Il-31在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及再生醫(yī)學(xué)及基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及IL-31在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞增殖 和分化中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)最早由Pittenger等分離于骨髓， 后來在廝帶和脂肪等組織中也能分離得到。MSCs具有如下優(yōu)點(diǎn):MSCs可塑性很高，在體內(nèi)外 誘導(dǎo)條件下能分化成軟骨、骨、肌肉、肌腫、初帶和脂肪等組織;MSCs具有歸巢能力，可W在 生物體內(nèi)向受損和炎癥部位集中；MSCs能誘導(dǎo)或增加新血管的形成;MSCs缺乏顯著的免疫 原性，防止自身免疫；另外MSCs分離方便。近幾年來，再生醫(yī)學(xué)快速發(fā)展，由于胚胎干細(xì)胞用 于細(xì)胞治療受倫理道德的影響，并且有致癌的風(fēng)險(xiǎn)，所WMSCs取代胚胎干細(xì)胞用于細(xì)胞治 療已經(jīng)成為一種趨勢(shì)。但MSCs在再生醫(yī)學(xué)和組織工程應(yīng)用中也存在缺陷，例如：隨著細(xì)胞傳 代次數(shù)的增加，MSCs的形態(tài)發(fā)生變化，增殖能力和多向分化潛能等都逐漸下降。如何提高 MSCs的增殖能力和多向分化潛能已經(jīng)成為急需解決的難題，解決運(yùn)些問題將對(duì)MSCs應(yīng)用于 再生醫(yī)學(xué)和組織工程產(chǎn)生重大影響。最近的研究發(fā)現(xiàn)，多能性基因0ct4，Sox2和化nog等對(duì) MSCs的增殖和多向分化潛能起促進(jìn)作用，抑制運(yùn)些基因的表達(dá)能對(duì)MSCs增殖和多向分化潛 能產(chǎn)生抑制作用。通過基因工程的手段提高M(jìn)SCs增殖和多向分化潛能已經(jīng)成為研究的熱 點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供IL-31在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞 增殖和分化中的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：化-31在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化中 的應(yīng)用，基于本發(fā)明發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IL-31能促進(jìn)MSCs的增殖和成脂或成骨分化潛能。
[0005] 所述的IL-31的氨基酸序列如下所示：
[0006] MA甜SGPSTSVLFLFiXLGGWLASHTLPV化LRPSDDVQKIVE化QSLSKMLL邸VE邸KG化VSQNYTLrcLSPDA QPP順I(yè)服PAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIFQDA陽TNISVPTDT肥CKRFILTISQQF沈CMDLALKS LTSGAQQATT。
[0007]所述的IL-31的編碼核巧酸序列如下所示：
[000引
ACACCCATGAATGTAAACGCTTCATCCTGACTATTTCTCAACAGTTTTCAGAGTGCATGGACCTCGCACTAAAATCA TTGACCTCTGGAGCCCAACAGGCCACCACTTAAo
[0009] 所述的調(diào)控為正調(diào)控，即促進(jìn)作用。
[0010] 所述的IL-31在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化中的應(yīng)用，是將IL-31蛋白或能表達(dá) 比-31的核酸序列制備為促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化的制劑。
[0011] 所述的核酸序列優(yōu)選為DNA序列。
[0012] 所述的IL-31在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化中的應(yīng)用，是WIL-31基因?yàn)殪胛?點(diǎn)，將能促進(jìn)IL-31基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的物質(zhì)制備為促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化的制劑。
[0013] 所述的物質(zhì)優(yōu)選為0ct4轉(zhuǎn)錄因子。
[0014] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:本發(fā)明是基于本發(fā)明發(fā)明人首次 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IL-31能促進(jìn)MSCs的增殖和成脂或成骨分化潛能得到的成果。本發(fā)明將含有IL- 31、sh比-31、0(3*4、3}1〇(3*4和空質(zhì)粒的慢病毒分別轉(zhuǎn)染至15〔3中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染0(3*4或 比-31質(zhì)粒都能促進(jìn)MSCs的增殖和成脂或成骨分化潛能，而轉(zhuǎn)染sh0ct4或shIL-31都能抑制 MSCs的增殖和成骨或成脂分化潛能。0ct4促進(jìn)MSCs的增殖和成骨或成脂分化潛能已經(jīng)被報(bào) 道，在本研究中被作為陽性對(duì)照。本發(fā)明掲示了細(xì)胞因子IL-31對(duì)MSCs的自我更新和多向分 化潛能起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用提供了理論依據(jù)，為將MSCs用于再生醫(yī)學(xué)和組織工程奠定了必要 的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0015] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中將含有0ct4、比-31、sh0ct4、shIL-31的慢病毒重組載體和 作為對(duì)照的慢病毒空質(zhì)粒分別感染UC-MSCs后，采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-31對(duì)UC-MSCs 增殖影響的結(jié)果圖；其中，沖<0.01相對(duì)于不同天數(shù)的空質(zhì)粒對(duì)照。
[0016] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中將含有sh0ct4、sh化-31的慢病毒重組載體和作為對(duì)照的 慢病毒空質(zhì)粒分別感染UC-MSCs后，檢測(cè)細(xì)胞因子IL-31對(duì)UC-MSCs的成脂或成骨分化作用 的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但不用來限制本發(fā)明的范 圍。若未特別指出，實(shí)施例均參照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，或者參照試劑盒制造廠商的說明書進(jìn)行。 實(shí)施例中所用到的工程菌、細(xì)胞株均為商業(yè)化的菌株或細(xì)胞株。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制 備按照《分子克隆》進(jìn)行制備。
