兔出血癥病毒雙抗夾心elisa檢測(cè)試劑盒及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒性疾病的檢測(cè)和診斷試劑研究領(lǐng)域，具體設(shè)及兔出血癥病毒 抗原的雙抗夾屯、ELISA檢測(cè)試劑盒及使用該試劑盒的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 兔出血癥（R皿）俗稱(chēng)"兔攝"，又稱(chēng)"兔出血性肺炎"、"兔病毒性敗血癥"，是由兔血 癥病毒（RHDV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性和致死性傳染病。本病潛伏期短、發(fā)病 迅速、死亡率高，對(duì)易感兔的致死率打動(dòng)90%W上，病死率高達(dá)100%。RHDV屬于杯狀病毒 科，兔病毒屬，該病毒科還包括水瘤疹病毒屬，札幌病毒屬和諾瓦克病毒屬，目前為止發(fā)現(xiàn) 的RHDV毒株均為同一血清型，且與其他Ξ個(gè)屬均無(wú)交叉反應(yīng)。該基因組為單股正鏈RNA分 子，是兔群疾病中一種重要病原。目前認(rèn)為該病只感染兔且可感染各種品種的兔，但對(duì)不同 年齡的兔感染差異很大，一般來(lái)說(shuō)生長(zhǎng)期和成年兔極易感染，90日齡W下的幼兔感染率很 低。
[0003] 兔病毒性出血癥發(fā)病時(shí)，病兔會(huì)出現(xiàn)體溫升高、食欲不振等癥狀，臨死前抽搖、尖 口q、鼻孔出血，死后尸體呈角弓反張。病毒主要侵襲兔肝臟、脾臟和肺，病死兔解剖可發(fā)現(xiàn)肝 臟出血壞死，脾臟腫大，肺部和氣管水腫出血等明顯病變。由RHDV致病機(jī)理研究可知，病毒 進(jìn)入機(jī)體后，感染血管組織內(nèi)單核細(xì)胞并誘發(fā)其調(diào)亡，導(dǎo)致血管內(nèi)凝血，進(jìn)而形成纖維性栓 塞，使體內(nèi)實(shí)質(zhì)性臟器出血，缺氧，最終壞死，最后，感染兔會(huì)因?yàn)轶w內(nèi)各種臟器功能性衰竭 而死亡。
[0004] 該病于1984年首先在我國(guó)江蘇爆發(fā)，但經(jīng)過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在1984年前的澳大利亞健 康兔血清中就能檢測(cè)到RHDV的抗體，說(shuō)明在該病被發(fā)現(xiàn)之前澳大利亞就存在非致病的兔 出血癥病毒。該病流行Ξ十年間，W蔓延至我國(guó)大部分地區(qū)，另外在美洲、歐洲和東南亞等 世界范圍內(nèi)均有流行，已有四十多個(gè)國(guó)家出現(xiàn)了該病的報(bào)道，由于R皿傳播迅速，毒力強(qiáng)， 一旦發(fā)病，往往造成兔群全覆滅，給養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 陽(yáng)〇化]目前該病的血清學(xué)診斷方法為傳統(tǒng)的人"0"型紅細(xì)胞的血凝抑制試驗(yàn)。但由于 感染兔組織和血液中含毒量低，常常不足W產(chǎn)生血凝現(xiàn)象，檢測(cè)率低，經(jīng)檢索，"在先申請(qǐng) 201410267882.8公開(kāi)了一種兔病毒性出血癥病毒RT-LAMP檢測(cè)方法，但是該方法敏感性 差，盡管恒溫?cái)U(kuò)增不需要PCR儀器，但結(jié)果顯示大多數(shù)LAMP實(shí)驗(yàn)仍然需要PCR儀器保溫，另 外由于沒(méi)有封閉系統(tǒng)，容易污染造成假陽(yáng)性；在先申請(qǐng)CN201310052271公開(kāi)了一種兔出血 癥病毒RT-PCR檢測(cè)方法，在先申請(qǐng)CN200610042409公開(kāi)了一種兔病毒性出血癥病毒巧光 定量檢測(cè)方法，運(yùn)兩種方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)率高，敏感但是運(yùn)些技術(shù)都需要專(zhuān)用的PCR儀、 巧光PCR儀等特殊儀器設(shè)備，限制了在基層和普通實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的開(kāi)展。另外盡管之前 也有針對(duì)RHDV特異性抗體的間接化ISA診斷試劑盒的研制，但市場(chǎng)上穩(wěn)定高效簡(jiǎn)便的商品 化檢測(cè)試劑盒仍然極少，另外受感染兔有時(shí)表現(xiàn)耐受免疫，體內(nèi)抗體滴度低等現(xiàn)象，因此， 針對(duì)抗原檢測(cè)的診斷方法更具有實(shí)際意義。
