山核桃miR171d在延遲植物花期或植物葉片發(fā)育中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因功能領(lǐng)域，更具體地涉及山核桃miR171d在延遲植物花期或植物 葉片發(fā)育中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] MicroRNA(miRNA)是一類廣泛存在于動(dòng)植物中，含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體，經(jīng)過 Dicer加工之后的一類非編碼的小RNA分子（18-25個(gè)核苷酸）。miRNA通過在轉(zhuǎn)錄水平或 者轉(zhuǎn)錄后水平對基因組上的靶基因抑制其翻譯或者切割靶基因來調(diào)控基因表達(dá)，在基因表 達(dá)中起負(fù)調(diào)控其靶基因作用。miRNA在植物從成花誘導(dǎo)到花器官特征屬性形成的整個(gè)花發(fā) 育過程均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
[0003] 山核桃（Carya cathayensis Sarg.)屬胡桃科山核桃屬植物，雌雄同株，主要分布 于浙江西部地區(qū)以及安徽地區(qū)，是我國特有的名優(yōu)干果和木本油料樹種，是山區(qū)農(nóng)民脫貧 致富的重要途徑；然而，山核桃從種子播種到結(jié)果需要10余年的時(shí)間，從而較大程度抑制 了山核桃的產(chǎn)量，如何縮短童期促進(jìn)早實(shí)是山核桃研究者亟待解決的難題。
[0004] 模式植物miR171d的相關(guān)功能研究很早就有報(bào)道。2002年David P. Bartel等從擬 南芥幼苗和花中分別克隆了大量的小RNAs，Nor them分析發(fā)現(xiàn)ath-mi Rl 71 d在花中表達(dá)量 較高；2002年James C. Carrington等的研究發(fā)現(xiàn)，miR171d在擬南芥、水稻和煙草的花中積 累量相對比較高，而在葉和莖桿中表達(dá)量較少或不能被檢測到；2005年Vincent L Chiang 等發(fā)現(xiàn)miR171d在毛果楊莖桿中特異表達(dá)，可能參與了木質(zhì)組織的形成，木質(zhì)組織機(jī)械損 傷脅迫導(dǎo)致ptr-miR171d下降；miR171d在小麥的各種組織中都有表達(dá)，特別是根中相對較 高（孫其信，2007) ;2009年薛紅衛(wèi)等對水稻miRNA做了表達(dá)譜分析，得出osa-miR171dg/h 在水稻根中選擇性優(yōu)先表達(dá)?？梢妋iR171d在不同植物的各個(gè)組織中表達(dá)及功能是有差異 的。山核桃miR171d的功能作用尚未知曉。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了山核桃miR171d在延遲植物花期或植物葉片發(fā)育中的應(yīng)用。
[0006] 山核桃miR171d在延遲植物花期或植物葉片發(fā)育中的應(yīng)用，所述山核桃miR171d 的喊基序列如SEQ ID NO. 1所不。
[0007] 優(yōu)選地，所述植物是擬南芥或煙草。
[0008] 優(yōu)選地，所述植物是擬南芥。
[0009] 獲得山核桃miR171d轉(zhuǎn)基因植株的具體方法包括：將包含所述山核桃miR171d的 前體基因連接到載體上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到擬南芥、篩選、培養(yǎng)和獲得轉(zhuǎn)基因株系。 [0010] 由于山核桃成熟miR171d本身序列很短，只有21bp，而其前體序列相對較長，連接 到載體上，有利于轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選地，所述前體基因的堿基序列如SEQIDN0. 2所示。
[0011] 本發(fā)明提供了山核桃miR171d在延遲植物花期或植物葉片發(fā)育中的應(yīng)用。應(yīng)用山 核桃miR171d，有望人為地調(diào)控植物的花期或葉片發(fā)育，具體地，有望人為地調(diào)控山核桃的 花期或葉片發(fā)育。
【附圖說明】
[0012] 圖1為山核桃花芽的總RNA
[0013] 圖2為山核桃miR171d前體的中間載體菌液PCR檢測
[0014] 圖3為山核桃miR171d前體的表達(dá)載體菌液PCR檢測
[0015] 圖4為山核桃miR171d轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗性篩選
[0016] 圖5為山核桃miR171d轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測
[0017] 圖6為野生型、擬南芥miR171d突變體和山核桃miR171d轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片數(shù) 目統(tǒng)計(jì)
[0018] 圖7為觀察到的野生型、擬南芥miR171d突變體和山核桃miR171d轉(zhuǎn)基因擬南芥 葉片的表型
[0019] 圖8為觀察到的野生型、擬南芥miR171d突變體和山核桃miR171d轉(zhuǎn)基因擬南芥 的表型
【具體實(shí)施方式】
[0020] 1.材料
[0021] 1.1實(shí)驗(yàn)材料
[0022] 山核桃花芽采自浙江省杭州市臨安板橋村，選取不同株山核桃樹進(jìn)行采樣。樣品 采下后立即液氮保存，帶回實(shí)驗(yàn)室并放置在-80°C冰箱保存待用。另外，購買轉(zhuǎn)了擬南芥 miR171d的擬南芥突變體種子（購于美國ABRC)。
[0023] L 2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
[0024] DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Marker和TRIzol試劑均購自寶生物 工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程股份 有限公司。PCR儀為美國PE9700PCR儀，超凈工作臺購自蘇州誠凈凈化科技有限公司。
[0025] 1.3引物合成及測序
[0026] 引物合成及測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
[0027] 2.方法
[0028] 2. 1山核桃花芽總RNA的提取
