一種酯酶phe21及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種醋酶P皿21及其編碼基因和 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性化合物是一類由相同原子組成，立體結(jié)構(gòu)互為鏡像的一類化合物，在生物學(xué) 和藥學(xué)性質(zhì)上具有較大的差異。如己比妥酸鹽S-(-)異構(gòu)體具有抑制神經(jīng)活動的作用，而R- (+ )異構(gòu)體卻具有興奮作用;苯并嗎啡燒的2個(gè)對映體都有鎮(zhèn)痛作用，但(-)的異構(gòu)體服用后 會成癒，而(+ )的異構(gòu)體則不會;R型的"反應(yīng)停"是孕婦用鎮(zhèn)痛藥和止痛藥，而S型的"反應(yīng) 停"對胎兒則有致崎作用;右旋甲狀腺素鋼可作為降血脂藥物應(yīng)用，但左旋體對屯、臟具有嚴(yán) 重的副作用;抗菌藥氧氣沙星的右旋體能損害肝、腎功能，但左旋的氧氣沙星藥效很高，且 毒性極小，其在各國上市后，深受人們的歡迎。
[0003] 手性化合物的合成主要有：（1)化學(xué)法，即利用對映體的物理和化學(xué)性質(zhì)的差異進(jìn) 行分離。通常有鹽析法、包結(jié)法W及組合拆分。其缺點(diǎn)是要求對映體之間的性質(zhì)差異要大， 適用的化合物不多。（2)色譜拆分，運(yùn)種方法是利用填料對手性對映體吸附性質(zhì)的差異來實(shí) 現(xiàn)，其缺點(diǎn)是設(shè)備昂貴，普及性較差。（3)合成法，通過設(shè)計(jì)反應(yīng)來進(jìn)行手性化合物的化學(xué)合 成。運(yùn)種方法缺點(diǎn)在于反應(yīng)過程通常比較劇烈，耗費(fèi)能量，而且反應(yīng)中使用大量有毒的有機(jī) 溶劑。
[0004] 醋酶化sterase，EC 3.1.1 .X)，是一種催化醋鍵水解和合成的酶的總稱。水解時(shí)， 其催化醋鍵產(chǎn)生甘油和脂肪酸;合成時(shí)，可將酸的簇基與醇的徑基脫水縮合，產(chǎn)物為醋類及 其他香味物質(zhì)。其來源非常廣泛，微生物、植物和動物中都有存在。醋酶作為生物催化劑多 數(shù)可作用非天然底物，而且可拆分的底物多，立體選擇性高，不需要輔助因子，是一種重要 的手性催化劑。
[000引光學(xué)純3-徑基下酸乙醋化皿)是精細(xì)化工中制備多種手性產(chǎn)品的關(guān)鍵中間體，應(yīng) 用十分廣泛。其中，（S)-巧皿)是薰衣草醇、食菌甲誘醇、核球殼菌、格哈菌素、卡包霉素和灰 綠霉素前體等天然產(chǎn)物的手性源；（R)-巧皿)則是合成手性藥物的重要中間體，如β-內(nèi)酷胺 酶抑制劑，1^-肉堿、亞胺培南等碳青霉締類抗生素等。但由于生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)成本方面的原 因，在我國絕大多數(shù)的合成藥物仍然還是W外消旋體形式出現(xiàn)的。
[0006] 生物酶具有立體位點(diǎn)區(qū)域和底物的高度專一性，利用酶促反應(yīng)催化具有反應(yīng)條件 溫和、位點(diǎn)選擇性強(qiáng)、副反應(yīng)少、光學(xué)純度高W及環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，因此開發(fā)具有光學(xué)選 擇性的醋酶具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中脂肪酶價(jià)格昂貴、生產(chǎn)技術(shù)受到制約的不足，提供一種新 的醋酶Ρ肥21及其編碼基因和應(yīng)用。
[000引本發(fā)明從一株海洋假單胞菌（Pseudomonadaceae oryz;Lhabitans)HUP022中開發(fā) 了 一種新的醋酶P皿21及其編碼基因 P皿21，構(gòu)建了含有P皿21的重組表達(dá)載體和基因工程 菌，培養(yǎng)基因工程菌后獲得醋酶PHE21，其可應(yīng)用于催化醋類反應(yīng)和制備(5)-3-?基下酸乙 醋。
[0009] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種醋酶P肥21，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種編碼所述的醋酶P肥21的醋酶基因 P肥21。
[0011] 優(yōu)選，所述的醋酶基因 P肥21的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 本發(fā)明還提供一種含有所述的醋酶基因 P肥21的重組表達(dá)載體。所述的表達(dá)載體， 優(yōu)選為祀T28a( + )載體。
[0013] 本發(fā)明還提供一種含有所述的醋酶基因 P肥21的基因工程菌。所述的基因工程菌， 優(yōu)選為大腸桿菌化21 (DE3)。
