凝結(jié)芽孢桿菌fm603及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物及其培養(yǎng)和應(yīng)用技術(shù)，具體涉及一種產(chǎn)生細菌素的新的凝結(jié)芽 孢桿菌菌株，以及該菌株在飼料添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素是微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，對其它微生物具有抗菌活性。20世紀40年 代，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)飼喂動物低劑量的抗生素可以改善動物的生產(chǎn)性能，提高經(jīng)濟效益。在之 后的幾十年內(nèi)，抗生素廣泛的應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖行業(yè)，添加于飼料中用作生長促進劑，或者在 養(yǎng)殖現(xiàn)場用作治療藥劑。抗生素的使用顯著的提高了動物的生長效率和飼料轉(zhuǎn)化率，對畜 牧行業(yè)的發(fā)展起到了重要的作用。但是抗生素的使用也帶來了諸多問題，比如耐藥細菌的 傳播、二次感染及動物產(chǎn)品中的藥物殘留等。耐藥菌的出現(xiàn)嚴重的威脅到人類健康，以抗甲 氧苯青霉素金黃色葡萄球菌為例，感染該抗藥菌株的死亡率是普通菌株的三倍，而且治療 費用和住院時間也增加很多。在美國和英國，約有40-60%的金黃色葡萄球菌具有甲氧苯青 霉素抗性，在中國，約60-70%的大腸桿菌對氟喹諾酮類抗生素不敏感。大量使用抗生素，并 違反停藥期規(guī)定則容易導(dǎo)致動物產(chǎn)品中的藥物殘留超標，這樣的動物產(chǎn)品很難進入國際市 場，也會對人的健康存在潛在威脅。近些年來我國食品安全事故時有報道，2013年初的速生 雞事件和禽流感的爆發(fā)給家禽養(yǎng)殖行業(yè)帶來了巨大損失，消費者們對畜牧養(yǎng)殖行業(yè)的關(guān)注 也日漸增多，如何保證動物的高生產(chǎn)性能，同時生產(chǎn)出安全的肉、蛋、奶產(chǎn)品，關(guān)系到畜牧養(yǎng) 殖行業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。歐盟于2006年全面禁止抗生素作為生長促進劑添加在飼料中，韓 國也于2011年禁用了抗生素類生長促進劑。中國如今也面臨著是否禁止飼料中添加抗生 素的問題，這也促使飼料和養(yǎng)殖企業(yè)，以及農(nóng)牧院校的研究人員積極致力于生物制劑的開 發(fā)和使用，以減少或者替代抗生素的應(yīng)用。
[0003] 芽孢桿菌是革蘭氏陽性、產(chǎn)芽孢的一類桿菌，廣泛的存在于自然界中。芽孢桿菌 在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為芽孢形式，芽孢對外界不良環(huán)境如高溫、高壓、紫外線等有極強的 抵抗力。芽孢桿菌在工業(yè)上用作淀粉酶和蛋白酶的生產(chǎn)菌種，也長期的用于發(fā)酵類食品的 制作。芽孢桿菌有益于食物的消化和腸道健康，能夠促進動物的生產(chǎn)性能，因此也用作食品 補充劑和動物益生菌。大量的研究數(shù)據(jù)表明，芽孢桿菌能夠提高動物的生產(chǎn)性能，減少病原 菌感染幾率，提高動物機體免疫，降低養(yǎng)殖環(huán)境的氨氣濃度，是抗生素類生長促進劑的良好 替代品。芽孢桿菌通過刺激動物腸絨毛發(fā)育，提高非特異性免疫，產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)發(fā)揮作 用。細菌素是芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)之一，是微生物通過核糖體合成的多肽類抗菌 物質(zhì)，對很多病原菌包括耐藥菌具有良好的抗菌活性。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生細菌素類抗菌物 質(zhì)，如subtilin、sublancin、subtilosin、Iichenin等。細菌素是益生菌的重要功能性物 質(zhì)，考克大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)細菌素的乳酸菌可以有效的減少單核增生李斯特菌對小 鼠的感染，但是在單核增生李斯特菌獲得該細菌素的免疫基因后，乳酸菌失去對小鼠的保 護功能。有研究表明，細菌素可以降低動物腸道中的葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酸酶活性，促進 肉雞增重，提高生產(chǎn)性能，機理與抗生素相似。因此，相比起普通芽孢桿菌，產(chǎn)細菌素的芽孢 桿菌對動物的生產(chǎn)性能具有更為良好的促進作用，在實際生產(chǎn)中具有更大的應(yīng)用潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一株產(chǎn)生細菌素的凝結(jié)芽孢桿菌新菌株。
[0005] 本發(fā)明所提供的凝結(jié)芽孢桿菌，是凝結(jié)芽孢桿菌FM603,該菌株已于2014年12月 17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市 朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，分類命名為凝結(jié)芽孢桿菌 (Bacillus coagulans)，保藏號為 CGMCC NO. 10221。
