大豆GmSAMS1基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及大豆GmSAMSl基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，然而蟲(chóng)害嚴(yán)重危害了大豆產(chǎn)量和品質(zhì)?；瘜W(xué)殺蟲(chóng)劑 的使用產(chǎn)生一系列的副作用，包括污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，增加生產(chǎn)成本等。通過(guò)轉(zhuǎn)基因 技術(shù)培育抗蟲(chóng)品種是一種經(jīng)濟(jì)、有效、快捷的方法。目前，用于抗蟲(chóng)研究的基因大多是外源 基因，如Bt基因，但是轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的安全性還備受爭(zhēng)議，所以研究和利用大豆內(nèi) 源抗性基因具有重要意義。
[0003] 植物的誘導(dǎo)抗性是植物抗性的特性之一，指植物在各種誘導(dǎo)物刺激后產(chǎn)生的抗 性。這種抗性在誘導(dǎo)前不存在或表達(dá)水平很低，經(jīng)誘導(dǎo)物刺激后產(chǎn)生一系列防衛(wèi)反應(yīng)，使 抗性表達(dá)或抗性水平增強(qiáng)。大豆經(jīng)斜紋夜蛾誘導(dǎo)處理后，可對(duì)后來(lái)的斜紋夜蛾產(chǎn)生抗性， 對(duì)大豆葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase, SAMS)在斜紋夜蛾誘導(dǎo)后表達(dá)發(fā)生變化。SAMS作為甲硫氨酸循環(huán)中的一個(gè)關(guān) 鍵酶，可催化甲硫氨酸和ATP生成S-腺苷甲硫氨酸（SAM)。SAM是多胺及乙烯合成的前體 和植物體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)的主要甲基供體，并且是植物生物堿合成過(guò)程中甲基化反應(yīng)的唯一 甲基供體。多胺是生物體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的次生物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、控制形態(tài)建 成對(duì)提高植物抗逆性、延緩衰老等方面具有重要作用。乙烯作為植物激素，參與植物的抗病 蟲(chóng)反應(yīng)，對(duì)提高作物抗性有重要作用。SAMS基因可受高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫誘導(dǎo)而 大量表達(dá)，在煙草中過(guò)量表達(dá)可提高煙草的抗低溫、干旱和耐鹽能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一個(gè)大豆SAMS酶的編碼基因 GmSAMSl。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供該基因在植物抗蟲(chóng)性狀改造中的基因工程應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明提供的基因命名為GmSAMSl，來(lái)自大豆品種南農(nóng)99-10,核苷酸序列為SEQ ID NO. 1 〇
[0008] 本發(fā)明所述的大豆GmSAMSl基因編碼是蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
[0009] 含有本發(fā)明所述的大豆GmSAMSl基因的表達(dá)載體。
[0010] 所述的表達(dá)載體優(yōu)選將SEQ ID NO. 1所示的大豆SAMS酶編碼基因 GmSAMSl利用 gateway技術(shù)插入植物表達(dá)載體pMDC83得到的植物過(guò)量表達(dá)載體pMDC83-GmSAMSl。
[0011] 使用已構(gòu)建的植物表達(dá)載體時(shí)，在GmSAMSl其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種 增強(qiáng)型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì) 所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因（GUS基因、螢光素 酶基因等）或抗生素標(biāo)記物（慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物、潮霉素標(biāo)記物等）的抗性 基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植 株。
[0012] 含有所述大豆SAMS酶編碼基因 GmSAMSl的工程菌。
[0013] 所述的工程菌優(yōu)選將所述的大豆SAMS酶編碼基因 GmSAMSl轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌 EHA105 所得。
[0014] 擴(kuò)增所述大豆SAMS酶編碼基因 GmSAMSl的引物，正向引物序列為SEQ ID NO. 3,反 向引物序列為SEQ ID NO. 4。
[0015] 所述的大豆SAMS酶編碼基因 GmSAMSl在培育抗蟲(chóng)植物中的應(yīng)用。
[0016] 所述的含有本發(fā)明所述的大豆GmSAMSl基因的表達(dá)載體在培育抗蟲(chóng)植物中的應(yīng) 用。
[0017] 攜帶有本發(fā)明GmSAMSl的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ri質(zhì)粒、Ti質(zhì)粒、植物病毒 載體、顯微注射、直接DNA轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、電導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織， 并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株，可獲得抗蟲(chóng)性提高的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。被轉(zhuǎn) 化的植物宿主既可以是玉米、水稻、小麥等單子葉植物，也可以是煙草、大豆、苜蓿、黃瓜、番 茄、楊樹(shù)、草坪草等雙子葉植物。
