一種聚氨酯材料強(qiáng)力親和多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了一組聚氨酯材料強(qiáng)力結(jié)合多肽的氨基酸序列及其在生物材料科學(xué) 領(lǐng)域中的應(yīng)用，屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域。該肽分子自身不僅能高效地結(jié)合在水基聚氨酯材 料表面，而且也能穩(wěn)定地結(jié)合在溶劑基聚氨酯材料表面，形成特殊多肽分子覆蓋的聚氨酯 界面；也可利用該親和多肽介導(dǎo)各種活性化合物分子、生物活性蛋白質(zhì)分子，和各種納微結(jié) 構(gòu)功能性材料在聚氨酯材料表面的結(jié)合；也可通過直接或間接與聚氨酯材料復(fù)合，改性傳 統(tǒng)聚氨酯材料，為開發(fā)具有生物活性的聚氨酯生物材料提供了良好的方法選擇。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚氨酯全稱為聚氨基甲酸酯，是主鏈上含有重復(fù)氨基甲酸酯基團(tuán)的大分子化合物 的統(tǒng)稱，它是由有機(jī)二異氰酸酯或多異氰酸酯與二羥基或多羥基化合物加聚而成。聚氨酯 材料一般具有高強(qiáng)度、高穩(wěn)定性和耐溶劑等特點(diǎn)，也可與各種有機(jī)物和無機(jī)物產(chǎn)生良好的 附著結(jié)合作用，因此，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于涂層材料領(lǐng)域。然而當(dāng)聚氨酯材料應(yīng)用于生物醫(yī) 藥或生物醫(yī)療器械材料領(lǐng)域時(shí)，其生物相容性差的特點(diǎn)逐漸顯示，它容易粘附蛋白質(zhì)或細(xì) 菌細(xì)胞反應(yīng)和引起炎癥。聚氨酯骨架的高穩(wěn)定性也使其分子本身顯示較高的化學(xué)反應(yīng)惰 性，因而很難直接在其表面進(jìn)行改性修飾然而，聚氨酯親和肽的出現(xiàn)，為實(shí)現(xiàn)改善聚氨酯材 料的生物相容性提供了方便的解決方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種聚氨酯材料 強(qiáng)力親和多肽，該肽能高效地結(jié)合在聚氨酯材料表面；將此特異性親和肽序列單獨(dú)或與其 它功能性化學(xué)或生物基團(tuán)，或納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，形成復(fù)合功能基團(tuán)或納米級(jí)材料，可使其自身 或整個(gè)功能基團(tuán)或顆粒吸附在聚氨酯材料表面；也可將多肽本身或整個(gè)功能基團(tuán)或顆粒與 聚氨酯材料共混，從而獲得具有特殊功能性的聚氨酯界面或聚氨酯復(fù)合材料，為開發(fā)具有 生物活性的聚氨酯材料提供了更好的方法。
[0004] 實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種聚氨酯材料強(qiáng)力親和多肽，它是一組包含 XHffXFRXffffXPX特異性氨基酸序列的多肽，X表示可選擇氨基酸其中第一個(gè)X是A、L、I、V、 M氨基酸中的任一種；第二個(gè)X是D、E氨基酸中的任一種；第三個(gè)X是Q、N氨基酸中的 任一種；第四個(gè)X是Q、N氨基酸中的任一種；第五個(gè)X是S、T、Y氨基酸中的任一種。
[0005] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述聚氨酯材料強(qiáng)力親和多肽直接在各種聚氨酯材 料表面和內(nèi)部的復(fù)合應(yīng)用，包括聚氨酯涂層、聚氨酯顆粒、聚氨酯纖維、聚氨酯薄膜，聚氨酯 泡沫等一切聚氨酯基的材料表面和內(nèi)部。
[0006] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述聚氨酯材料強(qiáng)力親和多肽與其它功能蛋白質(zhì)分 子融合表達(dá)后，在各種聚氨酯材料表面和內(nèi)部的復(fù)合應(yīng)用，包括聚氨酯涂層、聚氨酯顆粒、 聚氨酯纖維、聚氨酯薄膜，聚氨酯泡沫等一切聚氨酯基的材料表面和內(nèi)部。
