RNAs基因的方法驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為準(zhǔn)確，足見(jiàn)本發(fā)明的試劑盒和方法在檢測(cè)與食管鱗癌相關(guān)的血清miRNAs基因以及食管鱗癌的篩選中的準(zhǔn)確性。
[0027]以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于檢測(cè)食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的試劑盒，其特征在于包含有用于診斷食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的莖環(huán)引物與RNase-free水配制的檢測(cè)試劑，其中食管鱗癌相關(guān)血清 miRNAs 基因是 hsa-miR-10a_5p 基因、hsa-miR-16_5p 基因、hsa-miR-18a_5p基因、hsa-miR-21_5p 基因、hsa-miR-22_3p 基因、hsa-miR-25_3p 基因、hsa-miR-31_5p 基因、hsa-miR-100-5p 基因、hsa-miR-107 基因、hsa-miR-127_3p 基因、hsa-miR-129_5p 基因、hsa-miR-148b_3p 基因、hsa-miR-155_5p 基因、hsa-miR-194_5p 基因、hsa-miR-200c_3p基因、hsa-miR-223_3p 基因、hsa-miR-337_5p 基因、hsa-miR-375 基因、hsa-miR-483_5p 基因、hsa-miR-548k基因、hsa-miR-1246基因或hsa-miR-1322基因，用于診斷食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的莖環(huán)引物為以下22種莖環(huán)引物中的至少一種: (1)針對(duì)hsa-miR-10a-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.1所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCACAAA-3’ ； (2)針對(duì)hsa-miR-16-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.2所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCGCCAAT-3’ ； (3)針對(duì)hsa-miR-18a-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.3所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCTATCT-3’ ； (4)針對(duì)hsa-miR-21-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.4所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCAACA-3’ ； (5)針對(duì)hsa-miR-22-3p基因的核苷酸序列如SEQID N0.5所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACAGTT-3’ ； (6)針對(duì)hsa-miR-25-3p基因的核苷酸序列如SEQID N0.6所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCAGAC-3’ ； (7)針對(duì)hsa-miR-31-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.7所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCTAT-3’ ； (8)針對(duì)hsa-miR-100-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.8所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCACAAG-3’ ； (9)針對(duì)hsa-miR-107基因的核苷酸序列如SEQID N0.9所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTGATAG-3’ ； (10)針對(duì)hsa-miR-127-3p基因的核苷酸序列如SEQID N0.10所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCCAA-3’ ； (11)針對(duì)hsa-miR-129-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.11所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACGCAAGC-3’ ； (12)針對(duì)hsa-miR-148b-3p基因的核苷酸序列如SEQID N0.12所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACAAAG-3’ ； (13)針對(duì)hsa-miR-155-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.13所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACCCCT-3’ ； (14)針對(duì)hsa-miR-194-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.14所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCCACA-3’ ； (15)針對(duì)hsa-miR-200c-3p基因的核苷酸序列如SEQID N0.15所示的莖環(huán)引物；5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCCATC-3’ ； (16)針對(duì)hsa-miR-223-3p基因的核苷酸序列如SEQID N0.16所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTGGGGT-3’ ； (17)針對(duì)hsa-miR-337-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.17所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAACTCC-3’ ； (18)針對(duì)hsa-miR-375基因的核苷酸序列如SEQID N0.18所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCACGC-3’ ； (19)針對(duì)hsa-miR-483-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.19所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCTCCCT-3’ ； (20)針對(duì)hsa-miR-548k基因的核苷酸序列如SEQID N0.20所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCAAA-3’ ； (21)針對(duì)hsa-miR-1246基因的核苷酸序列如SEQID N0.21所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCCTGCT-3’ ； (22)針對(duì)hsa-miR-1322基因的核苷酸序列如SEQID N0.22所示的莖環(huán)引物:5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCAGCAT-3’。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的試劑盒，其特征在于:所述的 hsa-miR-10a_5p 基因、hsa-miR-18a_5p 基因、hsa-miR-21_5p 基因、hsa-miR-22_3p 基因、hsa-miR-25_3p 基因、hsa-miR-31_5p 基因、hsa-miR-100_5p 基因、hsa-miR-127_3p 基因、hsa-miR-148b_3p 基因、hsa-miR-194_5p 基因、hsa-miR-200c_3p基因、hsa-miR-223_3p 基因、hsa-miR-337_5p 基因、hsa-miR-483_5p 基因、hsa_miR-548k基因、hsa-miR-1246基因和hsa-miR-1322基因?yàn)樯险{(diào)基因，hsa-miR-107基因、hsa-miR-129-5p 基因、hsa-miR-155_5p 基因和 hsa-miR-375 基因?yàn)橄抡{(diào)基因，has-miR-16-5p基因?yàn)閮?nèi)參基因。3.—種權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的試劑盒的使用方法，其特征在于包括如下步驟: (O提取待檢測(cè)血清樣本的總RNA，使用微量分光光度計(jì)測(cè)量RNA的濃度和純度； (2)用待測(cè)莖環(huán)引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為20μ L，將上述混合液于.42°C反應(yīng) 50min，70°C加熱 15min 反轉(zhuǎn)錄 RNA 為 cDNA ； (3)用正向引物和通用引物添加qPCR體系為15yL; (4)qPCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性階段，溫度為95°C，時(shí)間為5min ;循環(huán)反應(yīng)階段，變性溫度為95°C，時(shí)間為10s，退火溫度為60°C，時(shí)間為34s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線階段，變性溫度.950C，時(shí)間15s，退火溫度600C，時(shí)間60s，變性溫度95°C，時(shí)間15s。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的試劑盒的使用方法，其特征在于步驟(I)的具體過(guò)程為:將新鮮收集到的血液在37°C恒溫水浴鍋中溫浴.20min ;室溫3000rpm離心5min，取上清，去沉淀；在4°C、12000rpm離心lOmin，去除沉淀，分裝上清，存儲(chǔ)在_80°C;取出樣品，待樣品溶解后，于4°C將12000g離心lOmin，留上清；取.100 μ L血清，加入300 μ L RNase-free水，渦旋混勻；加入400 μ L TRIzol，震蕩混勻，室溫放置5min，于4°C將12000g離心lOmin，去除沉淀；每ImL的TRIzol試劑加入0.2mL氯仿，渦旋15s，室溫放置2-3min，于4°C將12000g離心15min，取上清；每ImL TRIzol試劑加入.0.5mL異丙醇，充分混勾，室溫放置lOmin，于4°C將12000g離心15min，去上清；加入ImL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，渦旋混勻，于4°C將7500g離心5min，留沉淀，并干燥RNA沉淀；加入.20 μ L RNase-free 水溶解 RNA，并且在 55_60°C溫浴 15min。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的試劑盒，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案要點(diǎn)為：一種用于檢測(cè)食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的試劑盒，包含有用于診斷食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的莖環(huán)引物與RNase-free水配制的檢測(cè)試劑。本發(fā)明還公開(kāi)了該用于檢測(cè)食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的試劑盒的使用方法。本發(fā)明直接采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）技術(shù)對(duì)血清中多種與食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因進(jìn)行檢測(cè)，可通過(guò)該方法實(shí)現(xiàn)微創(chuàng)早期食管鱗癌的診斷、大規(guī)模篩查和預(yù)后評(píng)估。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN105176983
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】王林嵩, 李迎迎, 王麗, 葉賢龍, 袁園園, 常衛(wèi)東, 王曦?zé)? 趙盼盼
【申請(qǐng)人】河南師范大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年9月23日