一種胰激肽原酶純化工藝的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種分離純化方法，尤其涉及一種胰激肽原酶純化工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰激肽原酶是一種由18種氨基酸、4種糖組成的糖蛋白。它作用于蛋白質(zhì)底物激 肽原后釋放出激素物質(zhì)激肽。具有以下作用：擴張血管、改善微循環(huán)；激活纖溶酶、降低血 粘度；激活磷脂酶A2,防止血小板聚集，防止血栓形成等；因此常被用作臨床血管擴張藥。 此外，還可用來治療微循環(huán)障礙性疾病，如糖尿病引起的腎病、周圍神經(jīng)病、視網(wǎng)膜病、眼底 病及缺血性腦血管病，也可用于原發(fā)性高血壓的輔助治療。
[0003] 胰激肽原酶是從哺乳動物的胰臟中提取純化而得，提取途徑為從胰臟本身、胰酶 粉或胰激肽原酶粗品中提取，并通過純化而獲得胰激肽原酶純品。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中，胰激肽原酶的純化工藝主要有離子交換層析，疏水層析，超濾等方 法。中國專利CN00119540. 9胰激肽原酶的制備及其親和層析純化方法，該專利利用胰激肽 原酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶對酶抑制劑的親和性的差別，使抑制劑與水不溶性載體結(jié) 合。而將激肽原酶與其他酶分解，進而制得高純度的胰激肽原酶產(chǎn)品。本發(fā)明具有以下優(yōu) 點：工藝簡單、操作方便、適于工業(yè)化生產(chǎn)，且獲得的胰激肽原酶單位效價較高，比活及收率 較原有技術(shù)提升較大。但是上述方法在工業(yè)化純化時規(guī)模較小，自動化程度較低，且工業(yè)化 生產(chǎn)時上述方法的重現(xiàn)性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是：本發(fā)明通過提供一種胰激肽原酶純化工藝解決現(xiàn)有技術(shù)中胰激 肽原酶純化技術(shù)規(guī)模較小、重現(xiàn)性較差、自動化程度低的問題，本發(fā)明采用親和層析對胰激 肽原酶進行純化，從而獲得單位效價高、比活高、收率高的胰激肽原酶。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] -種胰激肽原酶純化工藝，包含以下步驟：
[0008] (1)提?。簩⒋忠燃る脑负惋嬘盟度敕磻拗?，攪拌至完全溶解，用酸調(diào)節(jié)pH 至 3. 0 ~6. 0 ;
[0009] (2)超濾：將步驟（1)獲得的混合液過濾或離心后取清液，將清液過超濾膜，期間 分次加入純化水，至超濾液電導率低于2000 μ s/cm后收集超濾液；
[0010] (3)鹽析：按超濾液與硫酸銨質(zhì)量比1:0. 1~0. 5向超濾液中加入硫酸銨，靜置后 離心收集上清液；
[0011] (4)層析：將200~300升的親和填料裝入層析柱中，并與層析系統(tǒng)相連，系統(tǒng)流 速設為600~800升/小時，用質(zhì)量濃度為10~20%的硫酸銨平衡層析柱；將步驟（3)中獲 得的上清液流經(jīng)層析柱，并用質(zhì)量濃度為10~20%的硫酸銨洗滌，然后用質(zhì)量濃度為10~ 20%的氯化鈉洗脫，收集洗脫液，至紫外波長280nm處的吸收線降至基線后停止收集；
[0012] (5)超濾濃縮：將步驟（4)收集的洗脫液過超濾膜，期間分次加入純化水，至超濾 液電導率低于1000 μ s/cm后收集超濾液；
[0013] (6)除菌凍干：向步驟（5)中獲得的超濾液中加入輔料，超濾液與輔料的質(zhì)量比為 5~7:0. 2~0. 7,除菌過濾后在-40~-30°C條件下凍干得到胰激肽原酶凍干粉。
[0014] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，步驟（1)中至粗胰激肽原酶完全溶解后，用酸調(diào)節(jié)pH至 4. 5〇
[0015] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，步驟（3)中按超濾液與硫酸銨質(zhì)量比1:0. 2向超濾液中 加入硫酸銨，靜置后離心收集上清液。
[0016] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，步驟（4)層析過程中，溫度不高于20°C。
[0017] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，步驟（2)與步驟（5)中使用的超濾膜規(guī)格為分離分子量 10000道爾頓的膜。
