一種定量檢測(cè)dna雙鏈斷裂碎片數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及DNA雙鏈斷裂碎片數(shù)目的定量分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)DNA 雙鏈斷裂碎片數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法以及標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物體內(nèi)部或外界的多種不利因素如細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物、電離輻射、亞硝銨類致癌 物等均可導(dǎo)致DNA分子斷裂。若DNA發(fā)生雙鏈斷裂，則機(jī)體會(huì)啟動(dòng)同源重組修復(fù)通路或 (和）非同源末端連接修復(fù)通路對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，若不能被有效修復(fù)則會(huì)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂， 累積起來，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的正常生理功能造成影響，甚至導(dǎo)致病變的發(fā)生。因此，定量分析 DNA雙鏈斷裂數(shù)目的多少對(duì)評(píng)估生物遺傳的穩(wěn)定性非常重要。
[0003] 雖然檢測(cè)DNA雙鏈斷裂的方法很多，但大部分方法如流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL法等檢測(cè) 的是DNA單鏈斷裂和DNA雙鏈斷裂的總和，僅有小部分方法檢測(cè)的是DNA雙鏈斷裂。目前 檢測(cè)DNA雙鏈斷裂的方法主要有γ H2AX法、單細(xì)胞凝膠電泳法及脈沖電場(chǎng)凝膠電泳法等。 γ Η2ΑΧ法是利用DNA雙鏈斷裂后，會(huì)形成磷酸化的γ Η2ΑΧ，即γ Η2ΑΧ焦點(diǎn)。焦點(diǎn)數(shù)與DNA 雙鏈斷裂點(diǎn)數(shù)間存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，通過計(jì)數(shù)γ Η2ΑΧ焦點(diǎn)數(shù)可實(shí)現(xiàn)DNA雙鏈斷裂點(diǎn)的定量 分析。但在實(shí)際工作中，計(jì)數(shù)γΗ2ΑΧ焦點(diǎn)數(shù)需在熒光顯微鏡下采用手工方法或借助特定軟 件進(jìn)行，當(dāng)γΗ2ΑΧ焦點(diǎn)數(shù)過多、γΗ2ΑΧ焦點(diǎn)過于密集甚至發(fā)生重疊時(shí)，手工計(jì)數(shù)或軟件分 析均會(huì)出現(xiàn)較大偏差，因此，一般分析中γΗ2ΑΧ法的結(jié)果常以含γΗ2ΑΧ焦點(diǎn)細(xì)胞在總細(xì)胞 中所占百分比或γ Η2ΑΧ焦點(diǎn)的平均幾何熒光強(qiáng)度表示，而非以DNA雙鏈斷裂點(diǎn)數(shù)目表示。 單細(xì)胞凝膠電泳法及脈沖電場(chǎng)凝膠電泳法檢測(cè)的是DNA雙鏈斷裂在總DNA中所占的比例， 無法對(duì)DNA雙鏈斷裂數(shù)進(jìn)行定量分析。綜上所述，目前的主要檢測(cè)方法均難以對(duì)DNA雙鏈 斷裂數(shù)目進(jìn)行定量分析。難以定量DNA雙鏈斷裂數(shù)的主要原因是缺乏合適的已知量的標(biāo)準(zhǔn) 品用以推測(cè)未知樣本中DNA雙鏈斷裂數(shù)，因此，我們?cè)噲D提供一種應(yīng)用于定量分析DNA雙鏈 斷裂碎片數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法及其應(yīng)用。
[0004] 限制性內(nèi)切酶可以特異識(shí)別特定核苷酸序列并將其切割，使完整的DNA產(chǎn)生特定 斷裂碎片數(shù)目。限制性內(nèi)切酶切割完整的DNA分子后產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂的數(shù)目與該酶特 異識(shí)別的核苷酸序列在DNA分子中出現(xiàn)的頻率成正比。不同限制性內(nèi)切酶特異識(shí)別的核 苷酸序列不同，該核苷酸序列在DNA分子中出現(xiàn)的頻率也不同，因而用不同的限制性內(nèi)切 酶切割DNA分子可獲得不同數(shù)量的DNA雙鏈斷裂片段。本法借助限制性內(nèi)切酶完全酶切 DNA雙鏈斷裂陰性標(biāo)本制備定量檢測(cè)DNA雙鏈斷裂碎片數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，并通過識(shí)別特定序列 的軟件掃描，計(jì)算出已知序列的基因（組）DNA標(biāo)準(zhǔn)品中限制性內(nèi)切酶特異識(shí)別序列在基因 (組）中出現(xiàn)的次數(shù)，得到標(biāo)準(zhǔn)品中DNA雙鏈斷裂碎片的數(shù)目。制備方法簡(jiǎn)便，成本低廉，結(jié) 果可靠，并可廣泛應(yīng)用于各種生物已知基因（組）序列的DNA雙鏈斷裂碎片數(shù)的定量檢測(cè)， 解決了目前暫無定量檢測(cè)DNA雙鏈斷裂碎片數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品這一難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測(cè)DNA雙鏈斷裂碎片數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法以 及該標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用，以克服由于暫無 DNA雙鏈斷裂標(biāo)準(zhǔn)品而導(dǎo)致現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)難以對(duì)DNA 雙鏈斷裂碎片數(shù)進(jìn)行定量分析的不足。
