人β3乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8雙抗體夾心ELISA試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是人β3乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8雙抗體夾心ELI SA試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]β3乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8/β1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶7基因(ΑΥ277592 EC2.4.1-)是由蘇州大學(xué)吳士良教授課題組通過(guò)電子克隆方法在國(guó)際上首先克隆得到并初次命名為βI，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的一個(gè)β3糖基轉(zhuǎn)移酶大家族的新基因，對(duì)這個(gè)基因我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)進(jìn)行了克隆和表達(dá)的研究，之后日本學(xué)者對(duì)其進(jìn)行酶活測(cè)定后重命名為β3乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(KGnT8)。近期本室對(duì)其催化功能進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證研究即分別進(jìn)行β1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和β3-Ν-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)體系的酶促反應(yīng)，利用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)，表明KGalT7同時(shí)具有較弱的β1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和較高的β3-Ν-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的活性，故初步重命名為β3乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(i33GnT8)/m，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶W3GalT7)，縮寫(xiě)為03GnT8或03GalT7。
[0003]i33GnT8在腫瘤標(biāo)志抗原多聚乳糖胺合成中扮演重要角色。近年來(lái)國(guó)外及我們的研究表明，i33GnT8在多種人腫瘤組織中存在異常高表達(dá)。它催化合成的多聚乳糖胺結(jié)構(gòu)是一種特有的含有N-乙酰乳糖胺(LacNAc)重復(fù)序列的聚糖，它添加在O-聚糖，N-聚糖以及糖脂上.多聚乳糖胺結(jié)構(gòu)常被修飾攜帶一些重要的碳水化合物結(jié)構(gòu)，比如Lewis相關(guān)抗原，HNK-1抗原等，發(fā)揮著重要的生理病理功能。在腫瘤轉(zhuǎn)移層面，多聚乳糖胺及其相關(guān)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的作用、免疫反應(yīng)以及癌細(xì)胞迀移能力中占有重要角色。已有研究表明，三天線、四天線N-聚糖β?，6分支上的多聚乳糖胺結(jié)構(gòu)參與眾多的腫瘤惡性表型，影響著細(xì)胞增殖和迀移能力。
[0004]我們已于2010年成功研制了兔抗人i33GnT8多克隆抗體，研究表明該抗體在免疫分析中有著較佳的應(yīng)用，并且具有較高特異性，而這些工作也就解決了該試劑盒研制中的最關(guān)鍵問(wèn)題之一。應(yīng)用雙抗體夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))試劑盒的方法對(duì)i33GnT8的檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。而且應(yīng)用ELISA法對(duì)腫瘤患者的糖基轉(zhuǎn)移酶篩查已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道，如像神經(jīng)酰胺等ELISA試劑盒已經(jīng)用于腫瘤患者或病毒感染患者血清的篩查，均表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用價(jià)值與前景。本發(fā)明將首次運(yùn)用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)i33GnT8的方法對(duì)結(jié)腸癌等腫瘤患者進(jìn)行篩查;通過(guò)該試劑盒對(duì)腫瘤臨床樣本的篩查，用該試劑盒定量檢測(cè)患者血清中P3GnT8的含量。通過(guò)對(duì)不同類(lèi)型癌癥患者血清中03GnT8的含量與正常人血清含量比較，借助這些差異給腫瘤早期發(fā)現(xiàn)能提供一個(gè)重要的參考依據(jù)，而這些工作將會(huì)具有極大地應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異性強(qiáng)、精確度高、操作簡(jiǎn)便、快速的抗人03GnT8雙抗體夾心ELISA試劑盒。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供人β3乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8雙抗體夾心ELI SA試劑盒，包括:洗滌液、樣品稀釋液、顯色液、終止液、包被抗體的酶標(biāo)板、檢測(cè)抗體、酶標(biāo)抗體、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照蛋白。
[0007]優(yōu)選的是，所述包被抗體的酶標(biāo)板是以鼠抗人β3乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8單克隆抗體為包被抗體，用包被液將包被抗體稀釋?zhuān)靠准尤胂♂尯蟮陌豢贵w，并在過(guò)夜包被后用洗滌液洗滌;再向酶標(biāo)板中加入封閉液，等待反應(yīng)，最后洗滌液洗滌。
[0008]優(yōu)選的是，所述檢測(cè)抗體是兔抗人β3乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8多克隆抗體。