[0006] 雙抗夾屯、化ISA檢測(cè)方法由于其高效、敏感、特異性，而且操作簡(jiǎn)單、適宜于基層 和大批樣品檢測(cè)等特點(diǎn)，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外動(dòng)物疫病常用的疾病診斷技術(shù)。盡管目前雙抗夾 屯、化ISA已應(yīng)用于牛病毒性腹瀉病毒，甲型H1N1豬流感病毒等多種病院的檢測(cè)，但是由于 應(yīng)用于建立雙抗夾屯、化ISA方法的抗體多為一種單抗與一種多抗，而多抗效價(jià)低，敏感性 差，假陽(yáng)性高，并且不穩(wěn)定，之前報(bào)道的實(shí)驗(yàn)室制備的針對(duì)VP60單克隆抗體之間沒(méi)有良好 的配對(duì)反應(yīng)，因此該技術(shù)未應(yīng)用于RHDV的檢測(cè)。隨著我國(guó)養(yǎng)兔業(yè)越來(lái)越發(fā)達(dá)，養(yǎng)殖規(guī)模不 斷擴(kuò)大，建立一種良好穩(wěn)定而且快速的適合于基層和臨床檢測(cè)RHDV的方法勢(shì)在必行，我們 期望通過(guò)制備一種穩(wěn)定，敏感性高的檢測(cè)RHDV的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、低成本、適應(yīng)大規(guī)模檢測(cè) 的單克隆抗體介導(dǎo)的雙抗夾屯、化ISA方法。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 第一方面，本發(fā)明提供一種適用于檢測(cè)兔出血癥病毒的雙抗夾屯、化ISA方法的單 克隆抗體9H9,通過(guò)如下方法篩選得到：
[0010] 免疫原制備：純化的VP60蛋白與弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，制備免疫原，免 疫小鼠；
[0011] 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞制備：取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，間接化ISA篩選 得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞；
[0012] 單克隆抗體：陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞亞克隆建株，腹水制備、純化，即得7株單克隆抗體 4A5,5B7,6F6,9H9,11D4,15C3,16F2 ;對(duì)所述7株單克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記；
[0013] 夾屯、抗體配對(duì)：對(duì)所述7株單克隆抗體進(jìn)行包被抗體與酶標(biāo)抗體配對(duì)，即得適用 于檢測(cè)兔出血癥病毒的雙抗夾屯、化ISA方法的包被抗體9H9、酶標(biāo)抗體HRP-9H9。
[0014] 第二方面，本發(fā)明提供一種基于所述單克隆抗體9H9的用于檢測(cè)兔出血癥病毒的 雙抗夾屯、化ISA方法的建立包括：
[0015] 所述配對(duì)的包被抗體9H9和酶標(biāo)抗體HRP-9H9最佳工作濃度、最適包被條件、最適 封閉劑、最適封閉條件、酶標(biāo)二抗稀釋液組分、酶標(biāo)抗體最適作用時(shí)間、底物作用時(shí)間及雙 抗夾屯、化ISA方法臨界值的確定，選取最適參數(shù)的組合，即可。
[0016] 優(yōu)選地，所述包被抗體9H9和酶標(biāo)抗體HRP-9H9的工作濃度分別為5μg/ml、 0.5μg/ml。
[0017] 優(yōu)選地，所述最適包被條件為37°C、化后4°C過(guò)夜。
[0018] 優(yōu)選地，所述最適封閉劑為1%的明膠。
[0019] 優(yōu)選地，所述最適封閉條件為37°C、2h。
[0020] 優(yōu)選地，所述酶標(biāo)二抗稀釋液的組分為含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS(小牛血清）的 pH7. 4的憐酸鹽緩沖液。
