d開 始產(chǎn)生色素，但產(chǎn)量較小，第4d開始大量產(chǎn)生，并且色素單天產(chǎn)量在第6d達(dá)到最多，8d時色 素的累積量最多，此后色素總量有所減少。當(dāng)發(fā)酵時間到達(dá)第9d時菌體色素產(chǎn)生量明顯減 少。因此對色素進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)時可以在第7d停止發(fā)酵，進(jìn)行色素的提取，此時能獲得最佳 產(chǎn)量。
[0092] 所述產(chǎn)環(huán)保型藍(lán)色色素的鏈霉菌（Streptomyces sp. ) YLAO菌株，其16rDNA的部 分基因序列為：
[0095] 以上基因測序結(jié)果由華大基因測試而得。
[0096] 正向引物 27F :GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG ;
[0097] 反向引物 1541R :AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。
[0098] 將得到的基因測序結(jié)果用在線的Blast軟件（http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/ blast)進(jìn)行同源性分析，結(jié)果在GenBank中找到多個鏈霉菌屬顯著相似的基因序列，其 同源性高達(dá)98%。通過Blast工具在NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索，并利 用Clustal W程序進(jìn)行多重序列比對。利用MEGA4.0軟件，采用相鄰拼接方法（Neighbor Joining Method)，獲得該菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖13)，將該菌鑒定為鏈霉菌，且該菌株與常 見的菌株均有某些特征不同，可能是能產(chǎn)生藍(lán)色色素的一個新種。
[0099] 該菌株已于2015年9月8日送至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心保藏，保藏編號為CGMCC No :11335。
[0100] 色素的性質(zhì)與穩(wěn)定性研究
[0101] 1.色素的溶解性：
[0102] 對產(chǎn)藍(lán)色素鏈霉菌搖床培養(yǎng)7d后停止發(fā)酵，收集發(fā)酵液首先進(jìn)行5000rpm離心 lOmin，取上清液平均分到兩個燒杯中，分別向上清液中不斷滴加 lmol/L氫氧化鈉溶液和 lmol/L鹽酸溶液，發(fā)現(xiàn)色素即可溶于堿溶液又可溶于酸溶液，且pH越低溶解度越小，當(dāng)pH < 4時搖勻后靜置Ih會產(chǎn)生磚紅色沉淀，將其調(diào)至堿性時，溶液又恢復(fù)藍(lán)色。將酸沉后的 色素干燥后，吸水性很差，但易溶于堿溶液，且性質(zhì)不變，所以可以用酸沉的色素較長時間 保藏。
[0103] 同樣取5份等量上清液，分別向上清液中加入等量同濃度的極性或非極性有機(jī)溶 劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該藍(lán)色素在極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑甲醇和乙醇中產(chǎn)生小顆粒狀沉淀，丙酮中可 產(chǎn)生絲狀沉淀，不溶于三氯甲烷、乙醚和乙酸乙酯等非極性的有機(jī)溶劑。
[0104] 實驗結(jié)果：根據(jù)以上實驗結(jié)果，結(jié)合相似相容的原理推測該色素的分子結(jié)構(gòu)是極 性的，對色素分子結(jié)構(gòu)的探究有一定的幫助。
[0105] 2. pH變化對色素呈色的影響
[0106] 在上述色素溶解性實驗中發(fā)現(xiàn)，向色素中不斷滴加酸或堿時，色素顏色隨pH的變 化而變化，具體變化過程如下：
[0108] 實驗結(jié)果：色素的變色區(qū)間在PH6-7之間，使之作為指示劑能較好地辨別弱酸或 弱堿溶液的酸堿性，可作為一種較好的酸堿指示劑。
[0109] 不同pH下的HPLC高效液相色譜圖，由圖可以看出不同pH下的色素出峰時間基本 沒有很大變化，說明其物質(zhì)結(jié)構(gòu)基本相同。
[0110] 3.不同離子對色素穩(wěn)定性的影響
[0111] 配制 0· 05mol/L 的以下鹽溶液（FeS04、ZnS04、MgS04、CaS04、CuS0 4、MnS04、BaS04、 Pb (NO3) 2、AgNO3，按照氧化還原集中的配制方法，配制鹽濃度為lmmol/L的25%發(fā)酵液的溶 液靜置一段時間。選取未發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)的溶液測其596nm處的OD值，發(fā)現(xiàn)色素溶液的吸光 度有所增強(qiáng)。未與色素發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)的鹽離子，對色素溶液吸光度的增強(qiáng)效果如圖16所 示：
