一種新穎的鴿子性別鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種采用基因檢測方法鑒定鴿子等鳥類性別的方法，屬于生命科學(xué)領(lǐng) 域。
[0002] 背景介紹
[0003] 鴿子是一種單態(tài)性鳥，無論在幼鳥還是成鳥時期，都很難從外觀形態(tài)或其他行為 上區(qū)分雌雄。鴿子是一夫一妻制，母鴿需要和公鴿配對后才能繁育后代，如果能夠在鴿子出 生后不久就準(zhǔn)確地進(jìn)行性別鑒定，則可以大大提高配對成功率，并且及早淘汰不必要的公 鴿，大大增加其經(jīng)濟效益，因此鴿子的性別鑒定具有重要的意義。
[0004] 鳥類的性別是由染色體決定的，其性別決定方式為ZW型，雄鳥有一對Z染色體，而 雌鳥則是一個Z染色體和一個W染色體。這兩種染色體上都有一個CHD基因，該基因在Z 染色體和W染色體上的序列具有一定差異，分別稱為CHD-Z和CHD-W。由于CHD-Z和CHD-W 基因在非平胸鳥類（現(xiàn)存鳥類中，除了鴕鳥、鴯鹋和幾維鳥等走禽以外，其他都屬于非平胸 鳥類）中存在且具有同源性，因此可以利用該基因在Z染色體上和W染色體上的差異鑒別 絕大多數(shù)的禽類，具有很大的通用性。自1995年開始，CHD基因被廣泛應(yīng)用于鳥類性別的 分子鑒定，CHD基因已經(jīng)成為非平胸鳥類性別鑒定最重要的分子標(biāo)記。
[0005] 傳統(tǒng)做法采用PCR+凝膠電泳，其中最經(jīng)典的P2/P8引物鑒定方法設(shè)計如下：在 CHD-Z和CHD-W保守區(qū)域設(shè)計一對引物（P2/P8)，可以同時擴增CHD-Z和CHD-W基因，但擴增 產(chǎn)物大小不同，CHD-Z的擴增片段是450bp，CHD-W的擴增片段是380bp，不同鳥類片段大小 各有差別。由于不論雌鳥還是雄鳥都會有CHD-Z基因，因此是否檢測到CHD-Z擴增產(chǎn)物可 以作為擴增反應(yīng)是否正常進(jìn)行的參照，避免了將實驗失敗的結(jié)果誤判為雄性；而CHD-W基 因是雌性專有的，只有雌性才可能檢測到CHD-W擴增。擴增結(jié)果可以簡單描述為：凝膠電泳 出現(xiàn)ZW兩條帶的為雌性，只出現(xiàn)Z -條帶的為雄性，這種方法的優(yōu)點是成本較低，在現(xiàn)有鑒 定條件下被廣泛地采用，缺點是操作繁瑣、時間長，而且容易造成污染【參考文獻(xiàn)1】。最近 的研究表明，這兩個片段雖然大小不同，但是熔解曲線溫度是一樣的，無法采用熔解曲線分 析方法來區(qū)分。
[0006] 最近幾年來，有人開始采用實時熒光PCR+熔解曲線分析的方法，重新設(shè)計了引物 和檢測方法，利用CHD-W和CHD-Z擴增產(chǎn)物的熔解溫度（以下簡稱Tm值）不同來區(qū)分ZW 條帶【參考文獻(xiàn)2】。但CHD-Z和CHD-W擴增反應(yīng)是分別在兩個PCR反應(yīng)管中進(jìn)行的，一是 增加了經(jīng)濟成本，實用性較低；二是可能發(fā)生誤判，例如，操作者在Z反應(yīng)管內(nèi)加入樣本，而 W反應(yīng)管則因疏忽或移液器漏氣而未加入樣本，則會造成雌性樣本誤判出雄性結(jié)果。
[0007] 最新報道是在一管內(nèi)用相同的引物擴增CHD-W和CHD-Z，利用擴增片段中Z和W具 有3個SNP，導(dǎo)致的擴增產(chǎn)物的熔解溫度（Tm值）不同來進(jìn)行區(qū)分，由于只采用了一對引物， 且所產(chǎn)生的片段序列和大小非常接近，無法用凝膠電泳區(qū)分【參考文獻(xiàn)3】。這樣的設(shè)計帶來 的問題是：1.沒有熔解曲線分析儀的用戶無法采用；2.由于無法分成兩管單獨擴增CHD-Z 和CHD-W片段，缺乏簡單有效的方法驗證結(jié)果。
[0008] 既能夠在一管內(nèi)同時擴增CHD-Z和CHD-W的特異性片段，又可以在兩管內(nèi)單獨擴 增CHD-Z和CHD-W的特異性片段來驗證結(jié)果，既可以用熔解曲線分析，也可以用凝膠電泳將 這兩個擴增產(chǎn)物清晰地區(qū)分開來的方法，目前還沒有報道。這正是本發(fā)明所解決的問題。 [0009] 參考文獻(xiàn)