[0021] 優(yōu)選地，所述酶標(biāo)抗體最適作用時(shí)間為37°C、比。 陽(yáng)02引優(yōu)選地，所述底物作用時(shí)間為37°C、15min。
[0023] 優(yōu)選地，所述臨界值為0. 35。
[0024] 第Ξ方面，本發(fā)明提供一種基于單克隆抗體9H9的雙抗夾屯、化ISA試劑盒，包括洗 涂液、顯色液、終止液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，包被抗體9冊(cè)的酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗體HRP-9H9。 陽(yáng)ο巧]優(yōu)選地，所述的洗涂液，溶劑為抑7. 4、0.Olmol/L的憐酸緩沖液（PBS)，溶質(zhì)及其 在所述洗涂液中的濃度為：Tween-200. 05%; 陽(yáng)0%] 所述的顯色液為T(mén)MB顯色液；
[0027] 所述的終止液是2mol/L的H2SO4溶液；
[0028] 所述的陽(yáng)性對(duì)照是陽(yáng)性兔肝臟研磨液；
[0029] 所述的陰性對(duì)照是陰性兔肝臟研磨液。
[0030] 本發(fā)明的試劑盒中的包被抗體和酶標(biāo)抗體均為抗VP60蛋白單克隆抗體9H9。
[0031] 第四方面，本發(fā)明提供一種所述雙抗夾屯、化ISA試劑盒的使用方法，包括：
[0032] 包被：用憐酸緩沖液對(duì)所述包被抗體9H9進(jìn)行稀釋?zhuān)缓髮⑵浼又笜?biāo)板中包被， 洗涂、甩干；
[003引封閉：向所述酶標(biāo)板中加入封閉劑進(jìn)行封閉，洗涂、甩干；
[0034] 加待檢樣品：再向所述酶標(biāo)板中加入待檢樣品，反應(yīng)后洗涂、甩干；
[0035] 加入酶標(biāo)抗體HRP-9H9 :向所述酶標(biāo)板中加入酶標(biāo)抗體HRP-9H9,反應(yīng)后洗涂、甩 干；
[0036] 加顯色液：加入顯色液解育；
[0037] 終止：加入終止液，終止反應(yīng)；
[0038] 檢測(cè)：在酶標(biāo)儀上讀取0D450值。
[0039] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0040] 1.本發(fā)明所采用包被抗體和酶標(biāo)抗體均為針對(duì)VP60特異性單克隆抗體，相比多 克隆抗體，更敏感，特異性更強(qiáng)，與其他病毒均無(wú)交叉反應(yīng)；
[0041] 2.本發(fā)明提供封閉后的酶標(biāo)板，方法簡(jiǎn)便，不需要特殊儀器，根據(jù)反應(yīng)顏色即可W 初步判斷樣品是否為陽(yáng)性，適合于基層獸醫(yī)使用；
[00創(chuàng) 3.本發(fā)明快速，靈敏，立個(gè)小時(shí)即可W得到檢測(cè)結(jié)果，不耽誤治療時(shí)間； 陽(yáng)0創(chuàng) 4.由于雙抗夾屯、ELISA方法檢測(cè)的是RHDV抗原，可避免因體內(nèi)抗體滴度低而出現(xiàn) 漏檢現(xiàn)象，檢測(cè)準(zhǔn)確率高。
【附圖說(shuō)明】
[0044] 通過(guò)閱讀參照W下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0045] 圖1為SDS-PAGE分析VP60蛋白表達(dá)純化及酶切；
[0046] 其中，1為蛋白質(zhì)Marker, 2為未誘導(dǎo)菌體蛋白，3為純化的重組VP60蛋白，4為酶 切后的重組VP60蛋白，5是純化后的VP60蛋白；
[0047] 圖2為Western blot分析VP60蛋白的表達(dá)純化及酶切；
[0048] 其中，1為未誘導(dǎo)菌體蛋白，2為純化的重組VP60蛋白，3為酶切后的重組VP60蛋 白，4和5為純化后的VP60蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。W下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不W任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可w做出若干變形和改進(jìn)。運(yùn)些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。