[0007] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述聚氨酯材料強(qiáng)力親和多肽與其它功能蛋白質(zhì)分 子，或與功能性化合物分子通過化學(xué)共價(jià)交聯(lián)后，在各種聚氨酯材料表面和內(nèi)部的復(fù)合應(yīng) 用，包括聚氨酯涂層、聚氨酯顆粒、聚氨酯纖維、聚氨酯薄膜，聚氨酯泡沫等一切聚氨酯基的 材料表面和內(nèi)部。
[0008] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述聚氨酯材料強(qiáng)力親和多肽直接與各種納微結(jié)構(gòu) 材料進(jìn)行組裝；或與其它功能蛋白質(zhì)分子融合表達(dá)或化學(xué)交聯(lián)后，再與各種納微結(jié)構(gòu)材料 進(jìn)行組裝后，在各種聚氨酯材料表面和內(nèi)部的復(fù)合應(yīng)用，包括聚氨酯涂層、聚氨酯顆粒、聚 氨酯纖維、聚氨酯薄膜，聚氨酯泡沫等一切聚氨酯基的材料表面和內(nèi)部。
[0009]發(fā)掘聚氨酯強(qiáng)力親和肽，并利用該親和肽開發(fā)功能性聚氨酯界面材料或功能性聚 氨酯生物復(fù)合材料。此類親和多肽是一組包含XHffXFRX醫(yī)XPX (X表示氨基酸可變）特異性 氨基酸序列的多肽?？芍苯訉⒂H和肽分子通過浸潤或噴灑在普通聚氨酯材料表面，或作為 添加劑與聚氨酯材料復(fù)合應(yīng)用；也可將親和多肽與其它蛋白質(zhì)分子融合表達(dá)，化學(xué)交聯(lián)或 與特定的納微結(jié)構(gòu)材料組裝后，與傳統(tǒng)聚氨酯復(fù)合使用，從而獲得各種具有特殊生物活性 的聚氨酯功能界面或蛋白質(zhì)-聚氨酯復(fù)合功能材料。
【附圖說明】
[0010] 圖1.多肽的熒光光譜及熒光強(qiáng)度與濃度關(guān)系； 圖2為相對(duì)親和性對(duì)濃度的關(guān)系； 圖3為520 pM濃度噬菌體的相對(duì)親和性比較； 圖4親和噬菌體在PU材料表面的吸附的AFM圖； 圖5親和多肽對(duì)聚氨酯界面屏蔽蛋白質(zhì)吸附的影響； 圖6親和多肽對(duì)聚氨酯界面屏蔽蛋白質(zhì)吸附的影響； 下面結(jié)合實(shí)施例和試驗(yàn)例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而 非限制本發(fā)明的范圍。
[0011] 實(shí)施例1 一種聚氨酯材料強(qiáng)力親和多肽，它是一組包含XHffXFRX醫(yī)XPX特異性氨基酸序列的多 肽，其中，X表示可選擇氨基酸，在此例中具體氨基酸序列為VHffDFROffffOPS。
[0012] 實(shí)施例2 一種聚氨酯材料強(qiáng)力親和多肽，它是一組包含AHffDFRQ醫(yī)NPS特異性氨基酸序列的多 肽。
[0013] 實(shí)施例3 一種聚氨酯材料強(qiáng)力親和多肽，它是一組包含LHffEFRNWffNPY特異性氨基酸序列的多 肽。
[0014] 實(shí)施例4 一種聚氨酯材料強(qiáng)力親和多肽，它是一組包含IHffDFRQ醫(yī)QPT特異性氨基酸序列的多 肽。
[0015] 實(shí)施例5 一種聚氨酯材料強(qiáng)力親和多肽，它是一組包含MHffDFRNWffQPS特異性氨基酸序列的多 肽。
[0016] 試驗(yàn)例一：親和多肽直接在聚氨酯材料表面的吸附： I)配置I mg/ml的親和多肽溶液，取65 ML加入到PU包被的96孔板中的一個(gè)孔，室溫 震蕩15 h后用0. 1%TBST清洗5次，每次的清洗液及未結(jié)合的剩余多肽溶液回收到新的96 孔板中。
[0017] 2)由于TBST對(duì)采用試劑盒對(duì)多肽濃度進(jìn)行測(cè)定有影響，選擇測(cè)定熒光強(qiáng)度來分 析多肽的濃度。首先掃描熒光光譜（280 nm激發(fā)）得到342 nm發(fā)射峰，采用280 nm激發(fā)， 測(cè)定342 nm發(fā)射的熒光強(qiáng)度來繪制多肽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(配置0. 05~I mg/ml多肽標(biāo)準(zhǔn)溶 液)。
