)狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549,Bel-7402,HCT-8,Haca-T，L02， H印G2,SW480,HL60和S180細(xì)胞按照5XIO4個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔100y1。在 37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，按預(yù)設(shè)的濃度梯度100, 50, 25,10和5yM加入經(jīng)滅菌 處理的本發(fā)明的化合物7a-f，對(duì)照組加入等體積溶解樣品的溶媒。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每 孔加濃度為5mg/ml的MTT溶液25y1，置于37°C孵育4小時(shí)，小心除去上清液（懸浮細(xì)胞 經(jīng)離心后除去上清液）后每孔加入DMSO(二甲基亞砜）100iil，振蕩15分鐘溶解沉淀。立 即于酶標(biāo)儀上570nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值（吸光度）。計(jì)算抑瘤率及IC5。。結(jié)果列入表1和表 2。表1說(shuō)明7a-f中大部分化合物對(duì)S180和HL60細(xì)胞增殖有較強(qiáng)抑制作用。于是選擇活 性好的7b進(jìn)一步用腫瘤細(xì)胞A549、Bel7402、IfepG2和HCT-8和非腫瘤細(xì)胞L02評(píng)價(jià)。表2 說(shuō)明，7c對(duì)腫瘤細(xì)胞A549、Bel7402、HepG2和HCT-8增殖有明顯的抑制作用，而對(duì)非腫瘤細(xì) 胞L02影響很小。
[0047] 表I7a-f抑制腫瘤細(xì)胞S180和HL60增殖的活性（ICM±SDyM)
[0048]
[0049] 表2 7b抑制腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞增殖的活性（ICM±SDyM)
[0050]
[0051 ] 實(shí)施例13評(píng)價(jià)7a_f的抗腫瘤活性
[0052] 測(cè)定前將本發(fā)明的化合物加吐溫80助溶，溶于生理鹽水。無(wú)菌條件下取接種于 ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入適量生理鹽水配制成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為2Xl〇VmL， 接種于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0. 2ml。腫瘤接種24h后，治療組小鼠 每日腹腔注射〇. 2ml本發(fā)明化合物的水溶液，連續(xù)給藥7天，劑量為0.Iymol/kg?？瞻捉M 小鼠每日腹腔注射0.2ml生理鹽水。以阿霉素（劑量為2ymol/kg)作陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)進(jìn) 行至第8天，稱小鼠體重，并剖取各組小鼠的腫瘤稱重，最后統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物的抑瘤率。實(shí)體 瘤的療效以瘤重抑制百分率表示，計(jì)算如下：瘤重抑制率％= (1-給藥組瘤重/空白組瘤 重）X100%。結(jié)果列入表3。給藥劑量在0.Iymol/kg下，化合物7a-f都有顯著的抗腫瘤 活性。其中化合物7b和7d的抗腫瘤活性強(qiáng)，與阿霉素相當(dāng)（p> 0. 05)。
[0053] 表3化合物6和7a_f對(duì)S180荷瘤小鼠瘤重的影響結(jié)果(？±5D)
[0054]
[0055] n= 12,a)與生理鹽水及化合物6比p< 0.01，與阿霉素比p> 0.05 ;b)與生理 鹽水組比P< 0.01，與化合物6比p> 0.05。
[0056] 實(shí)施例147b的劑量依賴實(shí)驗(yàn)
[0057] 按照實(shí)施例10的方法，選擇活性較強(qiáng)的7f測(cè)定0? 01ymol/kg、0.Iymol/kg和 Iymol/kg和10ymol/kg四種劑量下的活性，結(jié)果見(jiàn)表4。表4的數(shù)據(jù)表明，在0?Iymol/ kg和Iymol/kg和10ymol/kg劑量下7b都具有明顯的抗腫瘤活性。在0? 01ymol/kg的 劑量下7b不再顯示抗腫瘤活性。四種劑量下的活性顯示明顯差異，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。
[0058] 表4不同劑量7b對(duì)S180荷瘤小鼠瘤重的影響(3f±M>)
[0059]
[0060] n= 12，a)與生理鹽水組相比p< 0? 01 ;b)與 0?Iymol/kg7b比p< 0? 05 ;c)與 0?IUmol/kg和Iymol/kg7b比p< 0?OL
