一種類彈性蛋白多肽與熱應激蛋白90α融合蛋白及其制備方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)研究領(lǐng)域，具體涉及一種類彈性蛋白多肽與熱應激蛋白90 a 融合蛋白的制備方法及其在傳染性法氏囊病病毒濃縮和純化中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳染性法氏囊病是由傳染性法氏囊病病毒（IBDV)引起的雞的一種高度接觸傳染 性傳染病，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。病毒濃縮與純化是病毒分子生物學研究和 疫苗制備的重要環(huán)節(jié)?，F(xiàn)有的IBDV濃縮方法主要有氯仿抽提和聚乙二醇沉淀等，純化方法 主要有差速離心、密度梯度離心和親和層析等，這些方法均存在費時、費力、回收率低和費 用高等缺點。另外，目前缺少快速、敏感、經(jīng)濟的IBDV環(huán)境監(jiān)測方法。
[0003] 病毒受體結(jié)合捕捉技術(shù)是近幾年出現(xiàn)的病毒濃縮與純化新技術(shù)，其基本原理是根 據(jù)病毒與受體結(jié)合的特異性，利用病毒受體蛋白偶聯(lián)的磁珠等固相載體從病毒感染組織、 動物食品和環(huán)境樣品中捕獲病毒，與PCR等技術(shù)相結(jié)合，還可用于病毒的環(huán)境監(jiān)測。該技術(shù) 具有快速、高效等優(yōu)點，但所用磁珠的價格昂貴、需要專門儀器設備，其實際應用受到限制。
[0004] 熱應激蛋白90 a (Hsp90 a )是IBDV的受體復合物成分，能與病毒顆粒及其VP2蛋 白結(jié)合，因此可以作為捕捉IBDV的誘餌蛋白。Hsp90 a分為N端結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和C端 結(jié)構(gòu)域，但其IBDV結(jié)合區(qū)尚不清楚。
[0005]類彈性蛋白多肽（ELP)是根據(jù)彈性蛋白相關(guān)序列合成的五肽（纈氨酸-脯氨 酸-甘氨酸-任何氨基酸-甘氨酸）聚合物，具有溫度敏感的可逆相變特性，在低于相變溫 度溶液中呈溶解狀態(tài)，高于相變溫度溶液中呈凝聚狀態(tài)。本課題組用ELP與腺病毒受體融 合蛋白建立了簡單、經(jīng)濟的重組腺病毒濃縮與純化方法，但ELP與Hsp90 a或其片段融合后 能否保持可逆相變特性，并用于IBDV濃縮與純化還有待研究。
[0006] 本發(fā)明將重組大腸桿菌表達的ELP_Hsp90 a融合蛋白用于IBDV的濃縮與純化，盡 管這種策略在理論上是可行的，但在具體設計時卻面臨以下技術(shù)問題：Hsp90 a或其片段 能否在大腸桿菌中高效和可溶性表達、表達的ELP融合能否與IBDV結(jié)合、IBDV結(jié)合區(qū)位于 哪個片段、最佳的結(jié)合條件是什么、如何洗脫與融合蛋白結(jié)合的病毒且不被滅活、結(jié)合融合 蛋白的IBDV能否感染易感細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種類彈性蛋白多肽（ELP)與熱應 激蛋白90 a (Hsp90 a)融合蛋白及其制備方法和應用。
[0008]本發(fā)明的類彈性蛋白多肽與熱應激蛋白90 a融合蛋白，由ELP和Hsp90 a的傳染 性法氏囊病病毒（IBDV)結(jié)合區(qū)組成。經(jīng)病毒濃縮和純化試驗證明，利用該融合蛋白能從感 染細胞培養(yǎng)上清、裂解細胞以及病毒污染模擬水樣中濃縮和純化IBDV。
[0009]為了確定IBDV結(jié)合區(qū)，本發(fā)明分別將ELP與全長Hsp90 a或其片段進行融合表 達；在不同條件下將融合蛋白與IBDV進行共孵育，以便確定融合蛋白結(jié)合IBDV的最佳條 件；通過對洗脫條件的系統(tǒng)優(yōu)化，使IBDV能從融合蛋白有效洗脫并不被滅活。最終，本發(fā)明 選擇含IBDV結(jié)合區(qū)的最短融合蛋白ELP-M167a進行IBDV濃縮與純化，以便在大腸桿菌中 高效表達和減少IBDV結(jié)合的非特異性。