[0014] 本發(fā)明的第Ξ個(gè)目的是提供所述的醋酶P皿21在催化醋類水解、醋化或轉(zhuǎn)醋化反 應(yīng)中的應(yīng)用。
[0015] 優(yōu)選，所述的醋酶P肥21在催化拆分（±)-3-徑基下酸乙醋反應(yīng)得到（5)-3-?基下 酸乙醋中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述的醋酶PHE21在耐受鋼鹽、Co2\K+、Zn 2\正戊醇 和/或Triton-XlOO環(huán)境下進(jìn)行催化的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明的醋酶基因 PHE21來自深海樣品中篩選得到的一株海洋假單胞菌 (Pseudomonadaceae oryz化abitans)皿P022,保存在中國科學(xué)院南海海洋研究所實(shí)驗(yàn)室。 本發(fā)明用生物信息學(xué)分析的方法，從基因組測序的假單胞菌（Pseudomonadaceae oryz化abitans)皿P022中篩選得到醋酶基因 P肥21，全長為966bp(從起始密碼子到終止密 碼子），編碼321個(gè)氨基酸。通過克隆編碼醋酶P肥21的醋酶基因 P皿21并將其連接表達(dá)載體 祀T-28a( + )后轉(zhuǎn)化大腸桿菌化2UDE3)，培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)后，得到了重組表達(dá)的醋酶P肥21。 醋酶P皿21可用于制備（5)-3-?基下酸乙醋，利用重組表達(dá)的醋酶P皿21作為催化劑，制備 得到了光學(xué)純度大于99%的（5)-3-?基下酸乙醋。醋酶P皿21在生物化工和生物醫(yī)藥等領(lǐng) 域具有非常大的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[001引圖1是不同側(cè)鏈長度的對硝基苯酪醋對醋酶P肥21酶活的影響。
[0019] 圖2是醋酶PHE21的最適抑及抑穩(wěn)定性。其中，A為最適抑曲線圖，B為抑穩(wěn)定性曲線 圖。
[0020] 圖3是醋酶P肥21的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性。其中，A為最適反應(yīng)溫度曲線圖，B 為溫度穩(wěn)定性曲線圖。
[0021 ] 圖4是不同濃度NaCl對醋酶P肥21酶活性影響。
[0022] 圖5是醋酶P皿21拆分（± )-3-徑基下酸乙醋反應(yīng)GC圖。A為樣品（± )-3-徑基下酸 乙醋氣相圖，B為醋酶PHE21拆分（± )-3-徑基下酸乙醋反應(yīng)1.化后的氣相圖，其中S代表 (5)-3-?基下酸乙醋，R代表(10-3-?基下酸乙醋。
[0023] 圖6是醋酶P肥21的蛋白表達(dá)純化情況。其中，Μ為蛋白Marker，1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的 含有祀T-28a( + )-P肥21的大腸桿菌BL21(DE3)，2為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含有祀T-28a( + )-P肥21的 大腸桿菌化21(DE3)，3為儀柱穿透液，4為Μ柱純化后得到的醋酶P肥21，5為經(jīng)過脫鹽柱后 的醋酶P肥21。
【具體實(shí)施方式】
[0024] W下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0025] 下列實(shí)例中未具體注明的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行，或按照所用產(chǎn)品生 產(chǎn)廠商的使用說明。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑 得到。
[0026] 本發(fā)明的醋酶基因 PHE21來自深海樣品中篩選得到的一株海洋假單胞菌 (Pseudomonadaceae oryz;Lhabitans)HUP022,該菌保存在中國科學(xué)院南海海洋研究所實(shí)驗(yàn) 室。
[0027] 實(shí)施例1:醋酶基因 P肥21引物設(shè)計(jì)及開放閱讀框邊界確定
[0028] 提取假單胞菌（Pseudomonadaceae oryz;Lhabitans)冊P022的基因組DNA，經(jīng)測序 驗(yàn)證無誤后，利用生物信息學(xué)手段對基因組進(jìn)行注釋，分析其中的醋酶基因，確定了其中醋 酶基因 P肥21的開放閱讀框，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，全長為966bp(從起始密碼 子到終止密碼子），其編碼的醋酶P肥21的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共321個(gè)氨基酸。 根據(jù)分析得到的醋酶基因 P Η E 2 1序列，設(shè)計(jì)引物如下：正向引物：5 / - CACGAATTCATGCCCGACGTCTTCGCGCG-3^，下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)；反向引物：5'- CCGCTCGAGTTAGGCGGCCTGCTGCAGATGC-3^，下劃線部分為化〇 I酶切位點(diǎn)。
