抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域中的載體及其應(yīng)用，特別是涉及一種攜帶人乳頭瘤病毒16 型（Human Papillomavirus Type 16, HPV-16)突變型ETni9Jjt原基因的重組腺相關(guān)病毒載 體（rAAV)及其構(gòu)建方法與其在制備抗HPV-16感染及其相關(guān)疾病治療藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺相關(guān)病毒（AAV)的基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)被鑒定。1983年，Samulski等人描述了 AAV 的末端重復(fù)片段（上游5'端片段，下游3'端片段）（Samulski RJ, Srivastava A, Berns KIjMuzyczka N. Rescue of adeno-associated virus from recombinant plasmids: gene correction within the terminal repeats of AAV. Cell. 33:135-143.)〇 1984 年， Hermonat等人描述了 AAV的低感染顆粒（Lip)基因和包膜（Cap)基因 （Hermonat PL，Labow MAj Wright R，Berns KIj Muzyczka N. Genetics of adeno-associated virus:isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2mutants. J Virol. 51:329-339. Hermonat,P. L. , and Muzyczkaj N.Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector:transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81:6466-6470.) 〇 1986年，Labow等人鑒定了位于上游5'端片段和復(fù)制蛋白（Rep)基因之間的p5啟動子 (Labow MA, Hermonat PL, Berns ΚΙ. Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type 2 genome. J Virol. 160:251-258. )〇
[0003] AAV是一種非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒（如腺病毒）的基因產(chǎn)物輔 助，才能裝配成為具有感染性的病毒顆粒。AAV基因組全長約4700堿基對（bp)，兩端為 重復(fù)末端片段（TR)，中間為病毒的結(jié)構(gòu)基因，包括與病毒復(fù)制有關(guān)的Rep基因和病毒包 膜（Cap)基因。由于存在AAV病毒自身的不穩(wěn)定性及其攜帶外源性基因（治療基因）長 度有限等方面的缺陷，因此有必要對其進(jìn)行基因重組形成重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV)。現(xiàn)有大量研究表明，將AAV基因組中的結(jié)構(gòu)基因刪除，可 明顯增加外源性基因的容量。此外，將具有治療作用的外源性基因插入rAAV中，可制備成 具有感染性的rAAV病毒顆粒。
[0004] 1984年，美國Paul L. Hermonat率先證明AAV載體可用于人類疾病的基因治療 (Hermonat, P. L. , and Muzyczka, N. Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector:transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81:6466-6470.)。目前，主要是歐美國家在進(jìn) 行以AAV為基礎(chǔ)的基因治療人類疾病的臨床試驗。據(jù)美國糧食和藥品管理局統(tǒng)計，現(xiàn)有10 余項以AAV為基礎(chǔ)的基因治療臨床試驗正在進(jìn)彳丁，主要是將攜帶治療基因的AAV病毒注入 患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)治療基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。主要針對治療的疾病有帕 金森氏綜合癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血友病、心力衰竭、進(jìn)行性肌萎縮和奧茲海默綜合癥等非腫 瘤性疾病。2012年11月2日歐盟批準(zhǔn)UniQure公司的Glybera產(chǎn)品在歐盟27個成員國使 用，這是西方國家第一個獲批準(zhǔn)的基因治療藥物，它是利用腺相關(guān)病毒I型（AAV-I)攜帶外 源基因用于治療脂蛋白脂酶缺乏遺傳病（LPLD)的基因藥物。
[0005] 人乳頭瘤病毒（HPV)是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬。目前至少 分離出130多種亞型。根據(jù)不同亞型，可分為高危型和低危型。其中對人類危害最大的是 高危型，包括HPV-16、18、30、31、33、35、39與宮頸癌、直腸癌、口腔癌、扁桃體癌等惡性腫瘤 密切相關(guān)。其中99%以上的宮頸癌是由高危型HPV引起的，而半數(shù)以上的宮頸癌是HPV-16 所致。
[0006] HPV屬雙鏈閉環(huán)的小DNA病毒，包含約8000個堿基對。其中包括8個早期開放讀 碼框架（El-E8)、2個晚期讀碼框架和1個非編碼長控區(qū)。在早期開放讀碼框架中，具有致 癌作用的E6和E7基因?qū)?xì)胞生長刺激最為重要，E6、E7編碼的癌蛋白E6、E7蛋白分別與 抑癌基因 P53和Rb結(jié)合，引起細(xì)胞增殖失控，抑癌基因?qū)NA的損傷修復(fù)功能喪失，導(dǎo)致癌 前病變及癌癥的發(fā)生。
