一種核酸分子、載體及其在提高綠僵菌產(chǎn)孢速度、產(chǎn)孢量和孢子抗紫外能力的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種核酸分子、載體，可用于提高綠僵菌產(chǎn)孢 速度、產(chǎn)孢量和孢子抗紫外能力。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因敲除是通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位 點(diǎn)，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術(shù)。它克服了隨機(jī)整合的盲目 性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。這項(xiàng)技術(shù)的誕生可以說是分 子生物學(xué)技術(shù)上繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)后的又一革命，使得對(duì)基因靶位時(shí)間和空間上的操作更加明 確、效果更加精確、可靠。
[0003] 真菌是昆蟲的主要病原微生物，數(shù)量達(dá)1000種以上。昆蟲病原真菌通過體壁侵 染昆蟲，幾乎所有昆蟲都會(huì)受病原真菌侵染，在適宜的條件下昆蟲病死后真菌會(huì)產(chǎn)生大量 孢子，在昆蟲種群中形成流行病。因此，昆蟲病原真菌在害蟲防治中潛力巨大。綠僵菌、白 僵菌作為微生物殺蟲劑最具發(fā)展?jié)摿Γ褢?yīng)用于蝗蟲、玉米螟、松毛蟲等重要農(nóng)林害蟲的防 治。然而，真菌殺蟲劑生產(chǎn)成本高、防效不穩(wěn)定，極大地制約了其應(yīng)用。真菌殺蟲劑的生產(chǎn) 成本主要受其產(chǎn)孢時(shí)間和產(chǎn)孢量的影響；防效不穩(wěn)定主要是由于紫外照射、高溫等逆境影 響真菌孢子的存活率，因而降低了殺蟲效率。因此，選育能夠產(chǎn)孢快、產(chǎn)孢量高、孢子抗抗紫 外的菌株對(duì)于真菌殺蟲劑都具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種核酸分子，可用于制備蘇氨酸/絲氨酸蛋白磷酸酶基因 缺失菌株，提高綠僵菌產(chǎn)孢速度、產(chǎn)孢量和孢子抗紫外能力。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下措施實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種核酸分子，含有綠僵菌蘇氨酸/絲氨酸蛋白磷酸酶基因（Ser/Thr Phosphatase 5，PP5)的Y端延伸片段和Y端延伸片段。所述Y端延伸片段為蘇氨酸/ 絲氨酸蛋白磷酸酶基因上游的Ser/Thr右臂（Ser/Thr right arm)，3^端延伸片段為蘇氨 酸/絲氨酸蛋白磷酸酶基因下游的Ser/Thr左臂（Ser/Thr left arm)。優(yōu)選地，所述5' 端延伸片段如SEQ ID NO. 2所示；3'端延伸片段如SEQ ID NO. 3所示。
[0007] 本發(fā)明可用于制備蘇氨酸/絲氨酸蛋白磷酸酶基因缺失菌。優(yōu)選為綠僵菌，能夠 提高綠僵菌產(chǎn)孢速度、產(chǎn)孢量和抗紫外能力。
[0008] -種載體，含有上述核酸分子。上述載體含有Bar基因，Ser/Thr右臂和Ser/Thr 左臂分別位于Bar基因 Y端和:V端。
[0009] 上述載體的結(jié)構(gòu)如圖4所示。所述載體的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0010] 上述核酸分子、載體在敲除綠僵菌的蘇氨酸/絲氨酸蛋白磷酸酶基因中的應(yīng)用。
[0011] 上述核酸分子、載體在培育產(chǎn)孢快、產(chǎn)孢量高和抗紫外的綠僵菌菌株A PP5中的 應(yīng)用。具體地，將含有上述核酸分子的載體電擊轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，然后將農(nóng)桿菌和綠僵菌共培 養(yǎng)，經(jīng)過抗性培養(yǎng)基的篩選而獲得具有產(chǎn)孢快、產(chǎn)孢量高和抗紫外的綠僵菌菌株A PP5。
[0012] 上述綠僵菌菌株ΔΡΡ5及其孢子在防治有害昆蟲中的應(yīng)用。優(yōu)選地，將ΔΡΡ5孢 子配制成石蠟油懸浮液，菌懸液制劑用于防治有害昆蟲。優(yōu)選地，上述懸浮液是將A PP5成 熟的孢子用石蠟油配制成I X IO7個(gè)/mL。