[0061 ] 實(shí)施例15評(píng)價(jià)7b對(duì)腫瘤細(xì)胞自噬的影響
[0062] 將A549細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，以IXIO5個(gè)/ml的密度均勻地接種到共聚焦培 養(yǎng)皿內(nèi)，移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜貼壁，然后加生理鹽水（陰性對(duì)照），雷帕霉素（25yM，陽(yáng)性 對(duì)照）和7b(25yM)孵育24小時(shí)。小心吸除培養(yǎng)基，用試劑盒中的緩沖溶液洗兩次。加入 100yICyto-ID?試劑盒中的綠色染色液對(duì)自噬體避光染色30分鐘，吸除上清，用試劑盒中 的緩沖溶液洗兩次。然后在激發(fā)波長(zhǎng)488nm下用激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)生理鹽水，雷帕霉 素和7b對(duì)細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0063] 哺乳動(dòng)物上雷帕霉素的靶蛋白mTOR是細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的重要調(diào)節(jié)因子，參與蛋 白質(zhì)、核糖體生物合成和細(xì)胞凋亡等多項(xiàng)生理過(guò)程。多數(shù)腫瘤與mTOR過(guò)度表達(dá)或突變有 關(guān)。雷帕霉素是mTOR變構(gòu)的抑制劑，通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制腫瘤細(xì)胞異常增殖。自噬體的特異 性標(biāo)記蛋白是LC3。腫瘤細(xì)胞自噬時(shí)，LC3-1通過(guò)脂質(zhì)化形成LC3-II定位于自噬體膜上。 自噬體膜上的LC3-II能和綠色熒光蛋白結(jié)合形成嵌合蛋白用激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)。
[0064] 圖2說(shuō)明，生理鹽水不引起A549細(xì)胞生成自噬體，雷帕霉素引起A549細(xì)胞生成自 噬體的作用明顯比7b引起A549細(xì)胞生成自噬體的作用弱（圖中白色圓圈為自噬體）?？?見(jiàn)，與雷帕霉素相似，7b代表的化合物7a-f的抗腫瘤作用是通過(guò)抑制mTOR變構(gòu)誘導(dǎo)自噬抑 制腫瘤細(xì)胞異常增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 下式代表的化合物7a-f，7a中AA為L(zhǎng)-對(duì)甲氧芐基半胱氨?；?，7b中AA為L(zhǎng)-單芐酯天冬氨?；?，7c中AA為 L-單芐酯谷氨酰基，7d中AA為L(zhǎng)-芐基-絲氨?；?，7e中AA為L(zhǎng)-苯乙酰賴氨酰基，7f中 AA為L(zhǎng)-芐基-酪氨?；?。2. 制備權(quán)利要求1的化合物7a-f的方法，該方法包括用五個(gè)關(guān)鍵步驟制備四個(gè)關(guān)鍵中 間體： 1) 制備1- (2, 2- 二甲氧乙基）_3-輕甲基-1，2, 3,4-四氛P專琳（3);2) 制備1-(2, 2_二甲氧乙基）_2_(1，3_二幾基丁基）_3_(1，3_二幾基丁基）氧化甲 基-1，2, 3,4-四氫咔啉（4);3) 制備3-乙醜基(1，3- 二幾基丁基）氧化甲基_4,6, 7,12-四氛氧化Π 引噪[2， 3-a]喹嗪（5);4) 制備3-乙?；?6-羥甲基-4,6, 7,12-四氫-4-氧化吲哚[2, 3-a]喹嗪（6);5) 往3-乙?；?6-羥甲基-4,6, 7,12-四氫-4-氧化吲哚[2, 3-a]喹嗪（6)引入苯乙 酰氨基酸。3. 權(quán)利要求1的化合物7a-f制備抗腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1的化合物7a-f作為制備mTOR變構(gòu)抑制劑誘導(dǎo)自噬的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了抑制細(xì)胞自噬的五環(huán)吲哚喹嗪，即(6S)-3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基?；?-氧化甲基-4，6，7，12-四氫-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪，公開了它們的合成、活性及應(yīng)用。
【IPC分類】C07D471/14, C07D471/04, A61P35/00, A61P35/02, A61K31/4375
【公開號(hào)】CN105175418
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】彭師奇, 趙明, 李春鈺
【申請(qǐng)人】首都醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2014年12月16日