[0112] 實驗結(jié)果：結(jié)合以上實驗可知Fe'Gu2+、Pb+可以與藍(lán)色素發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)而產(chǎn)生沉 淀。Fe3+產(chǎn)生的沉淀為黑褐色，上清為黃色。Gu 2+、Pb+產(chǎn)生的沉淀為藍(lán)色，上清為淺藍(lán)色或 者無色。其余離子能增強(qiáng)色素的穩(wěn)定性。
[0113] 4.溫度對色素穩(wěn)定性的影響
[0114] 取適量稀釋四倍的發(fā)酵液并將pH調(diào)至9,每次取IOmL分別裝入11支試管中，加 塞。保留一支處于室溫，其余10支放入l〇〇°C的水浴鍋中保溫，每隔IOmin取出一支并放入 冷水中冷卻，探究溫度對色素596nm處吸光度的影響。100°C的溫度對色素596nm處吸光度 的影響如圖17所示：
[0115] 可知100°C的溫度對色素596nm處的吸光度會照成一定影響，使其OD值降低。在 上述實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究影響吸光度的最低溫度，取11支試管分別加入IOmL的濃度 為25%?!1 = 9的發(fā)酵液。同樣保留1支處于室溫，其余9支分別置于50°(：、60°(：、70°(：、 80°C、90°C的水浴鍋中保溫，待2h后取出測其596nm處的吸光度。
[0116] 實驗結(jié)果：根據(jù)以上實驗可知，當(dāng)溫度為100°C時色素596nm處的吸光度隨時間的 增加而減小，因此高溫對色素的穩(wěn)定性影響較大。由于時間限制，未能進(jìn)行l(wèi)〇〇°C以上的溫 度對色素穩(wěn)定性影響實驗，根據(jù)50-100°C的影響結(jié)果趨勢推測，KKTC以上的高溫對色素穩(wěn) 定性影響更大。在使用過程中應(yīng)該避免長時間的高溫加工。
[0117] 5.光照對色素穩(wěn)定性的影響
[0118] 將適量濃度為25%的發(fā)酵液的pH調(diào)至9,分別取IOmL置于10支試管中，再將10 支試管分別置于不同環(huán)境中：1、2室外見光，3、4室外避光，5、6室內(nèi)見光，7、8室內(nèi)避光，9、 10紫外光照。每隔24h測其596nm處的吸光度，連續(xù)測五天。
[0119] 實驗結(jié)果：通過分析折線圖可知光照對色素的影響比較明顯，室外強(qiáng)光對色素的 影響更為明顯，所以室外比室內(nèi)的色素變化更明顯。室內(nèi)避光、紫外光和冰箱保存三個條件 下對色素的影響不是特別明顯，可以選擇其一作為保藏條件。
[0120] 實施例4
[0121] 環(huán)保型藍(lán)色色素的提取工藝，包括步驟：
[0122] 1)離心分離實施例2所得發(fā)酵液；具體地，進(jìn)行兩次離心分離；第一次離心分離以 轉(zhuǎn)速4000-5000rpm離心所述發(fā)酵液5-10分鐘；第二次離心分離以轉(zhuǎn)速1. 0-1. 2萬rpm離 心第一次離心分離所得上清液10-15分鐘；第二次離心分離所得上清液為上清液一，兩次 離心分離所得沉淀匯總為沉淀一；
[0123] 2)采用I-IOKda的超濾離心管以轉(zhuǎn)速4000-5000rpm超濾分離上清液一 5-15分 鐘，得超濾透過液一和超濾濃縮液一，超濾濃縮液一中加濃鹽酸，進(jìn)行酸沉處理，濃鹽酸的 加入量滿足ImL濃鹽酸/300mL發(fā)酵液；酸沉處理完畢離心分離得上清液二和沉淀二；向沉 淀二中加20 % -40 %的氫氧化鈉水溶液，調(diào)節(jié)pH至7-8,沉淀二溶解，得清液A ;
[0124] 3)向清液A中加入占清液A總體積40-60 %的乙醇，進(jìn)行醇沉處理，醇沉處理完畢 離心分離得上清液四和沉淀四，干燥沉淀四，得固體藍(lán)色色素。
[0125] 酸沉后所得干品加 lmol/L堿液，過超濾管后的色素，在Agilent Technogies HPLC色譜柱，Eclipse XDB-C18,4.6*250mm，5um，流動相10-40%甲醇水溶液都可以，流速 0. 5-1. OmL/min，檢測波長587-596nm均可。結(jié)果如圖19所示，由圖可以看出該色素總體較 純，其他物質(zhì)含量很少。
[0126] 實施例5
[0127] 環(huán)保型藍(lán)色色素的提取工藝，包括步驟：
[0128] 1)離心分離實施例2所得發(fā)酵液；具體地，進(jìn)行兩次離心分離；第一次離心分離以 轉(zhuǎn)速4000-5000rpm離心所述發(fā)酵液5-10分鐘；第二次離心分離以轉(zhuǎn)速1. 0-1. 2萬rpm離 心第一次離心分離所得上清液10-15分鐘；第二次離心分離所得上清液為上清液一，兩次 離心分離所得沉淀匯總為沉淀一；
[0129] 2)向上清液一中直接加濃鹽酸，進(jìn)行酸沉處理，濃鹽酸的加入量滿足ImL濃鹽酸 /300mL發(fā)酵液；酸沉處理完畢離心分離得上清液三和沉淀三；向沉淀三中加20% -40%的 氫氧化鈉水溶液，調(diào)節(jié)pH至7-8,沉淀三溶解，得清液B ;采用I-IOKda的超濾離心管以轉(zhuǎn)速 4000-5000rpm超濾分離清液B5-15分鐘，得超濾透過液二和超濾濃縮液二，超濾濃縮液二 備用；
[0130] 3)向超濾濃縮液二中加入占超濾濃縮液二總體積40-60