[0018] 有益效果
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0020] (1)本發(fā)明所述胰激肽原酶純化工藝能夠適應工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)的需求，重現(xiàn) 性好、保證不同生產(chǎn)批次的產(chǎn)品質(zhì)量；
[0021] (2)本發(fā)明所述胰激肽原酶純化工藝縮短了整個生產(chǎn)工序的時間，自動化程度 尚；
[0022] (3)本發(fā)明所述胰激肽原酶純化工藝每批次可獲得3. 5億單位的胰激肽原酶產(chǎn) 品，且產(chǎn)品純度達到90%以上，比活大于800U/mg · pro,整個層析工藝花費的時間縮短至4 小時以內(nèi)。
【具體實施方式】 [0023] 實施例1 :
[0024] 一種胰激肽原酶純化工藝，包含以下步驟：
[0025] (1)提取：向反應罐中加入800kg的粗胰激肽原酶和10. 8噸飲用水，攪拌至完全 溶解，制得粗提液，用草酸溶液調(diào)節(jié)PH至3. 0,攪拌反應2小時后離心獲得清夜；
[0026] (2)超濾：將步驟（1)獲得的清液過超濾膜，超濾膜規(guī)格為分離分子量10000道爾 頓，期間分次加入純化水，至超濾液電導率達到2000 μ s/cm后收集超濾液；
[0027] (3)鹽析：按超濾液與硫酸銨質(zhì)量比1:0. 1向超濾液中加入硫酸銨，靜置1小時后 離心收集上清液；
[0028] (4)層析：將200升的親和填料裝入層析柱中，并與層析系統(tǒng)相連，系統(tǒng)流速設為 600升/小時，用質(zhì)量濃度為10%的硫酸銨平衡層析柱；將步驟（3)中獲得的上清液流經(jīng)層 析柱，并用質(zhì)量濃度為10 %的硫酸銨洗滌，然后用質(zhì)量濃度為10 %的氯化鈉洗脫，收集洗 脫液，至紫外波長280nm處的吸收線降至基線后停止收集，該步驟反應溫度控制在16°C ;
[0029] (5)超濾濃縮：將步驟（4)收集的洗脫液過超濾膜，超濾膜規(guī)格為分離分子量 10000道爾頓，期間分次加入純化水，至超濾液電導率為1000 μ s/cm后收集超濾液；
[0030] (6)除菌凍干：向步驟（5)中獲得的超濾液中加入輔料，超濾液與輔料的質(zhì)量比為 5:0. 2,除菌過濾后在-30°C條件下凍干得到胰激肽原酶凍干粉。
[0031] 實施例2:
[0032] 一種胰激肽原酶純化工藝，包含以下步驟：
[0033] (1)提?。合蚍磻拗屑尤?00kg的粗胰激肽原酶和10. 8噸飲用水，攪拌至完全 溶解，制得粗提液，用草酸溶液調(diào)節(jié)PH至4. 5,攪拌反應2小時后離心獲得清夜；
[0034] (2)超濾：將步驟（1)獲得的清液過超濾膜，超濾膜規(guī)格為分離分子量10000道爾 頓，期間分次加入純化水，至超濾液電導率達到1600 μ s/cm后收集超濾液；
[0035] (3)鹽析：按超濾液與硫酸銨質(zhì)量比1:0. 2向超濾液中加入硫酸銨，靜置1小時后 離心收集上清液；
[0036] (4)層析：將300升的親和填料裝入層析柱中，并與層析系統(tǒng)相連，系統(tǒng)流速設為 700升/小時，用質(zhì)量濃度為12%的硫酸銨平衡層析柱；將步驟（3)中獲得的上清液流經(jīng)層 析柱，并用質(zhì)量濃度為12 %的硫酸銨洗滌，然后用質(zhì)量濃度為14 %的氯化鈉洗脫，收集洗 脫液，至紫外波長280nm處的吸收線降至基線后停止收集，該步驟反應溫度控制在16°C ;
[0037] (5)超濾濃縮：將步驟（4)收集的洗脫液過超濾膜，超濾膜規(guī)格為分離分子量 10000道爾頓，期間分次加入純化水，至超濾液電導率為800 μ s/cm后收集超濾液；
[0038] (6)除菌凍干：向步驟（5)中獲得的超濾液中加入輔料，超濾液與輔料的質(zhì)量比為 6:0. 5,除菌過濾后在-40°C條件下凍干得到胰激肽原酶凍干粉。
[0039] 實施例3 :
[0040] 一種胰激肽原酶純化工藝，包含以下步驟：
[0041] (1)提?。合蚍磻拗屑尤?00kg的粗胰激肽原酶和10. 8噸飲用水，攪拌至完全 溶解，制得粗提液，用草酸溶液調(diào)節(jié)PH至6. 0,攪拌反應2小時后離心獲得清夜；
[0042] (2)超濾：將步驟（1)獲得的清液過超濾膜，超濾膜規(guī)格為分離分子量10000道爾 頓，期間分次加入純化水，至超濾液電導率達到1200 μ s/cm后收集超濾液；
[0043] (3)鹽析：按超濾液與硫酸銨質(zhì)量比1:0. 5向超濾液中加入硫酸銨，靜置1小時后 離心收集上清液；
