一種用于神經(jīng)損傷修復(fù)的神經(jīng)支架、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于神經(jīng)再生生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于神經(jīng)損傷修復(fù)的神經(jīng)支架、其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)系統(tǒng)損傷主要包括脊髓損傷、腦損傷、周?chē)窠?jīng)損傷，后果嚴(yán)重，其治療一直是研究熱點(diǎn)。神經(jīng)系統(tǒng)損傷發(fā)病率隨著經(jīng)濟(jì)及交通的發(fā)展逐年增高，已經(jīng)越來(lái)越引起臨床醫(yī)生及科研學(xué)者的重視。
[0003]神經(jīng)系統(tǒng)一旦發(fā)生病變，恢復(fù)程度有限，治療效果欠佳，長(zhǎng)久以來(lái)，神經(jīng)系統(tǒng)疾病在經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的治療后，仍有一部分仍留有嚴(yán)重的后遺癥，因此，選擇一種外源性的物質(zhì)替代已經(jīng)徹底損傷的組織，促使殘存的神經(jīng)組織再生，成為攻克神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要思路。
[0004]伴隨著生物組織工程的發(fā)展，組織工程在神經(jīng)損傷治療中具有重要的地位。膠原材料來(lái)源豐富并且具有諸多優(yōu)點(diǎn)，比如，較好的可降解性、生物相容性、其低免疫性及可修飾性，而被廣泛應(yīng)用于組織工程。研究表明，膠原蛋白可以促進(jìn)神經(jīng)元的分化;體外實(shí)驗(yàn)研究顯示，膠原蛋白可以促使背根神經(jīng)節(jié)的軸突再生，因此，膠原可作為營(yíng)養(yǎng)因子或者藥物的載體，從而在組織工程中起到協(xié)同的應(yīng)用效果，被廣泛應(yīng)用在神經(jīng)再生工程中。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)膠原材料時(shí)，通常膠原組織需要溶解于醋酸中，若需要得到固態(tài)膠原材料，通常需要堿性溶液將醋酸中和，而中和后生成的鹽分混雜在溶液中，因而需要進(jìn)一步通過(guò)透析除去其中鹽分，因此，目前使用的膠原材料生產(chǎn)方法復(fù)雜，成本較高。
[0006]然而，單純使用載體材料不能有效修復(fù)神經(jīng)損傷。近些年，研究神經(jīng)干細(xì)胞逐漸成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的熱點(diǎn)，在神經(jīng)再生工程中，修復(fù)損傷的組織時(shí)，需要在膠原材料制成的載體上負(fù)載起到修復(fù)作用的神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞是具有自我更新能力與多向分化潛能的一類(lèi)細(xì)胞，具有可塑性能，它可完成特定的神經(jīng)功能，分化成體內(nèi)特定神經(jīng)功能的細(xì)胞，具有定向分化潛力。神經(jīng)干細(xì)胞移植術(shù)是將體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞，通過(guò)手術(shù)方式移植到顱內(nèi)某部位達(dá)到修復(fù)、重建神經(jīng)功能的過(guò)程。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)后分化、增殖和定向迀移，并與人體自身的神經(jīng)細(xì)胞整合，最終達(dá)到修復(fù)受損的神經(jīng)，重建部分或者完全的神經(jīng)功能。
[0007]在神經(jīng)再生工程中，移植入宿主體內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞能向神經(jīng)系統(tǒng)所在病變部位趨化、游走并且聚集，能夠生存、增殖分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，從而促進(jìn)患者缺失功能的恢復(fù)，然而，前期的研究顯示，神經(jīng)干細(xì)胞在異體移植后由于免疫反應(yīng)等，存活率很低，因此，神經(jīng)干細(xì)胞的利用率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種用于神經(jīng)損傷修復(fù)的神經(jīng)支架、其制備方法及應(yīng)用，取材方便，制備方法簡(jiǎn)單，可以獲得根據(jù)不同需要塑造成不同形狀的神經(jīng)支架，提高神經(jīng)干細(xì)胞在損傷局部的數(shù)量，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)損傷的修復(fù)作用，將該神經(jīng)支架用于填補(bǔ)神經(jīng)組織缺損及橋接神經(jīng)斷端，引導(dǎo)神經(jīng)生長(zhǎng)，從而促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)及功能恢復(fù)，并且具有良好的穩(wěn)固性。
