胃癌的血漿miRNA生物標(biāo)志物組合、其應(yīng)用及胃癌早期診斷試劑盒的制作方法【
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】[0001]本發(fā)明屬于生物
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中的miRNA及其應(yīng)用，特別是設(shè)及胃癌的血漿miRNA生物標(biāo)志物組合及其在胃腫瘤篩查、輔助胃腫瘤病理鑒定及臨床診斷中的應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]胃癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其死亡率位居第=。最近數(shù)據(jù)表明，在我國(guó)城市男性惡性腫瘤發(fā)病率和女性惡性腫瘤死亡率排名中，胃癌均位列第二，是嚴(yán)重威脅人類健康和制約經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的重大公共健康問(wèn)題。胃癌的早期診斷意味著可W提早干預(yù)治療，對(duì)患者的預(yù)后意義重大。目前，用于胃癌診斷主要依賴于內(nèi)鏡活檢，而運(yùn)種方法有創(chuàng)，給患者帶來(lái)痛苦，且對(duì)實(shí)施此項(xiàng)技術(shù)的醫(yī)師有較高要求。胃癌的無(wú)創(chuàng)檢查方法主要是血清腫瘤標(biāo)志物，例如癌胚抗原CEAXA199等，但是診斷的靈敏度和特異性較低。因此，尋找具有較高靈敏度和特異性的腫瘤標(biāo)志物對(duì)胃癌患者的早診早治具有重要意義。[0003]微小RNA(microRNA，miRNA)是一類平均長(zhǎng)度約22(19-24)個(gè)核巧酸的非編碼RNA，它廣泛參與了機(jī)體正常生理活動(dòng)調(diào)節(jié)。miRNA可W同時(shí)調(diào)節(jié)眾多祀基因，其在細(xì)胞中的異常表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。miRNA不但能在腫瘤組織中檢測(cè)到，而且在眾多體液中也能穩(wěn)定存在，能耐受酸堿等極端環(huán)境。不僅如此，有研究指出不同腫瘤患者血漿中miRNA的種類具有特異性，運(yùn)種特性為利用miRNA作為非侵入性的診斷標(biāo)志物進(jìn)行早期胃癌檢測(cè)提供了契機(jī)。在胃癌檢測(cè)中，肖斌等發(fā)明了利用組織中的miR-3化檢測(cè)（或診斷）胃癌的試劑盒，利用組織中的miR-3化檢測(cè)（或診斷）胃癌具有靈敏度較高（達(dá)93.33%)的優(yōu)點(diǎn)，但是此發(fā)明沒(méi)有提及miR-3化診斷胃癌的特異性如何，也即區(qū)分正常人群的能力，另一方面，該試劑盒應(yīng)用上受限，運(yùn)是由于受檢物癌灶組織標(biāo)本需要經(jīng)侵入性操作取得，況且如果能取得胃癌原發(fā)灶組織，完全可W通過(guò)病理來(lái)診斷（肖斌，鄒全明，朱恩東，黎伯勝，毛旭虎，李娜，郭剛.一種用于診斷或檢測(cè)胃癌的試劑盒[P].重慶：CN102002532A，2011-04-06.)。進(jìn)一步的，張正東等發(fā)明了利用血漿/血清中miR-148a、miR-142、miR-26a和miR-195四種miRNA中的一種或幾種診斷胃癌的試劑盒（張正東，王美林，康美云，劉桑，儲(chǔ)海燕，全娜，吳冬梅，趙慶洪，薬偉達(dá).檢測(cè)胃癌的血清/血漿微小RNA標(biāo)志物及其應(yīng)用[P].江蘇：CN103773761A，2014-05-07.)，在此種試劑盒中，U6基因作為內(nèi)參，但已有文獻(xiàn)報(bào)道U6基因在血漿中表達(dá)并不穩(wěn)定，因而WU6基因作為內(nèi)參基因計(jì)算W上四種miRNA的含量就有可能產(chǎn)生誤差，進(jìn)而影響診斷的準(zhǔn)確性度enzF,RoderburgC,VargasCD,etal.U6isunsuitablefornormalizationofserummiRNAlevelsinpatientswithsepsisorliverfibrosis.ExpMolMed.2013.45:e42;XiangM,ZengY,YangR,etal.U6isnotasuit曰bleendogenouscontrolforthequ曰ntific曰tionofcircul曰tingmicroRNAs.BiochemBio地ysResCommun.2014.454(1):210-4.)，另外，此發(fā)明是利用四種miRNA中的一種或幾種診斷胃癌，但是，發(fā)明人并沒(méi)有說(shuō)明何時(shí)采用一種miRNA診斷，何時(shí)采用兩種、=種或四種miRNA聯(lián)合診斷，也沒(méi)有說(shuō)明何時(shí)采用血清診斷，何時(shí)采用血漿診斷，而且如果當(dāng)用一種miRNA診斷胃癌的結(jié)果與用多種miRNA聯(lián)合診斷胃癌的結(jié)果不一致時(shí)，也就是說(shuō)若一種miRNA診斷結(jié)果判定為胃癌，而多種miRNA聯(lián)合診斷同一受試者結(jié)果判定為非胃癌時(shí)，此時(shí)該如何判定診斷結(jié)果，此發(fā)明中均未說(shuō)明，無(wú)疑會(huì)給使用者造成困擾。