[0029] 采用改良CTAB+Trizol法提取花芽樣品總RNA，步驟如下：
[0030] (1)在IOmL離心管中加入3mL 65°C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液（10% CTAB，10% PVP40，1.0M Tris-HCl(pH 8. 0)，5M NaCl，0.6M EDTA (ρΗ8·0))，加入 200 μLβ-巰基乙醇；
[0031] (2)取-70°C保存的花芽2g，放入液氮充分預(yù)冷的研缽中，于液氮中充分研磨至百 色粉末；
[0032] (3)將白色粉末迅速轉(zhuǎn)入預(yù)熱的提取液中，立即充分振蕩混勻，65°C水浴30min， 期間振蕩3-4次；
[0033] (4)在混合物中加入等體積的25:24:1 (酸性飽和酚：氯仿：異戊醇），約3ml。混 合均勾后HOOOrpm離心10min (常溫）；
[0034] (5)取上清轉(zhuǎn)入新的IOml離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1)上下顛倒 混勾，12000rpm4°C離心10min后取上清；
[0035] (6)重復(fù)步驟4 一次，直至中間層消失；
[0036] (7)上清轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇后放置于_20°C冰箱冷凍 30min。12000rpm4°C離心10min棄掉上清，沉淀加入65°C預(yù)熱好的SSTE400 yL溶液至全 溶；
[0037] (8)溶液中加入ImLTRIzol試劑，室溫靜置5min。再加入200 μ L氯仿?lián)u勻，室溫 靜置 2_3min ;
[0038] (9) 4? 12000rpm 離心 15min ;
[0039] (10)吸取上清，加入等體積異丙醇，室溫靜置IOmin ;
[0040] (11) 4°C 12000rpm離心10min，棄掉上清，肉眼可見RNA沉于管底；
[0041] (12)加入ImL預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀，溫和振蕩，8000rpm4°C離心5min，棄掉上 清；
[0042] (13)重復(fù)步驟11，并將沉淀真空干燥7-10min ;加入適量DEPC水溶解沉淀，-80°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0043] 2. 2cDNA 合成
[0044] 使用 TAKARA試劑盒Prime ScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，詳細(xì)內(nèi) 容如下：
[0045] (1)在經(jīng)過DEPC處理過的PCR管中配置下列反應(yīng)體系：
[0047] (2) 65 °C保溫5min，冰上迅速冷卻。（模板RNA變性）
[0048] (3)再次配置反應(yīng)體系如下：
[0050] (4)緩慢搖勻。
[0051] (5) 42 °C 反應(yīng) 30-60min。
[0052] (6) 95°C 5min酶失活后，冰上冷卻。
[0053] 2. 3前體序列的引物設(shè)計(jì)
[0054] 依據(jù)前體序列：CTTCAGCTATCACTGCATGGTATTTTTCTTTCAACCTAGCTAGCTTCTTGTTGATT TCTTCTTTTTATCATCGAGTCTTTTTACTTTGATCCTCCGAAATATATGTAGCTTTTGCATATATATATATATGTTC CTTCATGGCCGTGTTCATGATCATTGGGAATACGTGCAAGAAGATCAGGGATTCCAGGAGTATACATATGTGAAATA GCTACTTTGATATTGGCCTGGTTCACTCAGACGAAAAACAAAGCAGTCAATGGGGAGTGTACGTCACTAGCTTTTCT TTTCTTTTCTAATTTGATTGAGCCGTGCCAATATCTCAGTGCTCTTTCATTTCTTCCGGACTCTCATCACTACAATA CTTGAGGCCGAGATCAACATACCAATCAAAACGTTTGATAATTTATCTTCGATAATGGGAAAATTAGTTTCATTATA TATGCGTTGTGGGCTTCATTTGTTATTAATCTCATGCAGTTTTTCTATTTGATTATTCATGAGTTCTCATGCAGCAA AGAAGGTGCTGCTTTTGGCTTCAGC，使用Primer Primer 5. 0設(shè)計(jì)引物，引物兩端分別加上酶切 位點(diǎn) KpnI 和 Xbal，正向引物：5' -GGGGTACCGCTAGCTTCTTGTTGATTTC-3'，反向引物：5' -GCT CTAGATAATAACAAATGAAGCCCAC-3' 克隆所需序列。
[0055] 2. 4PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0056] 以山核桃cDNA為模板擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：
[0058] PCR 反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin。 30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸lOmin。PCR反應(yīng)完成后4°C暫時(shí)保存，其中退火溫度可根據(jù)Tm值進(jìn) 行調(diào)整。
[0059] 2. 5瓊脂糖凝膠電泳檢測與膠回收
[0060] 將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為TAE(40mM Tris-乙酸鹽， ImM EDTA)，核酸燃料為EB。紫外光檢測電泳結(jié)果并回收PCR產(chǎn)物。利用上海生工公司的 DNA膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，具體步驟如下：
[0061] (1)通過瓊脂糖凝膠電泳盡可能將目的DNA片段與其他片段分開，用干凈的手術(shù) 刀片將含有目的DNA的瓊脂糖凝膠塊切下，放入I. 5mL離心管中。每個(gè)膠塊盡量不要超過 400mg，否則將會導(dǎo)致溶膠不完全。另外切膠過程應(yīng)盡可能快，從而減少DNA在紫外線中暴 露時(shí)間來降低對DNA的損傷。
[0062] (2)根據(jù)膠塊的質(zhì)量和濃度，每IOOmg瓊脂糖加300~600 μ L的比例加