[0044] (4)層析：將260升的親和填料裝入層析柱中，并與層析系統(tǒng)相連，系統(tǒng)流速設為 800升/小時，用質(zhì)量濃度為20%的硫酸銨平衡層析柱；將步驟（3)中獲得的上清液流經(jīng)層 析柱，并用質(zhì)量濃度為20 %的硫酸銨洗滌，然后用質(zhì)量濃度為20 %的氯化鈉洗脫，收集洗 脫液，至紫外波長280nm處的吸收線降至基線后停止收集，該步驟反應溫度控制在16°C ;
[0045] (5)超濾濃縮：將步驟（4)收集的洗脫液過超濾膜，超濾膜規(guī)格為分離分子量 10000道爾頓，期間分次加入純化水，至超濾液電導率為800 μ s/cm后收集超濾液；
[0046] (6)除菌凍干：向步驟（5)中獲得的超濾液中加入輔料，超濾液與輔料的質(zhì)量比為 7:0. 7,除菌過濾后在-35°C條件下凍干得到胰激肽原酶凍干粉。
[0047] 對實施例1~3所述方案純化獲得的產(chǎn)品進行檢測，結(jié)果如下表所示：
CN 105176953 A 說明書 4/4 頁
【主權(quán)項】
1. 一種胰激肽原酶純化工藝，其特征在于，包含以下步驟： (1) 提?。簩⒋忠燃る脑负惋嬘盟度敕磻拗?，攪拌至完全溶解，用酸調(diào)節(jié)PH至 3.O~6.O; (2) 超濾：將步驟（1)獲得的混合液過濾或離心后取清液，將清液過超濾膜，期間分次 加入純化水，至超濾液電導率低于2000ys/cm后收集超濾液； (3) 鹽析：按超濾液與硫酸銨質(zhì)量比1:0. 1~0. 5向超濾液中加入硫酸銨，靜置后離心收 集上清液； (4) 層析：將200~300升的骨架為聚甲基丙烯酸樹脂的親和填料裝入層析柱中，并與自 動層析系統(tǒng)相連，系統(tǒng)流速設為600~800升/小時，用質(zhì)量濃度為10~20%的硫酸銨平衡層 析柱；將步驟（3)中獲得的上清液流經(jīng)層析柱，并用質(zhì)量濃度為10~20%的硫酸銨洗滌，然后 用質(zhì)量濃度為1〇~20%的氯化鈉洗脫，收集洗脫液，至紫外波長280nm處的吸收線降至基線 后停止收集； (5) 超濾濃縮：將步驟（4)收集的洗脫液過超濾膜，期間分次加入純化水，至超濾液電 導率低于1000ys/cm后收集超濾液； (6) 除菌凍干：向步驟（5)中獲得的超濾液中加入輔料，超濾液與輔料的質(zhì)量比為 5~7:0. 2~0. 7,除菌過濾后在-4030°C條件下凍干得到膜激肽原酶凍干粉。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種胰激肽原酶純化工藝，其特征在于，步驟（1)中至粗胰激 肽原酶完全溶解后，用酸調(diào)節(jié)pH至4. 5。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種胰激肽原酶純化工藝，其特征在于，步驟（3)中按超濾液與 硫酸銨質(zhì)量比1:0. 2向超濾液中加入硫酸銨，靜置后離心收集上清液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種胰激肽原酶純化工藝，其特征在于，步驟（4)層析過程中， 溫度不高于20 °C。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種胰激肽原酶純化工藝，其特征在于，步驟（2)與步驟（5)中 使用的超濾膜規(guī)格為分離分子量10000道爾頓的膜。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種胰激肽原酶純化工藝，該工藝包括提取、超濾、鹽析、層析、超濾濃縮、及除菌凍干過程。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：（1）本發(fā)明所述胰激肽原酶純化工藝能夠適應工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)的需求，重現(xiàn)性好、保證不同生產(chǎn)批次的產(chǎn)品質(zhì)量；（2）本發(fā)明所述胰激肽原酶純化工藝縮短了整個生產(chǎn)工序的時間，自動化程度高；（3）本發(fā)明所述胰激肽原酶純化工藝每批次可獲得3.5億單位的胰激肽原酶產(chǎn)品，且產(chǎn)品純度達到90%以上，比活大于800？U/mg·pro，整個層析工藝花費的時間縮短至4小時以內(nèi)。
【IPC分類】C12N9/64
【公開號】CN105176953
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】王軻, 周翔, 潘偉忠
【申請人】常州千紅生化制藥股份有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年8月3日