一種cd306夾心elisa試劑盒的建立方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于癌癥早期診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種⑶306夾心ELISA試劑盒的建立方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率已處于惡性腫瘤的第三位，在我國惡性腫瘤中位居第五位，。隨著人們健康意識的增強(qiáng)及醫(yī)療診斷水平的提高，預(yù)計(jì)我國大腸癌的發(fā)病率還將繼續(xù)升高。大腸癌早期得到確診的只有5%，60%?70%的大腸癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已是Π期或晚期，術(shù)后5年生存率約50%，術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)30%，嚴(yán)重影響人們的身體健康和生活質(zhì)量。因?yàn)樵缙诮Y(jié)直腸癌治療方法多，預(yù)后好，所以有研究表明，如果能早期發(fā)現(xiàn)并治療大腸癌，可以降低15%的死亡率。而大腸癌經(jīng)過手術(shù)治療后，長期隨訪及預(yù)后評估是大腸癌病人獲得長期生存的必要條件，如預(yù)后評估較差，應(yīng)密切觀察病情發(fā)展趨勢，發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)征象時(shí)，及早采取干預(yù)措施。因此如何選擇一種經(jīng)濟(jì)、方便、依從性好的早期診斷及預(yù)后評估方法，提高早期大腸癌的檢出率，降低因大腸癌導(dǎo)致的死亡，是大腸癌治療中的重中之重。
[0003]目前對于大腸癌的診斷主要包括腸鏡檢查，病理活檢，CEA檢測，腹部CT等，病人的檢查過程復(fù)雜、花費(fèi)較高、且診斷相對滯后。而預(yù)后評估主要依靠術(shù)后病理分期，動(dòng)態(tài)觀測CEA、定期檢查肝、肺等轉(zhuǎn)移情況，缺乏前瞻性，準(zhǔn)確性較差。因此開發(fā)出可以對結(jié)直腸患者進(jìn)行早期診斷及判斷預(yù)后高靈敏性、高特異性的方法及試劑盒是大腸癌診治技術(shù)發(fā)展的必然趨勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種⑶306夾心ELISA試劑盒及其建立方法。
[0005]本發(fā)明的再一目的在于提供上述⑶306夾心ELISA試劑盒在評估⑶306的血清水平與結(jié)腸癌直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系方面的應(yīng)用，旨在提高早期大腸癌的檢出率，降低因大腸癌導(dǎo)致的死亡。
[0006]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種⑶306夾心ELISA試劑盒的建立方法，包括以下步驟:
[0007](I)使用生物傳感器對抗CD306單克隆抗體識別的表位進(jìn)行鑒定，了解各個(gè)抗體識別的抗原表位的空間位置關(guān)系；
[0008](2)選擇其中兩株識別不同抗原表位的單克隆抗體，分別將其標(biāo)記上HRP(辣根過氧化物酶)，包被其中一株未標(biāo)記抗體于96孔板，CD306—Fe融合蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，HRP標(biāo)記的另一株抗體做為第二抗體;檢測批內(nèi)、批間變異系數(shù)，驗(yàn)證本檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性；
[0009](3)將第二抗體交互用碳酸氫鈉緩沖液或硼酸緩沖液對蛋白質(zhì)充分透析；向抗體溶液中加入DMSO(二甲基亞砜)溶解的生物素蛋白；將樣品經(jīng)過分子篩柱，以I3BS(磷酸鹽緩沖液)洗脫，收集生物素標(biāo)記的抗體;將原試劑盒與標(biāo)記生物素后的試劑盒進(jìn)行敏感性對照。