[0009]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:
[0010]—種用于神經(jīng)損傷修復(fù)的神經(jīng)支架，包括膠原支架、培養(yǎng)在膠原支架上的神經(jīng)干細(xì)胞、以及由肝素固定在膠原支架上的生長(zhǎng)因子，所述的生長(zhǎng)因子具有肝素結(jié)合域。
[0011]本發(fā)明所述用于神經(jīng)損傷修復(fù)的神經(jīng)支架的制備方法，包括如下步驟:
[0012]I)配制膠原溶液
[0013]獲取動(dòng)物膠原組織，將其溶解于0.05?0.1 %冰醋酸-PBS(v/v)中，配制成膠原溶液；
[0014]2)凍干、滅菌
[0015]將膠原溶液倒入模具中，再將模具放入液氮冷凍，然后用凍干機(jī)凍干，凍干時(shí)間為8?12小時(shí)，得到膠原海綿，再進(jìn)行滅菌處理;所述的膠原海綿為三維膠原材料，孔徑為30?200μηι；
[0016]3)交聯(lián)、洗滌
[0017]將肝素溶解于交聯(lián)溶液中，將滅菌的膠原海綿浸沒(méi)于含肝素的交聯(lián)溶液中進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)溫度30?40°C，交聯(lián)時(shí)間3?4小時(shí)，交聯(lián)結(jié)束后用磷酸緩沖鹽溶液洗滌4?8小時(shí)，再用去離子水洗滌4?8小時(shí)；
[0018]其中，所述的交聯(lián)溶液為濃度為I?25mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和I?12.5mM的N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液；
[0019]4)成型
[0020]將交聯(lián)后的膠原海綿吸去水分，浸沒(méi)于生長(zhǎng)因子溶液中成型，成型溫度30?40°C，成型時(shí)間0.5?2小時(shí)，獲得膠原支架;其中，所述的生長(zhǎng)因子具有肝素結(jié)合域；
[0021]5)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞
[0022]將神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)在步驟4)得到的膠原支架上，獲得所述的神經(jīng)支架。
[0023]進(jìn)一步，步驟I)中獲得的膠原溶液中膠原的濃度為5?20mg/ml。
[0024]優(yōu)選地，步驟2)中利用電子束輻照對(duì)膠原海綿進(jìn)行滅菌處理，處理?xiàng)l件為6?12kGy 60Coo
[0025]進(jìn)一步，步驟3)中含肝素的交聯(lián)溶液中，肝素的濃度為2?4mg/mL。
[0026]又進(jìn)一步，步驟4)所述的生長(zhǎng)因子溶液中生長(zhǎng)因子的濃度為50?500yg/mL。
[0027]優(yōu)選地，步驟4)中所述的生長(zhǎng)因子為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。
[0028]進(jìn)一步，步驟5)中將神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)Hoechst標(biāo)記后，再培養(yǎng)在膠原支架上，神經(jīng)干細(xì)胞的個(gè)數(shù)為5?1X 15個(gè)，所獲得的神經(jīng)支架為神經(jīng)導(dǎo)管或圓形、橢圓形、方形或不規(guī)則海綿狀神經(jīng)支架。
[0029]本發(fā)明的0.05?0.1 %冰醋酸_PBS( v/v)是指在PBS(磷酸緩沖鹽溶液)中含有體積分?jǐn)?shù)為0.05?0.1 %的冰醋酸。
[0030]本發(fā)明的神經(jīng)支架應(yīng)用于神經(jīng)損傷修復(fù)，特別是用于修復(fù)脊髓損傷或修復(fù)面神經(jīng)損傷，除適用于神經(jīng)損傷修復(fù)外，也可用于修復(fù)周?chē)窠?jīng)損傷及其他組織損傷。
[0031]本發(fā)明制備的膠原海綿為三維膠原材料，可調(diào)節(jié)其孔徑在30?200μπι，以用于細(xì)胞生長(zhǎng)和組織修復(fù)，并且可以通過(guò)模具塑造為不同的形狀以適于不同的神經(jīng)損傷修復(fù)。
