一種金釵石斛種苗的組培方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥用植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金釵石斛種苗組織培育繁 殖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金釵石斛為蘭科多年生草本植物，別名為扁金釵、扁黃草、扁草、黃草等。金釵石斛 種子微小，胚發(fā)育不完全，在自然條件下極難出芽;若以分株或腋芽繁殖，耗時長且繁殖系 數(shù)低，金釵石斛賴以生存的自然環(huán)境發(fā)生變化，野生資源銳減，加之長期采挖，種質(zhì)資源稀 缺，已瀕臨滅絕，已不能滿足市場需求。
[0003] 應(yīng)用植物組織培育方法在一定程度上解決了金釵石斛種苗短缺的現(xiàn)象，有關(guān)金釵 石斛的快速繁殖技術(shù)國內(nèi)多有報(bào)道。然而，以瓊脂為支持物進(jìn)行固體或半固體培養(yǎng)的傳統(tǒng) 植物組織培養(yǎng)方法已日益凸顯出不能適應(yīng)產(chǎn)業(yè)呼吁低耗、高效的現(xiàn)實(shí)和發(fā)展需要。傳統(tǒng)的 組培方法培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分單一，培養(yǎng)需要耗費(fèi)大量瓊脂，在灌裝以及清洗時需處理大量 容器，也需耗費(fèi)大量勞動力，具有高人工成本、高能耗、高物料的缺點(diǎn)。同時，金釵石斛種苗 的傳統(tǒng)組培方法，一般一瓶最多能生長30株，產(chǎn)量少，移栽時需手工輕柔清洗掉根部的固體 培養(yǎng)基，工作量大且容易損傷幼嫩根;在提取有效的次生代謝產(chǎn)物時，必須從瓊脂中提取， 工作量大。這些不利因素限制了傳統(tǒng)組培技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化利用，亟需對現(xiàn)有的主流組培方法 和裝置進(jìn)行節(jié)約型、自動化的技術(shù)升級。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對上述存在的技術(shù)問題，提供一種繁殖迅速、周期短、種苗產(chǎn)量高；自動 化程度高的金釵石斛種苗方法。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種金釵石斛種苗的組培方法，建立間歇浸 沒液體培養(yǎng)系統(tǒng)，包括以下步驟： 步驟一、MS培養(yǎng)液的配置與滅菌消毒： MS培養(yǎng)液的組分及組分用量為:MS、NAA0.5~5. Omg/L、馬鈴薯汁液50~200g/L和蔗糖 30g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.70~6.00，MS培養(yǎng)液配置完成后，放入試劑瓶中，然后將試劑瓶轉(zhuǎn)移至 濕熱高壓滅菌鍋內(nèi)，進(jìn)行加熱加壓滅菌，加熱溫度為121°C，壓力為0.1~l.OMPa，滅菌20min 后備用；間歇浸沒式生物反應(yīng)器的滅菌：取間歇浸沒式生物反應(yīng)器在濕熱高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn) 行加熱加壓滅菌，加熱溫度為121°C，壓力為0.1~l.OMPa，滅菌20min后備用； 步驟二、制備金釵石斛外植體； 步驟三、接種:在無菌環(huán)境下將步驟一的MS培養(yǎng)液倒入間歇浸沒式生物反應(yīng)器中，然后 將金釵石斛外植體接種到間歇浸沒式生物反應(yīng)器中； 步驟四、培養(yǎng):設(shè)定間歇浸沒式生物反應(yīng)器的相關(guān)參數(shù)，即：浸沒頻率為3~20min/4~ 12h，培養(yǎng)時間為60~180d;設(shè)定培養(yǎng)環(huán)境條件為:光照強(qiáng)度1500~1800Lx，光照12h/d，溫度 為 25±1。(3。