因此，迫切需要一種準(zhǔn)確、特異、靈敏的利用miRNA診斷胃癌的方法及其專用引物、探針與試劑盒?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一組用于胃癌早期診斷和罹患風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的血漿miRNA標(biāo)志物組合，利用該血漿miRNA生物標(biāo)志物組合可用于診斷受試者是否罹患胃癌并進(jìn)行罹患風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。[0005]本發(fā)明所提供的胃癌的血漿miRNA生物標(biāo)志物組合，包括W下血漿miRNA:miR-190a、miR-331-5p、miR-362-化和miR-369-化，W及miR-16作為內(nèi)參。其中，miR-190a的序列如序列表中SEQIDNO.1所示，miR-331-5p的序列如序列表中SEQIDNO.2所示，miR-362-化的序列如序列表中SEQIDNO.3所示，miR-369-化的序列如序列表中SEQIDNO.4所示，miR-16的序列如序列表中SEQIDNO.5所示。[0006]本發(fā)明的miRNA生物標(biāo)志物組合能在血漿中穩(wěn)定存在，其在正常人血漿、胃良性病變患者血漿和胃惡性腫瘤患者血漿中的表達(dá)量具有差異性，因此，能用于胃腫瘤篩查、輔助胃腫瘤病理鑒定及臨床診斷。因此，本發(fā)明的miRNA生物標(biāo)志物組合在胃腫瘤篩查、輔助胃腫瘤病理鑒定及胃癌早期臨床診斷中的應(yīng)用也屬于本【
發(fā)明內(nèi)容】。[0007]W上述血漿miRNA生物標(biāo)志物組合為祀標(biāo)，用基于化qMan探針的實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)可用于診斷胃癌。[0008]因此，上述血漿miRNA組合作為胃癌早期聯(lián)合診斷生物標(biāo)志物的應(yīng)用也是本
發(fā)明內(nèi)容。[0009]在所述PCR檢測(cè)中所述miR-190a、miR-331-5p、miR-362-化和miR-369-化各生物標(biāo)志物聯(lián)合使用按下式系數(shù)分配用于對(duì)胃癌進(jìn)行判斷：[0010]Y-6.302XAmiR1903+18.486XBmiR331Sp+50.194XCmiR3623P+16.113XDmiR3腳化[0011]其中，AmiKigOa是miR-igOa在血漿中的表達(dá)量（2&&G準(zhǔn)），BmiK33i日p是miR-33l-5p在血漿中的表達(dá)量（2&值），CmiK3日23P是miR-362-化在血漿中的表達(dá)量（2值），DmiR3693P是miR-369-化在血漿中的表達(dá)量（2&值）。[0012]本發(fā)明的另一目的是提供一種用于胃腫瘤篩查、輔助胃腫瘤病理鑒定及臨床診斷的miRNA試劑盒。[0013]本發(fā)明所提供的miRNA試劑盒，包含與所述miRNA生物標(biāo)志物組合PCR檢測(cè)相關(guān)的引物，分別為：[0014]miR-190a的RT引物（序列表中SEQIDNO.6所示）和F端引物（序列表中SEQIDNO.11所示）；[0015]miR-331-5p的RT引物（序列表中SEQIDNO.7所示）和F端引物（序列表中SEQIDNO.12所示）；[0016]miR-362-化的RT引物（序列表中SEQIDNO.8所示）和F端引物（序列表中SEQIDNO.13所示）；[0017]miR-369-化的RT引物（序列表中SEQIDNO.9所示和F端引物（序列表中SEQIDNO.14所示）；[001引內(nèi)參miR-16的RT引物（序列表中SEQIDNO.10所示）和F端引物（序列表中沈QIDNO.15所示）；W及[0019]通用R端引物（序列表中SEQIDNO.16所示）。[0020]上述試劑盒具體可包括W下引物和探針：[002。1)用于合成cDNA的逆轉(zhuǎn)錄引物：是特異性的RT莖環(huán)引物，miR-190a的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.6所示，miR-331-5p的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.7所示，miR-362-化的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.8所示，miR-369-化的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.9所示，miR-16的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.10所示；[002引。