[0006] 一種定量檢測(cè)DNA雙鏈斷裂碎片數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，用不同的限制性內(nèi)切酶 分別完全酶切已知序列的基因或基因組DNA所得碎片即為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0007] 上述用于制備標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)象為完整基因或基因組，即DNA雙鏈斷裂陰性標(biāo)本，要 求出現(xiàn)DNA雙鏈斷裂的比例< 5 %。
[0008] 能夠利用上述方法制備的標(biāo)準(zhǔn)品采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行DNA雙鏈斷裂 碎片數(shù)的定量分析，所述的標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的DNA類型相同。
[0009] 上述方法制備的標(biāo)準(zhǔn)品采用連接介導(dǎo)熒光定量PCR進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增制備標(biāo)準(zhǔn)曲 線。
[0010] 上述方法制備的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線以進(jìn)行連接介導(dǎo)熒光定量PCR后的標(biāo)準(zhǔn)品的 Ct值為橫坐標(biāo)，DNA雙鏈斷裂碎片數(shù)為縱坐標(biāo)，通過曲線擬合獲得擬合方程。對(duì)于任何已知 DNA序列的基因或基因組進(jìn)彳丁序列掃描，計(jì)算出基因或基因組中限制性內(nèi)切酶特異識(shí)別序 列出現(xiàn)的次數(shù)，1個(gè)特異識(shí)別序列即為1個(gè)切割位點(diǎn)，從而計(jì)算限制性內(nèi)切酶在基因或基因 組中的切割位點(diǎn)數(shù)，得到標(biāo)準(zhǔn)品基因或基因組DNA雙鏈斷裂碎片數(shù)。
[0011] 待測(cè)樣品同樣采用連接介導(dǎo)熒光定量PCR法擴(kuò)增，將待測(cè)樣本的Ct值代入方程中 即換算得到DNA雙鏈斷裂碎片數(shù)值。
[0012] 所述的方法制備得到的定量檢測(cè)DNA雙鏈斷裂片段數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用，用于對(duì)待 測(cè)樣品進(jìn)行DNA雙鏈斷裂碎片數(shù)的定量分析。具體是利用所述的標(biāo)準(zhǔn)品采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì) 待測(cè)樣品進(jìn)行DNA雙鏈斷裂碎片數(shù)的定量分析。所述的標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的DNA類型相同。
[0013] 本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)品的制備時(shí)為保證酶切盡量完全，應(yīng)盡量避免酶切序列的DNA甲基化 修飾，可通過限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品提供商提供的產(chǎn)品信息和DNA序列信息作出判斷。所用限 制性內(nèi)切酶的種類和數(shù)量根據(jù)待檢測(cè)樣品預(yù)估的斷裂碎片數(shù)確定，保證待測(cè)樣品的Ct值 和斷裂數(shù)均在所選定的幾種限制性內(nèi)切酶處理后制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，符合制備標(biāo)準(zhǔn)曲 線的原則。
[0014] DNA雙鏈斷裂檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)本DNA類型與待測(cè)標(biāo)本DNA類型相同，可以是任何已 知DNA序列生物的基因組，也可以是某個(gè)已知序列的DNA片段。
[0015] 本發(fā)明用于非疾病治療或者診斷目的的已知DNA序列的任何基因或基因組DNA雙 鏈斷裂碎片數(shù)目的檢測(cè)，包括各種動(dòng)物、植物和微生物等。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用本發(fā)明所用技術(shù)方案，可以達(dá)到以下技術(shù)效果：
[0017] 1.這是一個(gè)定量的方法：對(duì)于任何已知DNA序列的基因或基因組，采用本法均可 用標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得未知樣品中DNA雙鏈斷裂碎片的數(shù)目。