[0006] 本發(fā)明的有益效果為:步驟一增殖率高。本發(fā)明技術(shù)方案將制得的MS培養(yǎng)液消毒 后倒入間歇浸沒式生物反應(yīng)器中，建立了間歇浸沒液體培養(yǎng)系統(tǒng)，在無菌條件下利用無菌 空氣產(chǎn)生的壓力將MS培養(yǎng)液與外植體間歇接觸，結(jié)合了固體培養(yǎng)最大化氣體交換和液體培 養(yǎng)營養(yǎng)充分利用的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明方案金釵石斛培養(yǎng)的增殖率是傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)的10倍以 上，是普通液體培養(yǎng)的3~7倍。
[0007] 步驟二自動化程度高、勞動量小。間歇浸沒液體培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了半自動化控制，整 個培養(yǎng)過程只需要一次接種，同一間歇浸沒式生物反應(yīng)器中僅需更換一次MS培養(yǎng)液，省去 了現(xiàn)有技術(shù)中頻繁轉(zhuǎn)接和大批量組培瓶的灌裝清洗等的操作，大大的減少了勞動量，降低 了生產(chǎn)成本。
[0008] 步驟三、組培苗質(zhì)量好，適應(yīng)性強(qiáng)。同傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基相比減少了繼代次數(shù)，降 低了變異率，并且在培養(yǎng)過程中進(jìn)行了充分的氣體交換，減少甚至避免了種苗玻璃化，繁殖 得到的種苗更健壯;種苗環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、移栽成活率高。
[0009] 進(jìn)一步，步驟二所述金釵石斛外植體為金釵石斛原球莖、金釵石斛組培苗中的一 種。
[0010] 進(jìn)一步，步驟二金釵石斛外植體還可為金釵石斛腋芽，所述金釵石斛腋芽的制備 方法為:第一步：制備MS固體培養(yǎng)基:MS、NAA0 · 5~5 · Omg/L、馬鈴薯汁液50~200g/L、蔗糖 30g/L、瓊脂7g/L;混合配置后備用；第二步:采用金釵石斛植株，用濃度為0.1~1.0%的新潔 爾滅溶液浸泡金釵石斛植株5~30min，然后用流動的水清洗30~60min;在無菌環(huán)境中，去 除清洗后的金釵石斛植株的葉片，并用75%的酒精浸泡15~30s，用無菌水清洗2次，再用濃 度〇. 1%的升汞浸泡10~20min，最后再用無菌水清洗3~7次;第三步:將完成了第二步的金 釵石斛植株切成若干莖段，每個莖段含有一個腋芽，將莖段接種到MS固體培養(yǎng)基中，3~5d 后取出，制得腋芽并接種到步驟三的間歇浸沒式生物反應(yīng)器中。
[0011]進(jìn)一步，步驟三中外植體的接種密度為:每升MS培養(yǎng)液中接種35~80個外植體。通 過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)每升MS培養(yǎng)液中外植體接種量低于35個時，外植體沒有充滿整個間歇浸沒 式生物反應(yīng)器反應(yīng)器，空間利用率低，當(dāng)每升MS培養(yǎng)液中外植體接種量高于80個時，間歇浸 沒式生物反應(yīng)器中的外植體擁擠，出現(xiàn)畸形苗;每升MS培養(yǎng)液中接種35~80個外植體時，既 能充分利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器的空間及MS培養(yǎng)液中的營養(yǎng)，有不會導(dǎo)致外植體擁擠出 現(xiàn)畸形苗的情況。
[0012] 進(jìn)一步，步驟一中馬鈴薯汁液為馬鈴薯研磨或榨汁方式制得。鮮物研磨、煎煮汁或 榨汁獲得馬鈴薯汁液既能滿足破壞組織和細(xì)胞獲得細(xì)胞內(nèi)含物的目的，又不會破壞細(xì)胞內(nèi) 大分子結(jié)構(gòu)。
[0013] 進(jìn)一步，步驟四中所述浸沒頻率為5~12min/8~10h。此浸沒頻率在最大限度節(jié)約 能源消耗的基礎(chǔ)上，既能夠滿足金釵石斛對營養(yǎng)的需求，又不會因營養(yǎng)過剩而出現(xiàn)缺氧、徒 長等不健康生長等現(xiàn)象。