用于實(shí)時(shí)巧光定量PCR的引物和化qMan探針：miR-190a的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.11所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中SEQIDNO.16所示，haMan探針序列如序列表中SEQIDNO.17所示；miR-331-5p的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.12所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中沈QIDNO.16所示，TaqMan探針序列如序列表中沈QIDNO.18所示；miR-362-化的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.13所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中SEQIDNO.16所示，TaqMan探針序列如序列表中SEQIDNO.19所示；miR-369-化的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.14所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中SEQIDNO.16所示，TaqMan探針序列如序列表中SEQIDNO.20所示；miR-16的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.15所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中SEQIDNO.16所示，TaqMan探針序列如序列表中SEQIDNO.21所示。[0023]所述化qMan探針為經(jīng)過(guò)巧光標(biāo)記的，其5'端標(biāo)記有報(bào)告巧光基團(tuán)，如肥X、FAM等，優(yōu)選為FAM，其3'端標(biāo)記有澤滅巧光基團(tuán)，如ECLIPSE、TAMRA、MGB等，優(yōu)選為MGB。[0024]所述試劑盒還包括W下用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的試劑（可檢測(cè)100次）：lmL逆轉(zhuǎn)錄緩沖液（10X)，100yL脫氧核巧酸（lOOmM)，50yLRNA酶抑制劑（20U/yL)，150yL逆轉(zhuǎn)錄酶巧0U/yL)。[00巧]所述試劑盒還包括W下用于實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)體系的試劑（可檢測(cè)100次）：1.5mlPCR預(yù)混液（2X)，100yLF端引物液（20yM)，100yLR端引物液（20yM)，20yl；raqman探針引物（10yM)和2血無(wú)核酸酶水。[0026]W上述血漿miRNA生物標(biāo)志物組合為祀標(biāo)，使用上述miRNA試劑盒基于化qMan探針的實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)診斷胃癌的方法，可進(jìn)行W下操作：[0027]1)制備待測(cè)人血漿樣本，W健康人血漿樣本作為正常對(duì)照；[002引。提取血漿總RNA;[0029]3)將血漿總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;[0030]4)WcDNA為模板，在miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p、miR-369-3p和miR-16(內(nèi)參）的特異引物和化qMan探針的引導(dǎo)下，用基于化qMan探針的實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)檢測(cè)11111?-190日、11111?-331-59、11111?-362-化、11111?-369-化和11111?-16(內(nèi)參）在待測(cè)人血漿和健康人血漿中的表達(dá)量采用2表示待測(cè)樣本中目的miRNA表達(dá)量相對(duì)于正常對(duì)照組變化的倍數(shù)：[00引]2&&ct值中，Act=Ct目的miRNA-Ct內(nèi)參miRNA，[003引AACt=ACt待巧U樣本-ACt正常對(duì)照；[003引W采用2相對(duì)定量法分析數(shù)據(jù)，Logistic回歸方程（判斷公式）：Y=6.302XAmiRI90a+18.486XBmiR3315p+S0.igAXCmiR3623p+lG.llSXDmiR3693p，其中，AmiR190a是miR-190a在血漿中的表達(dá)量（2準(zhǔn)），BmiK33i5p是miR-331-5p在血漿中的表達(dá)量（2值），CmiR3623P是miR-362-化在血漿中的表達(dá)量（2值），DmiR3693P是miR-369-化在血漿中的表達(dá)量（2值），AAct=(CtmiRNA-CtmiR-16)Cancer-(CtmiRNA-CtmiR-16)MeanNormal，CtmiRNA和CtmiR-16分別代表用基于化qMan探針的實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)檢測(cè)到的目的mi當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 4