[0029] 實(shí)施例2:醋酶基因 P肥21的克隆及載體構(gòu)建
[0030] 2.1PCR 擴(kuò)增
[0031 ] 將實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物(正向引物:5^ -CACGAATTCATGCCCGACGTCTTCGCGCG-3^，反向 引物：5^ -CCGCTCGAGTTAGGCGGCCTGCTGCAGATGC-3^ )送至上海生物工程有限公司合成引物， 合成的引物使用TE稀釋到ΙΟμΜ，提取假單胞菌(Pseudomonadaceae oryzihabitans)HUP022 的總DM作為DM模板，建立如表1所示反應(yīng)體系：
[0032] 表1PCR反應(yīng)體系
[0033]
[0034] 使用W下PCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增醋酶基因 P皿21: a. 94°C變性3min; b. 94°C變性30s，55 ~65°C退火0.5min，72°C延伸Imin，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；c. 72°C延伸lOmin，冷卻到10°C。
[003引將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中，120V電壓下電泳20min，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀 察?；厥?66bp左右的條帶。PCR產(chǎn)物按照膠回收試劑盒的方法進(jìn)行回收，使用20化無菌水洗 脫，得到純化回收的PCR產(chǎn)物。
[0036] 2.2 酶切
[0037] 將純化回收的PCR產(chǎn)物使用W下體系進(jìn)行雙酶切，酶切時(shí)間化。酶切體系為:EcoRI 2化，XhoI2化，DNA<0.3yg，滅菌的雙蒸水加至30化。酶切后純化回收得到經(jīng)過雙酶切的PCR 產(chǎn)物。
[0038] 質(zhì)粒祀T-28a( + )的雙酶切:挑取含有質(zhì)粒祀T-28a( + )的大腸桿菌D冊α單菌落，過 夜培養(yǎng)。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用EcoR巧肋h(yuǎn)oi按W下體系雙酶切，酶切時(shí)間Ih。酶 切體系為:EcoRI化L，趾〇1化L，質(zhì)粒DNA<lyg，滅菌的雙蒸水加至20化。酶切后純化回收得 到經(jīng)過雙酶切的祀T-28a (+)載體。
[0039] 上述雙酶切使用的限制性內(nèi)切酶為化ermo公司生產(chǎn)的快速內(nèi)切酶，酶切后的純化 回收使用核酸純化回收試劑盒(Magen，Hipure Gel化re DNA Micro Kit),質(zhì)粒提取試劑 盒為上海捷瑞生物工程有限公司的質(zhì)粒小量制備試劑盒，操作方法按其使用說明書。
[0040] 2.3 連接
[0041 ]將經(jīng)過雙酶切的PCR產(chǎn)物和祀T-28a( + )載體按照3:1的摩爾比例進(jìn)行連接。連接使 用的T4連接酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，連接使用的酶量為抓/5化連接體系，連 接溫度為25°C，連接時(shí)間30min。由此得到連接產(chǎn)物。
[004引2.4轉(zhuǎn)化及篩選
[0043] 取扣L連接產(chǎn)物于50化大腸桿菌D冊a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，后于42°C水浴鍋 熱激90s，冰浴2min后加入50化L LB液體培養(yǎng)基，37°C20化pm轉(zhuǎn)速下，解育培養(yǎng)化。取一定量 的菌液涂布于含10化L/mL卡那霉素的LB平板，培養(yǎng)20h后挑選單菌落。單菌落于5mL LB培養(yǎng) 基中過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切片段與基因大小相同的即為陽性克隆。
[0044] 2.5基因核巧酸序列測定
[004引將篩選的正確陽性克隆送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與醋 酶基因 P肥21核巧酸序列進(jìn)行比對，確認(rèn)是將醋酶基因 P皿21(其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1 所示)插入到祀T-28a( + )質(zhì)粒中，結(jié)果完全