[0010] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種類彈性蛋白多肽與熱應激蛋白90a融合蛋白， 是ELP-M167a，由ELP和Hsp90a的傳染性法氏囊病病毒結(jié)合片段M167a組成，所述M167a 的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0011] 本發(fā)明所述融合蛋白ELP-M167a用下列方法制備：
[0012] (1)用PCR克隆Hsp90 a中間結(jié)構(gòu)域167個氨基酸M167a的編碼序列如SEQ ID No. 2所示。
[0013] (2)將上述編碼序列插入ELP融合表達載體，獲得重組載體pELP-M167a;
[0014] (3)將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在20°C誘導融合蛋白表達；
[0015] (4)用2mol/L氯化鈉在26°C沉淀融合蛋白。
[0016] 本發(fā)明還公開了所述的ELP-M167a融合蛋白在IBDV濃縮與純化中的應用，其具體 方法如下：
[0017] (1)將320 y g/ml ELP-M167a融合蛋白分別與等量IBDV感染細胞培養(yǎng)上清、裂解 細胞以及模擬水樣混合；
[0018] (2)用2mol/L氯化鈉在26°C沉淀病毒；
[0019] (3)用pH9. 0緩沖液洗脫病毒；
[0020] (4)用2mol/L氯化鈉和26°C離心去除ELP-M167a融合蛋白。
[0021] 進一步地，公開了上述融合蛋白在濃縮和純化IBDV中的應用。本發(fā)明采用以下方 法對融合蛋白進行驗證：
[0022] (1)按照常規(guī)方法用IBDV感染細胞，獲得細胞培養(yǎng)上清和裂解細胞；
[0023] (2)將不同劑量IBDV接種自來水和PBS，獲得IBDV污染模擬水樣；
[0024] (3)將320 y g/ml ELP-M167a融合蛋白分別與等量IBDV感染細胞培養(yǎng)上清、裂解 細胞以及模擬水樣混合；
[0025] (4)用2mol/L氯化鈉和26°C沉淀病毒；
[0026](5)用pH9. 0緩沖液洗脫病毒；
[0027] (6)用2mol/L氯化鈉和26°C離心去除ELP-M167a融合蛋白。
[0028]與現(xiàn)有的其他方法相比，用本發(fā)明的融合蛋白不僅能從感染細胞中濃縮和純化 IBDV，而且能從病毒污染水樣中濃縮IBDV，純化的病毒不僅可用于動物實驗研究，而且可用 于疫苗制備。
【附圖說明】
[0029] 圖I Hsp90a結(jié)構(gòu)及其表達策略。數(shù)字表示氨基酸數(shù)，箭頭表示Hsp90a結(jié)構(gòu)域或 用于克隆表達的片段。
[0030] 圖2 ELP_Hsp90a融合蛋白的表達與純化及電泳分析。M是蛋白質(zhì)分子量標準，1 是IPTG誘導的重組菌裂解物，2是第一輪相變循環(huán)后的融合蛋白，3是第二輪相變循化后的 融合蛋白。
[0031] 圖3融合蛋白結(jié)合IBDV的RT-PCR檢測。M是DNA分子量標準，1是病毒陽性對照， 2是ELP-Hsp90a融合蛋白沉淀的病毒，3是ELP-N284融合蛋白沉淀的病毒，4是ELP-C444 融合蛋白沉淀的病毒，5是ELP-M167a融合蛋白沉淀的病毒，6是ELP-M167b融合蛋白沉淀 的病毒，7是ELP-C132融合蛋白沉淀的病毒，8是ELP沉淀的病毒。
[0032] 圖4融合蛋白沉淀傳染性法氏囊病病毒的條件與效率。
[0033] 圖5洗脫傳染性法氏囊病病毒的條件與效率。
【具體實施方式】
[0034] 生物材料來源：
[0035]I.pET_30a載體：從美國Novagen公司引進，本實驗室保存。
[0036] 2.pET/EI-GFP載體：從美國普林斯頓大學引進，本實驗室保存。文獻：Fong BA,ffoodDff.ExpressionandpurificationofELP-intein-taggedtargetproteinsin highcelldensityE.colifermentation.MicrobialCellFactories, 2010, 9:77.