[0010]本發(fā)明的再一目的在于提供上述⑶306夾心ELISA試劑盒在評估⑶306的血清水平與結(jié)腸癌直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系方面的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種⑶306夾心ELISA試劑盒的建立方法及應(yīng)用，通過鑒定抗⑶306單克隆抗體表位，建立⑶306夾心ELISA試劑盒，最后提高試劑盒的敏感性得到。該試劑盒用于評估CD306的血清水平與結(jié)腸癌直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，首先確定利用流式細(xì)胞術(shù)對大腸癌進(jìn)行早期診斷的定量標(biāo)準(zhǔn)，然后用CD306夾心ELISA試劑盒檢測結(jié)直腸癌患者血清中CD306的水平，最后對大腸癌患者進(jìn)行長期隨訪，記錄檢測指標(biāo)，評估CD306的血清水平與結(jié)腸癌直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。本發(fā)明經(jīng)濟(jì)、方便、依從性好，能提高早期大腸癌的檢出率，降低因大腸癌導(dǎo)致的死亡。
[0012]在本發(fā)明中，腫瘤細(xì)胞表達(dá)膠原家族中的許多成員，這些表達(dá)的膠原參與腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。研究表明，腫瘤發(fā)生初期，其表面的膠原分子在某種不明機(jī)制下可導(dǎo)致免疫細(xì)胞表面抑制性受體的特異性上調(diào)，從而逃逸免疫監(jiān)視。白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體(Leukocyte associated immunoglobulin like_receptor，LAIR)屬于免疫球蛋白超家族成員，它廣泛分布于外周血單個(gè)核細(xì)胞。它是1983年用大顆粒淋巴細(xì)胞免疫小鼠，制備對NK細(xì)胞殺傷有抑制作用的抗體時(shí)發(fā)現(xiàn)的。人LAIR家族包含LAIR-1和LAIR-2兩個(gè)成員。在第八屆人類白細(xì)胞分化抗原會(huì)議上分別被命名為CD305及CD306XD305是一種抑制性受體，在大腸癌發(fā)生初期，大腸癌細(xì)胞特異性表達(dá)CD305的高親和力配體XVII型膠原，當(dāng)CD305與膠原結(jié)合可明顯抑制免疫細(xì)胞的活性。因此，可應(yīng)用熒光標(biāo)記的抗CD305單克隆抗體，利用流式細(xì)胞術(shù)對大腸癌進(jìn)行早期診斷。
[0013]CD305與膠原之間的相互作用可受到可溶性分子CD306的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CD306與CD305有相同的膠原結(jié)合位點(diǎn)，而且⑶306與膠原的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于⑶305與膠原結(jié)合的親和力，CD306能夠以高親和力結(jié)合膠原，并可阻斷CD305與膠原的結(jié)合。體內(nèi)少量的CD306的變化就可能明顯地影響CD305與膠原的結(jié)合活性。在腫瘤患者血清中CD306的濃度提高可降低腫瘤細(xì)胞通過CD305分子對免疫細(xì)胞發(fā)揮的抑制活性，從而促進(jìn)免疫殺傷。因此，本發(fā)明通過夾心ELI SA檢測患者血清中⑶306的水平，從而對患者預(yù)后進(jìn)行預(yù)測。
【具體實(shí)施方式】
[0014]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0015]實(shí)施例1 CD306夾心ELISA試劑盒的建立
[0016](I)使用生物傳感器對抗CD306單克隆抗體識別的表位進(jìn)行鑒定，了解各個(gè)抗體識別的抗原表位的空間位置關(guān)系
[0017]在步驟(I)中，分別在生物傳感器的樣品反應(yīng)池中加入乙酸緩沖液，隨即加入⑶306-Fc融合蛋白(真核表達(dá)⑶306融合蛋白包括以下具體過程:以⑶306 cDNA為模板，用引物擴(kuò)增cDNA，克隆的CD306插入載體中，構(gòu)建出真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，克隆出穩(wěn)定分泌CD306-Fc融合蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞并純化融合蛋白)和人IgG標(biāo)準(zhǔn)品(購自Gibco公司)，觀察CD306-Fc和人IgG標(biāo)準(zhǔn)品與樣品反應(yīng)池的結(jié)合量。用roS/T洗滌一次，開始收集數(shù)據(jù)信息，獲得5?1min緩沖液基線數(shù)據(jù)?；旌螻HS(N-羥基琥珀酰亞胺)和EDC(l-(3-二甲氨基丙