[0010] 1.賈曉旭等，利用羽毛對鴿子進(jìn)行分子性別鑒定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2010， 18(5) :1019-1023
[0011] 2. Hurng-ffem Huang 等.High-throughput gender indentification of three Columbidae species using melting curve analysis[J] ；Theriogenology 75(2011)73-79
[0012] 3. Cassandra E. Faux 等，High-throughput real-time PCR and melt curve analysis for sexing Southern Ocean seabirds using fecal samples[J]； Theriogenology 81(2014)870-874

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明提供了兩對特別設(shè)計的CHD-Z和CHD-W的特異性引物，用于鴿子的性別鑒 定，也適用于目的片段和鴿子具有同源性的其他非平胸鳥類的性別鑒定。
[0014] 引物序列如序列表中SEQ ID NO :1-4所示。
[0015] PCR引物擴增的是一對引物之間的一整個片段，通過增加或減少本發(fā)明所公開的 引物序列的5'和3'端的若干個堿基序列（通常< 10個），也可能擴增出本發(fā)明所設(shè)計的 目標(biāo)片段，因此不能通過簡單增加或減少本發(fā)明所公開的引物序列的若干個堿基序列來規(guī) 避本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016] 本發(fā)明提供了一種特別設(shè)計的實驗方法，CHD-Z和CHD-W基因的特異性片段擴增 可以在同一個PCR反應(yīng)管中實現(xiàn)，這2個片段之間的Tm值差異達(dá)到了 3°C左右，使得這兩 個PCR反應(yīng)在同一個管中進(jìn)行而彼此可以很好地區(qū)分；目標(biāo)片段的分子量分別為116bp和 83bp，使得這兩個擴增片段在同一個凝膠電泳通道中彼此可以很好地區(qū)分。
[0017] 本發(fā)明提供的實驗設(shè)計也支持將CHD-Z和CHD-W基因的特異性片段分成兩管擴 增，以在一管反應(yīng)出現(xiàn)問題的時候，可以將兩個反應(yīng)分開進(jìn)行驗證。例如出現(xiàn)非專一性擴增 時。
[0018] 本發(fā)明提供的CHD-Z專一性引物不是鴿子性別鑒定所必須的，使用者也可以僅使 用CHD-W引物進(jìn)行擴增，擴增出結(jié)果者為雌性，擴增不出結(jié)果者為雄性，這種方法在實際使 用時可能因樣本問題造成雌性的漏檢，但仍具有較大的實用價值，例如，只需要在大量鴿子 中挑選幾只雌性鴿子，可采用此法。
[0019] 本發(fā)明的PCR反應(yīng)液可按如下組分配置，濃度可以適當(dāng)調(diào)整：
[0020] CN 105177121 A 說明書 3/7 頁
[0021] 優(yōu)選的，在96孔PCR板中，單個PCR反應(yīng)液配制可參考如下：
[0023] 優(yōu)選的，在384孔PCR板中，PCR反應(yīng)液配制可參考如下：
[0026] 分開兩管時，單個PCR反應(yīng)液配制參考分別如下：
[0027] CN 105177121 A 說明書 4/7 頁
[0028] 上述反應(yīng)體系中，CHD-W和CHD-Z上下游引物（SEQ ID NO :1-4)是通過上海生工 引物合成公司合成，加入PCR反應(yīng)體系時的濃度為2. 5uM.
[0029] qPCR MasterMix采用市售試劑盒，本發(fā)明的實施例是采用江蘇楚天生物科技有限 公司商品試劑，貨號CTB103。主要成分是SYBR染料、ddNTP、鎂離子、熱啟動DNA聚合酶等。
[0030] 樣本DNA是采用市售DNA提取試劑盒提取，使用濃度在0· l-10ug/ml，0D260/280 在1. 7