[0037] 3.DH5a大腸桿菌：從美國BDBiosciencesClontech公司引進，本實驗室保存。
[0038] 4.BLR(DE3)大腸桿菌：從美國Novagen公司引進，本實驗室保存。
[0039] 5.雞胚成纖維細胞DF-I系：從美國ATCC引進，本實驗室保存；
[0040] 6.Lukert株傳染性法氏囊病病毒：由本實驗室保存（文獻：LukertPD,Leonard J,DavisRB.Infectiousbursaldiseasevirus:antigenproductionandimmunity.Am JVetRes，1975,36(4Pt2) :539-540)。
[0041] 具體操作步驟如下：
[0042] 1 ?融合表達載體構(gòu)建
[0043] (1)用限制酶NdeI和SacI消化pET/EI-GFP，電泳分離后按照DNA凝膠回收試劑盒 (AXYGEN公司）說明書回收ELP基因片段，與相同酶線性化的pET-30a載體連接，獲得ELP 融合表達載體pET-ELP。
[0044] (2)將生長狀態(tài)良好的雞成纖維DF-I細胞在42 °C培養(yǎng)3小時，按照RNAiso? Plus試劑盒（TaKaRa公司）說明書提取細胞總RNA，按照RevertAid?Reverse Transcriptase(Fermentas公司）說明進行反轉(zhuǎn)錄。
[0045] (3)根據(jù)雞 Hsp9O a mRNA 序列（GenBank Accession No:X〇7265)設計下列 1 對引 物，正向引物引入SalI酶切為點，反向引物引入XhoI酶切位點：
[0046]iH向引物：5' -TTGTCGACCCGGAAGCTGTGCAAACACAGG-3'(SEQIDNo. 3)；
[0047]反向引物：5' -AACTCGAGTTAATCCACCTCCTCCATACGT-3'(SEQIDNo. 4)。
[0048]以上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，按照LATaqDNA聚合酶（Fermentas公司）說明書，用 PCR擴增全長Hsp90acDNA(圖1)，用限制酶SalI和XhoI消化PCR產(chǎn)物，與相同酶切的 pET-ELP載體連接，獲得重組載體pELP-Hsp90a。
[0049] (4)根據(jù)雞Hsp9〇amRNA序列設計下列1對引物，正向引物引入Sal I酶切為點， 反向引物引入XhoI酶切位點：
[0050]iH向引物：5' -TTGTCGACCCGGAAGCTGTGCAAACACAGG-3'(SEQIDNo. 5)；
[0051]反向引物：5'-TTCTCGAGTTCCTCATCAATGTACTTCTCC-3'（SEQIDNo. 6)。以 pELP_Hsp90a為模板，按照LATaqDNA聚合酶說明書，用PCR擴增N284cDNA片段（圖1)， 用限制酶SalI和XhoI消化PCR產(chǎn)物，與相同酶切的pET-ELP載體連接，獲得重組載體PELP-N284。
[0052] (5)根據(jù)雞Hsp90 a mRNA序列設計下列1對引物，正向引物引入Sal I酶切為點， 反向引物引入Xho I酶切位點：
[0053]iH向引物：5'-TAGTCGACGAGCTCAACAAGACCAAGCC-3'(SEQIDNo. 7)；
[0054]反向引物：5'-AACTCGAGTTAATCCACCTCCTCCATACGT-3'(SEQID No. 8)。
[0055] 以pELP_Hsp90a為模板，按照LATaqDNA聚合酶說明書，用PCR擴增MC444cDNA 片段（圖1)，用限制酶SalI和XhoI消化PCR產(chǎn)物，與相同酶切的pET-ELP載體連接，獲 得重組載體PELP-MC444。
[0056] (6)根據(jù)雞Hsp90 a mRNA序列設計下列1對引物，正向引物引入Sal I酶切為點， 反向引物引入XhoI酶切位點：
[0057]正向引物：5'-CTGTCGACGAGGAAGAGCTCAACAAGAC-3'（SEQID No. 9);
[0058]反向引物：5'-CGCTCGAGTTAGGAGTCTTCATGTAITCCAA-3'（SEQID No. 10)。
[0059] 以pELP_Hsp90a為模板，按照LATaqDNA聚