[0018] 3)取上述為結(jié)合的多肽剩余液和TBST清洗液每個(gè)20 W于384黑色微標(biāo)板中的 孔中，測(cè)定280 nm激發(fā)，342 nm發(fā)射的熒光強(qiáng)度，再通過熒光強(qiáng)度計(jì)算剩余多肽的量和清洗 下來的多肽的量。
[0019] 如圖1所示，多肽的熒光光譜及熒光強(qiáng)度與濃度關(guān)，親和多肽在0. 05-1 mg/mL濃 度范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈良好線性關(guān)系。每次清洗用100ML TBST溶液，總的被TBST洗下來的 多肽的濃度0.467474 mg/mL，則清洗下的多肽的總量為0.0467474 mg。剩余未結(jié)合的多肽 溶液為65 ML，多肽的量為0. 0103121 mg，因此結(jié)合在材料上多肽的量為0. 0076405 mg，96 孔板每個(gè)孔的底面積為0.32 cm2，則多肽的吸附密度為23. 8766 噸/cm2，即14. 2819 nmol/ cm2。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可直接證明此類親和多肽在聚氨酯材料表面可直接地牢固吸附。
[0020] 試驗(yàn)例二：親和多肽介導(dǎo)的生物分子在聚氨酯表面的吸附： 1)將融合表達(dá)了親和多肽VHffDFROffffOPS的噬菌斑單克隆接種一管ER2738于20 mL LB 培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至稍微渾濁。于每管培養(yǎng)液中加入5 ML噬菌體單克隆(具備親和性的 及作為對(duì)照的）上清，37°C通氣培養(yǎng)4 h。
[0021] 2)上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中，14, 000 rpm離心10 min。上清移入新鮮滅菌離心 管，再離心。取80%上清于另一新鮮滅菌離心管中，加1/6體積的PEG/NaCl，4°C沉淀過夜。
[0022] 3)4°C 14, 000 rpm 15 min離心沉淀，傾倒棄去上清，再進(jìn)行短暫離心I min，吸去 殘余上清，沉淀為噬菌體。沉淀重懸于I mL TBS中，懸液轉(zhuǎn)入新鮮滅菌離心管，4°C離心5 min除去沉淀中殘留的菌體細(xì)胞碎片。上清轉(zhuǎn)入新鮮滅菌離心管，加1/6體積的PEG/NaCl 再沉淀。冰浴60 min。4°C離心10 min，傾倒棄去上清，再進(jìn)行I min短暫離心，吸去殘余 上清。
[0023] 4)沉淀重懸于50 ML TBS中，此為噬菌體單克隆擴(kuò)增產(chǎn)物，測(cè)定滴度。擴(kuò)增產(chǎn)物 4°C貯存，3天內(nèi)使用。
[0024] 5)制備PU包被的96孔板：將50 uL水基聚氨酯PU-116加入到每個(gè)孔中。靜置 24 h，烘箱70度烘干4 h。再準(zhǔn)備一個(gè)96孔板進(jìn)行噬菌體的系列稀釋，并對(duì)其進(jìn)行封阻，以 避免噬菌體吸附到板上，封阻板4°C封阻1-2 h。
[0025] 6)在單獨(dú)的封阻板中每孔預(yù)先加入100 ML TBS/Tween(每排第一孔加入200 ML)， 在每排第一孔中加入1〇12個(gè)病毒子，混勻之后取100 ML加入到后面一個(gè)孔中并混勻。以此 稀釋到第12個(gè)孔。作圖計(jì)算時(shí)將病毒子個(gè)數(shù)換算成pM (pmol/L)。
[0026] 7)用100 ML, 0. 1%TBST洗PU包被板6次，每次均倒置平板在干凈紙巾上拍甩去 洗液。
[0027] 8)用多通道移液器將每排稀釋好的噬菌體加入包被有靶分子的板中。室溫震蕩作 用I hr后用100 ML, TBST洗板6次。
[0028] 9)以1:5, 000的比例用TBS稀釋HRP標(biāo)記的抗-Ml3抗體。每孔加入200 W稀釋 抗體，室溫震蕩作用I hr后用100 W，TBST洗板6次。
[0029] 10)測(cè)定過氧化氫酶HRP的量，采用ABST方法：將22