[0032]本發(fā)明使用生長(zhǎng)因子與神經(jīng)干細(xì)胞共同促進(jìn)神經(jīng)再生，提高神經(jīng)干細(xì)胞在損傷局部的數(shù)量，增強(qiáng)了神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)損傷的修復(fù)作用，并且，生長(zhǎng)因子自身能促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)。
[0033]本發(fā)明的神經(jīng)支架中，將肝素交聯(lián)在膠原海綿上，并通過(guò)肝素對(duì)具有肝素結(jié)合域的生長(zhǎng)因子的高親和力，將生長(zhǎng)因子固定在膠原海綿上，以控制生長(zhǎng)因子的釋放速度，防止生長(zhǎng)因子擴(kuò)散，避免生長(zhǎng)因子因體液沖刷后大量擴(kuò)散而造成的流失，同時(shí)，固定在膠原海綿上的生長(zhǎng)因子一方面自身能更有效的促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)，另一方面能給神經(jīng)干細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)或促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，提高神經(jīng)干細(xì)胞在損傷局部的數(shù)量，增強(qiáng)了神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)損傷的修復(fù)作用，與神經(jīng)干細(xì)胞共同促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)。
[0034]本發(fā)明的神經(jīng)支架中，生長(zhǎng)因子通過(guò)肝素固定后不易擴(kuò)散，因此能減少因擴(kuò)散帶來(lái)的副作用，固定的生長(zhǎng)因子自身能在治療局部形成有效濃度，能促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)。
[0035]當(dāng)生長(zhǎng)因子為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)時(shí)，bFGF在胚胎發(fā)育過(guò)程中能促進(jìn)中胚層和神經(jīng)內(nèi)胚層細(xì)胞的大量增殖，而且在不同的增殖和分化過(guò)程中起著調(diào)節(jié)作用。將堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子加在神經(jīng)橫斷傷的近端能夠防止損傷后背根神經(jīng)節(jié)中感覺(jué)神經(jīng)元的死亡。除此之外，在損傷的部位，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子能夠促進(jìn)軸突再生和血管再生，促進(jìn)再生的神經(jīng)纖維通過(guò)神經(jīng)缺損的近遠(yuǎn)端。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)修復(fù)，神經(jīng)干細(xì)胞直接用于周?chē)窠?jīng)損傷處能分化為施萬(wàn)細(xì)胞狀的細(xì)胞，能夠分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)再生，本發(fā)明將bFGF通過(guò)肝素固定在神經(jīng)支架中，控制其釋放速度。
[0036]除此之外，固定的bFGF能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和維持神經(jīng)干細(xì)胞活性，而神經(jīng)干細(xì)胞也能有效地促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)，因此，在本發(fā)明神經(jīng)支架中固定的bFGF和神經(jīng)干細(xì)胞能起到協(xié)同作用，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，提高神經(jīng)干細(xì)胞在損傷局部的數(shù)量，增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)損傷的修復(fù)作用，共同促進(jìn)神經(jīng)損傷后的修復(fù)，因此，本發(fā)明含bFGF和神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)支架能有效促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。
[0037]本發(fā)明通過(guò)使用凍干機(jī)將溶于醋酸的膠原溶液直接凍干，得到膠原海綿，其為生長(zhǎng)因子和神經(jīng)干細(xì)胞的載體，采用凍干后對(duì)其進(jìn)行交