[0007] 據(jù)2003-2004年來自美國的國家健康和營養(yǎng)研究課題的一個調(diào)查結(jié)果顯示， 14-59歲女性的HPV總感染率為26. 8 %。中國的HPV感染的流行情況尚未有正式報道，每 年約有20萬以上的宮頸癌新發(fā)現(xiàn)病例，發(fā)病率和死亡率有增加趨勢，且宮頸癌發(fā)病年齡年 輕化，可以推測HPV感染率不樂觀。但目前尚無確切治愈HPV感染的方法，而現(xiàn)階段的HPV 疫苗有可能預(yù)防HPV-16和HPV-18感染，但對于已經(jīng)感染的人群無效。為達(dá)到治愈目的， 最理想的治療是徹底清除受感染的細(xì)胞。而受感染的細(xì)胞均存在HPV-16 E7抗原。因此， HPV-16 E7抗原是細(xì)胞免疫治療非常理想的靶子。但是，HPV-16 E7抗原是一種致癌蛋白， 在宮頸癌等惡性腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮最主要作用之一。因此，在體內(nèi)和體外用野生型HPV-16 E7抗原刺激免疫反應(yīng)的發(fā)生，在安全性方面存在一定風(fēng)險。因此，必須除去野生HPV-16 E7 抗原的致瘤性，消除該風(fēng)險。
[0008] 人樹突狀細(xì)胞（Dedritic Cells，DC)是人體最重要、也是最主要的抗原提呈細(xì)胞。 大量的研究已經(jīng)證明無論在體內(nèi)還是體外，DC細(xì)胞均可誘導(dǎo)或刺激產(chǎn)生具有抗感染和抗腫 瘤的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種攜帶無致病性（即無致瘤性）的人乳頭瘤病毒16型 (HPV-16)突變型E7抗原基因的重組腺相關(guān)病毒（rAAV)載體。
[0010] 本發(fā)明所提供的rAAV載體，是將剔除腺相關(guān)病毒（AAV)結(jié)構(gòu)基因 Rep和Cap并帶 有AAV的p5啟動子、巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV)啟動子、beta肌動蛋白啟動子 和SV40病毒早期啟動子中的任意一個啟動子的AAV載體作為出發(fā)載體，將突變型HPV-16 ETni94抗原基因插入出發(fā)載體中，獲得一種全新的rAAV載體，即攜帶HPV-16 E7 "94抗原基因 的重組腺相關(guān)病毒載體（簡稱aEYni94重組腺相關(guān)病毒載體"或AAV/HPV-16 E7 "94)。
[0011] 所述AAV載體由本專利申請的發(fā)明人成功構(gòu)建，構(gòu)建方法參見中國專利 ZL201110125683. X〇
[0012] 這里，突變型HPV-16 ETni94抗原基因是通過分子生物學(xué)技術(shù)，將野生型HPV-16 E7抗原基因進(jìn)行突變，具體是將HPV-16(美國NCI基因庫：KC935953)的E7抗原蛋白第 94位的半胱氨酸（G)改變?yōu)楦拾彼幔–)，通過將HPV-16 E7基因開放讀碼框nt280 (序列 表中位置，對應(yīng)圖3中nt841)的胸腺嘧啶（T)替換為鳥嘌呤（G)，即將編碼半胱氨酸的 tgt(nt280-282)改變?yōu)榫幋a甘氨酸的ggt，獲得可以表達(dá)無致瘤性的突變型HPV-16 E7抗 原基因，命名為HPV-16 Ε7"94基因，所述HPV-16 ETni94S因的核苷酸序列如圖3和序列表中 序列1所示。
[0013] 由于HPV-16 Ε7η94免疫原性未受影響，可將其插入以上所述腺相關(guān)病毒載體中，該 AAV載體帶有AAV的ρ5啟動子、巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV)啟動子、beta肌動 蛋白啟動子和SV40病毒早期啟動子四種啟動子的一種，將獲得的全新攜帶HPV-16 ETni9JA 原基因的重組腺相關(guān)病毒載體統(tǒng)稱為aETni94重組腺相關(guān)病毒載體"或AAV/HPV-16 E7 "94。
[0014] 利用以上設(shè)計，也可將野生型HPV-16 E7抗原基因插入上述腺相關(guān)病毒載體中，獲 得攜帶野生型HPV-16 E7抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體，統(tǒng)稱為"E7重組腺相關(guān)病毒載 體"或AAV/HPV-16 E7，HPV-16 E7基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。但由于野生 型HPV-16 E7抗原具有致瘤性，故本發(fā)明不推薦用于臨床實(shí)踐，僅用于研究。
[0015] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述AAV/HPV-16 E7和AAV/HPV-16 Ε7"94重組腺相關(guān) 病毒載體的構(gòu)建方法。
[0016] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0017] 1)使用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)方法，先獲得HPV-16 Ε7抗原基因，再將其進(jìn)行突 變，即將E7抗原蛋白的第94位半胱氨酸改變?yōu)楦拾彼?，詳?xì)過程為將HPV-16 E7基因開放 讀碼框（nt271)的胸腺嘧啶（T)替換為鳥嘌呤（G)，即將編碼半胱氨酸的tgt(nt280-282) 改變?yōu)榫幋a甘氨酸的ggt，即獲得無致瘤性的突變型HPV-16 ETni94基因；
[0018] 2)將HPV-16 Ε7"94抗原基因或野生型HPV-16 E7抗原基因插入已將腺相關(guān)病毒結(jié) 構(gòu)基因 R印和Cap剔除的腺相關(guān)病毒載體中，得到攜帶HPV-16 E7"94抗原基因的重組腺相 關(guān)病毒載體（AAV/HPV-16 Ε7"94)或攜帶HPV-16 E7抗原基因的重組腺