[0013] 上述昆蟲優(yōu)選為蝗蟲。
[0014] 有益效果
[0015] 1.本發(fā)明根據(jù)基因重組的原理敲除昆蟲病原真菌綠僵菌（Metarhizium acridum) 的蘇氨酸/絲氨酸蛋白磷酸酶基因（PP5)，獲得了敲除菌株APP5(ASer/Thr Phosphatase 5)，是一種快速、準(zhǔn)確、定向選育昆蟲病原真菌工程菌株的技術(shù)方法，獲得的敲除菌株（工 程菌株）ΔΡΡ5具有廣泛的應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值。敲除昆蟲病原真菌綠僵菌PP5后的工程 菌株ΔΡΡ5在害蟲的防治上具有以下優(yōu)勢(shì)：1)產(chǎn)孢快；2)產(chǎn)孢量高；3)孢子抗紫外能力增 強(qiáng)；4)孢子的殺蟲毒力和耐熱性無顯著變化。因此，可極大地降低真菌殺蟲劑生產(chǎn)成本、提 尚其防效的穩(wěn)定性。
[0016] 2.本發(fā)明獲得了產(chǎn)孢快、產(chǎn)孢量高的農(nóng)業(yè)害蟲防治工程菌株ΔΡΡ5達(dá)到最大產(chǎn)孢 量的時(shí)間比野生型菌株縮短3天；產(chǎn)孢量比野生型菌株高，在第9天時(shí)的最大產(chǎn)孢量是野生 菌株的2. 2倍。因此，在工業(yè)生產(chǎn)時(shí)相同的生產(chǎn)時(shí)間和原料會(huì)獲得比野生型菌株高2. 0倍 以上的經(jīng)濟(jì)效益。
[0017] 3.本發(fā)明獲得的菌株對(duì)紫外照射具有較強(qiáng)的抗性，獲得的工程菌株APP5UVLD5。 =6. 64h，野生型菌株的UVLD5q= 4. 52h。工程菌株Δ PP5抗紫外能力強(qiáng)，能夠更好地適應(yīng) 有紫外輻射的田間環(huán)境，延長(zhǎng)其孢子的存活時(shí)間，提高防效的穩(wěn)定性。
[0018] 4.本發(fā)明獲得的工程菌株ΔΡΡ5與野生型菌株相比，其毒力和耐熱性無顯著變 化，故本發(fā)明所獲得的工程菌株A PP5更適合工業(yè)生產(chǎn)和田間害蟲防治。
【附圖說明】
[0019] 圖1與野生型菌株和回復(fù)菌株相比，工程菌株ΔΡΡ5產(chǎn)孢時(shí)間和數(shù)量的情況。WT 代表野生型菌株，ΔΡΡ5代表本發(fā)明的工程菌株ΔΡΡ5, CP是回復(fù)菌株。
[0020] 圖2與野生型菌株和回復(fù)菌株相比，工程菌株ΔΡΡ5抗紫外能力的比較。WT代表 野生型菌株，ΔΡΡ5代表本發(fā)明的工程菌株ΔΡΡ5, CP是回復(fù)菌株。
[0021] 圖3與野生型菌株和回復(fù)菌株相比，工程菌株Δ PP5抗?jié)駸岷投玖Φ那闆r分析。WT 代表野生型菌株，ΔΡΡ5代表本發(fā)明的工程菌株ΔΡΡ5, CP是回復(fù)菌株。
[0022] 圖4載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023] 圖5菌株Δ PP5絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶基因被徹底敲除的PCR電泳驗(yàn)證圖。WT代 表野生型菌株，ΔΡΡ5代表本發(fā)明的工程菌株ΔΡΡ5, CP是回復(fù)菌株。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅限于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0025] 實(shí)施例1敲除絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶基因載體和工程菌株Δ PP5的獲得
[0026] I、綠僵菌絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶基因的獲得
[0027] 1)綠僵菌絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶基因如SEQ ID NO. 1所示。
[0028] 2)設(shè)計(jì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶基因的3'端延伸片段為Ser/Thr左臂（序列如 SEQ ID NO. 3)和Y端延伸片段為Ser/Thr右臂（序列如SEQ ID NO. 2)。
[0029] 3)基于獲得的左右臂序列設(shè)計(jì)引物。
[0030] 左臂引物F :
[0031] CGACGGCCAGTGCCAAGCTTGTGCTGGT