[0009]優(yōu)選的是，所述酶標(biāo)抗體是辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體。
[0010]優(yōu)選的是，所述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照蛋白:包括陽(yáng)性對(duì)照i33GnT8蛋白和陰性對(duì)照大腸桿菌菌體蛋白。
[0011 ]優(yōu)選的是，所述包被抗體被包被液稀釋后的濃度是5yg/mL，稀釋后的包被抗體每孔加入量為10yL，過(guò)夜包被的溫度為4°C;過(guò)夜包被后洗滌液洗滌次數(shù)為3?4次;酶標(biāo)板中加入封閉液的量為每孔10yL，酶標(biāo)板中加入封閉液的反應(yīng)溫度是37°C，反應(yīng)時(shí)間為1~2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后洗滌液洗滌次數(shù)為3~4次。
[0012]優(yōu)選的是，所述的包被抗體的制備方法為:
第一，將β3乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8蛋白與弗氏完全佐劑混合，用BALB/c小鼠進(jìn)行皮下免疫；
第二，分別于BALB/c小鼠初次后，更換為弗氏不完全佐劑對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行第二次和第三次免疫；
第三，在BALB/c小鼠第三次免疫對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔注射加強(qiáng)免疫；
第四，按照常規(guī)雜交瘤制備方法制備脾臟B淋巴細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞的融合雜交瘤細(xì)胞株，進(jìn)行單克隆細(xì)胞分選培養(yǎng)，經(jīng)包被β3乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8蛋白的ELISA篩選鑒定獲得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株；
第五，借助BALB/c小鼠腹水瘤制備鼠抗人β3乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8單克隆抗體，腹水經(jīng)分離純化后獲得用于雙抗體夾心ELISA試劑盒的包被抗體。
[0013]優(yōu)選的是，所述第一步中β3乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8蛋白與弗氏完全佐劑的混合比例為1:1;每只BALB/c小鼠免疫總量0.2mL進(jìn)行皮下免疫;所述第二步中對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行第二次和第三次免疫的具體時(shí)間是在BALB/c小鼠初次免疫3周后和5周后;第三步中對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔注射加強(qiáng)免疫的具體時(shí)間是在BALB/c小鼠第三次免疫2周后且細(xì)胞融合前I天。
[0014]上述方案中，所述的包被液配制方法為:1.59g Na2C03，2.93g NaHC03，去離子水溶解并定容至1L。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:提供一種人β3乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8雙抗體夾心ELISA試劑盒，利用抗人f33GnT8單克隆抗體和抗人f33GnT8多克隆抗體，制備抗人f33GnT8雙抗體夾心ELISA試劑盒;其采用抗人f33GnT8單克隆抗體和抗人f33GnT8多克隆抗體作為該試劑盒中的包被抗體和檢測(cè)抗體，有力的排除非特異性干擾，并且能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)抗原蛋白的不同表位檢測(cè)，使結(jié)果更具準(zhǔn)確性。而且本發(fā)明的檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)成本低、適用于大規(guī)模樣品的檢測(cè)，易于推廣普及。其采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附ELISA法，用該試劑盒定量檢測(cè)患者血清中i33GnT8蛋白水平的含量，尤其是結(jié)腸癌患者。通過(guò)結(jié)腸癌患者血清i?GnT8蛋白水平的高低，并與正常人血清水平對(duì)比，借助這些表達(dá)差異為結(jié)腸癌的早期診斷提供一個(gè)重要的參考依據(jù)。
[0016]
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。
[0018]一、鼠抗人f33GnT8單克隆抗體的制備 I.抗原致敏B淋巴細(xì)胞的免疫小鼠獲得
β36ηΤ8原核表達(dá)并純化的蛋白樣本用0.0IM I3BS (ρΗ7.2) 1 X稀釋后加等體積的弗氏完全佐劑充分混勻后按30ug/只蛋白劑量注射于5只5周齡雌性的SPF級(jí)Balb/c小鼠腹腔中，每隔二周后按上述等蛋白劑量加弗氏不完全佐劑腹腔免疫各一次，三次免疫后再隔一周按30ug/只蛋白劑量(無(wú)佐劑)進(jìn)行四免，四免后5?7天，眼眶靜脈采血取血清作待測(cè)抗體；以所述03GnT8純化蛋白(lmg/ml)作固定標(biāo)準(zhǔn)抗原，做間接ELISA，效價(jià)超過(guò)1: 1000表明已經(jīng)獲得了能產(chǎn)生較高效價(jià)針對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)物特異性抗體的免疫小鼠，同時(shí)說(shuō)明該小鼠脾臟內(nèi)已有抗原致敏B淋巴細(xì)胞克隆。
[0019]2.融合細(xì)胞克隆的獲取和分泌抗體克隆株的篩選 a.融合細(xì)胞生長(zhǎng)克隆培養(yǎng)
無(wú)菌取上述一只合格小鼠脾，將其置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，10%FBS+RPM1-1640洗滌2-3次后剪成小塊，用無(wú)菌玻璃片研磨，擠出脾細(xì)胞，30-40ml 10%FBS+RPMI 1640吹散重懸細(xì)胞，過(guò)200目尼龍膜進(jìn)行細(xì)胞篩后(單細(xì)胞易于細(xì)胞融合)再用RPM1-1640培養(yǎng)基洗滌2-3次并計(jì)數(shù)；