[001引實(shí)施例1采用MTT方法檢巧U比-31對(duì)UC-MSCs增殖的影響。
[0019] (1)比-31和shIL-31慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0020] 1)比-31基因引物的設(shè)計(jì)。
[0021] 用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增IL-31基因開放閱讀框的引物，引物兩端酶切位點(diǎn)分 別為BamH I和化nd虹，引物由上海生工生物有限公司合成，引物的序列如下：
[0022] 比-31 正向引物：5' -TAGGATCCTCCCACACGTTGCCCGT-3' ；
[0023] 比-31 反向引物：5' -GCAAGCTTAGTGGTGGCCTGTTG-3'。
[0024] 2)擴(kuò)增 IL-31 基因。
[002引 W人Th2細(xì)胞(購自上海哈靈生物科技有限公司）的cDNA為模板擴(kuò)增比-31基因。
[0026] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：
[0030] 3)比-31基因的回收。
[0031] 將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并用Gel Extraction Kit(Omega)對(duì)PCR 產(chǎn)物回收，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書，略有改動(dòng)，步驟如下：
[0032] A、用手術(shù)刀片切下含有目的片段的瓊脂糖膠，盡量切除DNA片段周圍多余的瓊脂 糖膠W減少凝膠體積。
[0033] B、將凝膠塊置于1.5ml微量離屯、管中。加入與凝膠等體積的Binding buffeH X p2)。將混合物置于50-55°C，7min，直到凝膠完全溶解。
[0034] C、將化Bind DNA離屯、柱置于2ml收集管中，將70化1 DNA/瓊脂糖溶液加至化Bind DM離屯、柱，室溫下，10，000 X g離屯、Imin。
[00巧]D、棄去液體，將化Bind DNA離屯、柱重新放回相同的收集管，向化Bind DNA離屯、柱 中加入300μ1 Binding buffe;r(Xp2)，室溫下，10,000Xg離屯、Imin，洗HiBind DNA離屯、柱， 棄去流出液并重新使用收集管。
[0036] E、加入70化1無水乙醇稀釋的洗涂緩沖液洗涂化Bind DNA離屯、柱，室溫下10,000 Xg離屯、Imin。
[0037] F、棄去液體并最大轉(zhuǎn)速空柱離屯、2minW干燥離屯、柱基膜。
[0038] G、將化Bind DNA離屯、柱置于干凈的1.5ml離屯、管，向離屯、柱基膜中間滴加15-3化1 洗脫緩沖液，室溫放置Imin后W13，OOOg離屯、Imin洗脫DNA。
[0039] 4)比-31基因表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0040] 將回收的比-31 DNA片段和pGL3-Basic真核表達(dá)載體(Promega公司）經(jīng)過BamH巧口 化nd虹雙酶切處理，用T4 DNA連接酶將雙酶切后的比-31 DNA片段克隆至經(jīng)雙酶切的pGL3- Basic真核表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)染大腸桿菌D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞，使用正向引物和反向引物對(duì)克 隆進(jìn)行篩選，將篩選得到的陽性克隆送去測(cè)序，DNA測(cè)序表明序列正確，命名為pGL3-比-31。 [0041 ] 5)比-31慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0042] A、使用BamH I單酶切pGL3-比-31及慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreenl (購買于漢恒 生物科技有限公司）；
[0043] B、使用T4 DNA連接酶將化-31 DNA片段亞克隆入BamH I單酶切線性化的慢病毒轉(zhuǎn) 移質(zhì)?；疺X-IRES-ZsGreenl，然后轉(zhuǎn)染大腸桿菌D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞，通過限制性內(nèi)切酶化nd 虹單酶切初步鑒定重組質(zhì)粒，將鑒定正確的克隆送上海生工生物有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè) 序正確的克隆命名為pLVX-比-31-ZsGreenl;大量提取質(zhì)粒W備轉(zhuǎn)染用。
[0044] 6)sh比-31慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0045] 在上海生工生物有限公司合成比-31 shRNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的DNA序列（含有趾0巧口 化〇1酶切位點(diǎn)），使用趾〇1單酶切比-31 shRNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的DNA序列及慢病毒載體pLVX- IRES-ZsGreenl，使用T4 DNA連接酶將化-31 shRNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的DM序列克隆入線性化 的慢病毒質(zhì)粒載體 pLVX-IRES-ZsGreenl，命名為pLVX-sh化-31-ZsGreenl。化-31 shRNA 頸 環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的DNA序列如下：
[0046] 5 '-CTCGAGAGAGGGCTACCTGGAGACACCATTG-3 '。
[0047] (2)0ct4和sh0ct4慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(在本實(shí)驗(yàn)中做為對(duì)照組）。
[004引l)0ct4基因引物的設(shè)計(jì)。
[0049] 用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增0ct4基因開放閱讀框的引物，引物兩端酶切位點(diǎn)分別 為化〇1和化〇1。引物由上海生工生物有限公司合成，擴(kuò)增0ct4的引物序列如下：
[0050] 0ct4正向引物：5'-CCGCTCGAGAGGATGGCGGGACACCTGGCTT-3' ；
[0化 1 ] 0ct4反向引物：5'-CATGCCATGGAAGGGCAGGCACCTCAGTTTG-3'。
[0化2] 2)擴(kuò)增0ct4基因。
[0053] W人胚胎干細(xì)胞的cDNA(購自上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司）為模板擴(kuò)增0ct4基 因。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件同上，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：
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