[0018] 有益效果
[0019] 本發(fā)明從大豆基因組中克隆得到一個(gè)大豆SAMS酶的編碼基因 GmSAMSl。并驗(yàn)證 了該基因的功能。利用植物表達(dá)載體，將本發(fā)明的GmSAMSl基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得抗蟲(chóng) 轉(zhuǎn)基因植株。過(guò)量表達(dá)本發(fā)明GmSAMSl基因的煙草與空載煙草相比，其抗蟲(chóng)性顯著提高，說(shuō) 明GmSAMSl基因在提高植物抗蟲(chóng)性方面起著重要作用。本發(fā)明的GmSAMSl對(duì)培育抗蟲(chóng)農(nóng)作 物，減少蟲(chóng)害對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量的影響特別是對(duì)大豆產(chǎn)量的影響具有重要意義。且GmSAMSl來(lái) 自于大豆，對(duì)于培育安全的具有抗蟲(chóng)性的轉(zhuǎn)基因大豆也具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖I pMDC83的質(zhì)粒圖譜。
[0021] 圖2 GmSAMSl的亞細(xì)胞定位研究。
[0022] 將35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GmSAMSl-GFP融合基因在洋蔥表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表 達(dá)，結(jié)果表明GmSAMSl定位于細(xì)胞膜上。A-C :35S :GFP(陰性對(duì)照）在細(xì)胞中的定位； D-F =GmSAMSl: GFP在細(xì)胞中的定位；A和D :紫外光下洋蔥表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)（35S :GFP和 GmSAMSl :GFP) ;B和E :可見(jiàn)光下洋蔥表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)（35S :GFP和GmSAMSl :GFP) ;C :A與B的 融合圖；F :C與D的融合圖。
[0023] 圖3含有GmSAMSl的植物表達(dá)載體的部分結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024] 圖4轉(zhuǎn)基因煙草PCR鑒定電泳圖。CK1-5 :組培野生型煙草DNA為模板（對(duì)照）； 泳道1-10 :以各個(gè)轉(zhuǎn)pMDC83-GmSAMSl基因的煙草植株DNA為模板。
[0025] 圖5轉(zhuǎn)GmSAMSl煙草株系與對(duì)照煙草的葉片對(duì)斜紋夜蛾進(jìn)行雙向選擇飼喂，12小 時(shí)后評(píng)價(jià)其偏向性因子。A :轉(zhuǎn)基因煙草（TO)及對(duì)照葉面（CK)損失情況；B :偏向性因子PI ; ** :Ρ〈0· 01。
[0026] 圖6轉(zhuǎn)GmSAMSl煙草株系與對(duì)照煙草的葉片對(duì)斜紋夜蛾進(jìn)行強(qiáng)迫飼喂試驗(yàn)，24小 時(shí)后計(jì)算其相對(duì)生長(zhǎng)率。A :喂養(yǎng)斜紋夜蛾后對(duì)照煙草（CK)和轉(zhuǎn)基因煙草（TO)的葉面損失 比較；B :喂養(yǎng)對(duì)照煙草（CK)和轉(zhuǎn)基因煙草（TO)后斜紋夜蛾的生長(zhǎng)情況；C :強(qiáng)迫喂養(yǎng)對(duì)照 (CK)和轉(zhuǎn)基因煙草（TO)的斜紋夜蛾相對(duì)生長(zhǎng)率的比較；** :P〈0. 01。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0028] 下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0029] 實(shí)施例1大豆GmSAMSl基因的克隆與鑒定
[0030] 實(shí)驗(yàn)材料為栽培大豆品種"南農(nóng)99-10"，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心種質(zhì) 資源研究室提供，材料種植于網(wǎng)室，常規(guī)田間管理。
[0031] 參照芥菜SAMS酶基因（GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)為AAG17666)的序列信息和 大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. phytozome. net/soybean)，利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行分 析，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行大豆SAMS酶基因 GmSAMSl的克隆。具體方法如下：
[0032] GmSAMS 1 基因 ORF 正向引物 PI: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCTACAGAAGTTAAA ATGGCCCAAGAAACT (下劃線為 attB 接頭）（SEQ ID NO. 3)
[0033] GmSAMS 1 基因 ORF 反向引物 P2: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGAGCAGGTACCTTC TCCCCCTT (下劃線為 attB 接頭）（SEQ ID NO. 4);
[0034] 取大豆材料"南農(nóng)99-10"嫩葉片，置于液氮中研碎，植物DNA的提取采用CTAB法， RNA提取依據(jù)TIANGEN總RNA提取試劑盒RNA Plant Extraction kit DP417進(jìn)行。cDNA第一 鏈合成依據(jù)TaKaRa試劑公司cDNA第一鏈合成試劑盒TaKaR a PrimeScript? 1st strand cDNA Synthesis Kit D6110A，具體詳見(jiàn)操作說(shuō)明。以得到的DNA和cDNA為模