[0018] 2.適用性廣：對(duì)于已知基因組DNA序列的所有生物或者已知DNA序列的各種DNA 片段均可適用。它可和連接介導(dǎo)熒光定量PCR等技術(shù)配合使用。
[0019] 3.簡(jiǎn)單實(shí)用：本發(fā)明中標(biāo)準(zhǔn)品制備方法技術(shù)簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，成本低廉。
【附圖說明】
[0020] 圖I :含不同水平SDF的精子細(xì)胞在SCGE法中所呈現(xiàn)的"彗星"圖形；
[0021] 圖2 :6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的連接介導(dǎo)熒光定量PCR曲線圖；
[0022] 圖3 :連接介導(dǎo)熒光定量PCR分析精液DNA雙鏈斷裂碎片數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0023] 圖4 :中性單細(xì)胞凝膠電泳法與LM-FQPCR法相關(guān)性比較；
[0024] 圖5 :40例臨床精液標(biāo)本LM-FQPCR的擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0026] 實(shí)施例
[0027] 1.利用軟件對(duì)人基因組DNA雙鏈斷裂碎片數(shù)的確定：
[0028] 人染色體的核苷酸全序列可從 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/ genome/guide/human/index. shtml 的 download DNA sequence 下載。
[0029] 2.選擇平末端核酸內(nèi)切酶，通過識(shí)別特定序列用軟件對(duì)染色體DNA進(jìn)行掃描，核 酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的出現(xiàn)次數(shù)即為理論上的DNA雙鏈斷裂的碎片數(shù)。
[0030] 如 Afe I 識(shí)別序列 5' AGCi GCT 3'，
[0031] 3' TCGt CGA 5'
[0032] 對(duì)人基因組每一染色體分別掃描，用軟件確認(rèn)的限制性內(nèi)切酶識(shí)別的特定序列結(jié) 果見表1。
[0033] 表1限制性內(nèi)切酶特異識(shí)別序列在人類染色體中出現(xiàn)的次數(shù)
CN 105177128 A 說明書 4/9 頁
[0036] 3.人精子DNA雙鏈斷裂碎片（sperm DNA fragmentation, SDF)標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0037] 在人精子DNA雙鏈斷裂碎片分析中，習(xí)慣用SDF代表DNA雙鏈斷裂碎片。首先需 確定DNA雙鏈斷裂陰性精液標(biāo)本，一般采用堿性單細(xì)胞凝膠電泳法（SCGE)和中性單細(xì)胞凝 膠電泳法同時(shí)測(cè)定其"慧尾"DNA < 5%，即為SDF陰性（non-SDF)，如圖1。
[0038] 再用 Pmel，EcoRV，Psil，SspI，HaeIII, AluI 限制性內(nèi)切酶分別完全酶切 IOOng DNA 雙鏈斷裂陰性精液標(biāo)本精子基因組DNA以獲得6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品。通過優(yōu)化酶切條件，6種限制性 內(nèi)切酶完全酶切DNA碎片陰性精液標(biāo)本的精子基因組DNA的具體操作過程如下：
[0039] (I)PmeI限制性內(nèi)切酶完全酶切DNA碎片陰性標(biāo)本的精子基因組DNA :
[0041] 用無菌雙蒸水補(bǔ)至20 μ 1
[0042] 37°C孵育3h，65°C 20min滅活MssI限制性內(nèi)切酶
[0043] (2)EcoRV限制性內(nèi)切酶完全酶切DNA碎片陰性標(biāo)本的精子基因組DNA :
[0044] CN 105177128 A 說明書 5/9 頁
[0045] 用無菌雙蒸水補(bǔ)至20 μ I
[0046] 37°C孵育3h，80°C 20min滅活EcoRV限制性內(nèi)切酶
[0047] (3)PsiI限制性內(nèi)切酶完全酶切DNA碎片陰性標(biāo)本的精子基因組DNA :
[0049] 用無菌雙蒸水補(bǔ)至20 μ 1
[0050] 37°C孵育3h，65°C 20min滅活A(yù)anI限制性內(nèi)切酶
[0051] (4) SspI限制性內(nèi)切酶完全酶切DNA碎片陰性標(biāo)本的精子基因組DNA :
[0053] 用無菌雙蒸水補(bǔ)至20 μ 1
[0054] 37°C孵育2h，65°C 20min滅活SspI限制性內(nèi)切酶
[0055] (5)Hae III限制性內(nèi)切酶完全酶切DNA碎片陰性標(biāo)本的精子基因組DNA :
[0057] 用無菌雙蒸水補(bǔ)至20 μ 1
[0058] 37°C孵育2h，80°C 20min滅活BsuRI限制性內(nèi)切酶
[0059] (6) AluI限制性內(nèi)切酶完全酶切DNA碎片陰性標(biāo)本的精子基因組DNA :
[0060] CN 105177128 A 說明書 6/9 頁
[0061] 用無菌雙蒸水補(bǔ)至20 μ I
[0062] 37°C孵育lh，65°C 20min滅活A(yù)luI限制性內(nèi)切酶。
[0063] 分別取1