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明一種金釵石斛種苗的組培方法實(shí)施例3接種時的初始狀態(tài)圖； 圖2為對比例1接種時的初始狀態(tài)圖； 圖3為本發(fā)明一種金釵石斛種苗的組培方法實(shí)施例3培養(yǎng)2周后的金釵石斛種苗的生長 狀態(tài)圖； 圖4為對比例1培養(yǎng)2周后的金釵石斛種苗的生長狀態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明： 實(shí)施例1: 一種金釵石斛種苗的組培方法，建立間歇式浸沒液體培養(yǎng)系統(tǒng)，包括以下步 驟： 步驟一、制備馬鈴薯汁液:選擇完好無腐爛的馬鈴薯塊莖，研磨或壓碎榨汁，過濾取汁 液，備用； 步驟二、MS培養(yǎng)液的配置與滅菌消毒： MS培養(yǎng)液的組分及組分用量為:MS、NAA1.0mg/L、馬鈴薯汁液50g/L、蔗糖30g/L和瓊脂 7g/L，調(diào)節(jié)pH值在5.70~6.00范圍內(nèi)，配置完成后，將MS培養(yǎng)液倒入試劑瓶中，然后將試劑 瓶轉(zhuǎn)移至濕熱高壓滅菌鍋內(nèi)，進(jìn)行加熱加壓滅菌，加熱溫度為121°C，壓力為0.1~l.OMPa， 滅囷20min后備用； 步驟三、間歇浸沒式生物反應(yīng)器的滅菌:利用濕熱滅菌法，將間歇浸沒式生物反應(yīng)器放 入濕熱高壓滅菌鍋內(nèi)，在溫度121°C、壓力l.OMPa條件下對間歇浸沒式生物反應(yīng)器進(jìn)行滅菌 20min后備用； 步驟四、金釵石斛腋芽的制備： 第一步:制備MS固體培養(yǎng)基:MS固體培養(yǎng)基的組分及組分用量為:MS、NAA1. Omg/L、馬鈴 薯汁液50g/L、蔗糖30g/L和瓊脂7g/L;調(diào)節(jié)pH值為5.70~6.00范圍內(nèi)，靜置，備用； 第二步:采用金釵石斛植株，用濃度為0.1%的新潔爾滅溶液浸泡金釵石斛植株30min， 然后用流動的水清洗60min;在無菌環(huán)境中，去除清洗后的金釵石斛植株的葉片，并用75%的 酒精浸泡30s，用無菌水清洗2次，再用濃度0.1%的升汞浸泡20min，最后再用無菌水清洗7 次； 第三步:將完成了第二步的金釵石斛植株切成若干莖段，每個莖段含有一個腋芽，將莖 段接種到MS固體培養(yǎng)基中，3~5d后取出，制得金釵石斛腋芽； 步驟五、接種:將MS培養(yǎng)液倒入間歇浸沒式生物反應(yīng)器中，然后將步驟四得到的金釵石 斛腋芽接種到間歇浸沒式生物反應(yīng)器中，每升MS培養(yǎng)液中接種80個金釵石斛腋芽； 步驟六、培養(yǎng):設(shè)定間歇浸沒式生物反應(yīng)器的相關(guān)參數(shù):浸沒頻率為12min/10h，即間歇 浸沒式生物反應(yīng)器工作12min后停止10h，然后再工作12min后再停止10h，如此重復(fù)，以下解 釋相同；培養(yǎng)時間定為90d;設(shè)定培養(yǎng)環(huán)境條件為:光照強(qiáng)度1500~1800LX，光照12h/d，溫度 為 25±1。(3。
[0016] 金釵石斛培養(yǎng)增殖系數(shù)為26.1，將種苗移栽3個月后，植株成活率96.0%，且植株生 長健康。
[0017] 實(shí)施例2: -種金釵石斛種苗的組培方法，建立間歇式浸沒液體培養(yǎng)系統(tǒng)，包括以 下步驟： 步驟一、制備馬鈴薯汁液:選擇完好無腐爛的馬鈴薯塊莖，研磨或壓碎榨汁，過濾取汁 液，備用； 步驟二、MS培養(yǎng)液的配置與滅菌消毒： MS培養(yǎng)液的組分及組分用量為:MS、NAAO. 7mg/L、馬鈴薯汁液150g/L、蔗糖30g/L，調(diào)節(jié) pH值在5.70~6.00范圍內(nèi)，配置完成后，將MS培養(yǎng)液倒入試劑瓶中，然后將試劑瓶轉(zhuǎn)移至濕 熱高壓滅菌鍋內(nèi)，進(jìn)行加熱加壓滅菌，加熱溫度為121°C，壓力為0.1~l.OMPa，滅菌20min后 備用； 步驟三、間歇浸沒式生物反應(yīng)器的滅菌:利用濕熱滅菌法，將間歇浸沒式生物反應(yīng)器放 入濕熱高壓滅菌鍋內(nèi)，在溫度121°C、壓力l.OMPa條件下對間歇浸沒式生物反應(yīng)器進(jìn)行滅菌 20min后備用； 步驟四、金釵石斛腋芽的制備： 第一步:制備MS固體培養(yǎng)基:MS固體培養(yǎng)基的組分及組分用量為:MS、NAA0.7mg/L、馬鈴 薯汁液150g/L、蔗糖30g/L、瓊脂7g/L;調(diào)節(jié)pH值為5.70~6.00范圍內(nèi)，靜置，備用； 第二步:采用金釵石斛植株，用濃度為1.0%的新潔爾滅溶液浸泡金釵石斛植株5min，然 后用流動的水清洗45min;在無菌環(huán)