[0006] 本發(fā)明菌株FM603在常溫和常規(guī)培養(yǎng)基上生長良好，菌落在胰蛋白胨瓊脂上呈白 色，不規(guī)則，表面粗糙。革蘭氏染色陽性，產(chǎn)芽孢。將該菌的16S rRNA序列在美國國家生物 技術(shù)信息中心（NCBI)數(shù)據(jù)庫BLAST比對，與凝結(jié)芽孢桿菌的同源性為99%，經(jīng)API 50CHB 試劑盒（bioMerieux, France)鑒定該菌與凝結(jié)芽孢桿菌的相似度為99. 7%，因此判定該菌 為凝結(jié)芽孢桿菌，命名FM603。
[0007] FM603可采用常規(guī)培養(yǎng)基在普通條件下培養(yǎng)，但是在改良胰蛋白胨培養(yǎng)基中能 獲得更高生物量，改良胰蛋白胨培養(yǎng)基組成為：質(zhì)量體積百分比，胰蛋白胨1.5%，葡萄 糖1. 5 %，酵母浸粉0. 5 %，玉米漿干粉0. 2 %，硫酸銨0. 05 %，氯化鈉0. 1 %、磷酸二氫鈉 0.05%、蒸餾水 100011^4!17.0，培養(yǎng)條件為30°(：，150印111培養(yǎng)2011。
[0008] 凝結(jié)芽孢桿菌FM603發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生細菌素，對革蘭氏陽性細菌具有良好的抗菌作 用。該細菌素分子量為4276. 4?a，部分氨基酸序列為Ala-Gly-His-Dhb-Phe-Val-Dhb-Gly -Pro。該細菌素可改變革蘭氏陽性菌細胞膜通透性，導(dǎo)致細胞內(nèi)鉀離子外流。
[0009] 本發(fā)明還提供一種發(fā)酵生產(chǎn)上述細菌素的方法，包括如下步驟：
[0010] 1)發(fā)酵上清液制備：將凝結(jié)芽孢桿菌FM603接種于IOmL液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜， 將ImL培養(yǎng)液接種于1000 mL改良胰蛋白胨培養(yǎng)基，200rpm，30°C培養(yǎng)20h，1000 Orpm離心除 去菌體，得到發(fā)酵上清液；
[0011] 2)細菌素粗提液制備：將離子柱用50mM、pH 6. 5的磷酸鹽緩沖液平衡，發(fā)酵上清 液以50mL/min的流速通過離子柱，將通過離子柱的上清液棄去，用磷酸鹽緩沖液沖洗離子 柱后，以含IM NaCl的磷酸鹽緩沖液（50mM，pH 6. 5)洗脫離子柱，流速為10mL/min，收集洗 脫液100mL，將洗脫液通過C18固相萃取柱，用100%的乙腈洗脫固相萃取柱并收集洗脫液， 將洗脫液冷凍干燥后，溶解在50mM、pH 6. 5的磷酸鹽緩沖液中，過濾后得到類細菌素粗提 液；
[0012] 3)細菌素的純化：類細菌素粗提液用高效液相色譜純化，使用C18反相柱 (250mmX 10mm，5 μ粒徑），流動相分別為A :100%乙腈，B :水，上樣量為100 μ L，洗脫時間 為40分鐘，流速為lmL/min，收集每分鐘洗脫的溶液，重復(fù)多次上樣純化后將相同時間點的 洗脫液合并，冷凍干燥后溶于50mM磷酸鹽緩沖液，并檢測洗脫液的抗菌活性，以Listeria innocua為指示菌，獲得純化的細菌素。
[0013] 與已報道的芽孢桿菌細菌素相比，F(xiàn)M603生產(chǎn)的細菌素在生物學(xué)特性及抗菌活性 方面存在較大區(qū)別。
[0014] FM603產(chǎn)生的細菌素對熱、酸穩(wěn)定，在60-70°C水浴10分鐘保持90%以上活性， 在80-100°C水浴10分鐘保持80%活性；在pH 2-8范圍內(nèi)處理2h活性損失小于10%，在 PH9-10范圍內(nèi)處理2h活性存留60%。該細菌素在胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋 白酶、羧肽酶、淀粉酶、脂肪酶處理Ih后活性存留率大于90%，鏈霉蛋白酶處理Ih后剩余 20 %活性（詳細見表2)。
[0015] 該細菌素對革蘭氏陽性致病菌如金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、蠟樣芽孢 桿菌和耐藥菌如抗甲氧西林金黃色葡萄球菌具有很強的抗菌活性（抑菌圈直徑>20mm)，對 厭氧產(chǎn)芽孢梭菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌和堅強梭菌具有較強的抗菌活性（抑菌圈直徑17_18mm)， 對革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門氏菌、耶爾森菌，革蘭氏陽性菌如枯草芽孢桿菌、地衣芽 孢桿菌、乳桿菌以及酵母菌無抗菌活性，對霉菌如黃曲霉菌具有一定抗菌活性（詳細見表 3) 〇
[0016] 本發(fā)明純化的細菌素經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，凝膠4500Da處有一條蛋白條帶，將凝 膠切下來進行抗菌活性檢測，結(jié)果表明，該蛋白對李斯特菌有明顯的抗菌活性。FM603細菌 素經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析，分子量為4276. 4?a，部分氨基酸序 列為Ala-Gly-HiS-Dhb-Phe-