一種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域的治療用血液制品，特別是涉及一種呼吸道合胞病毒人 免疫球蛋白及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 呼吸道合胞病毒(RSV)屬副粘病毒科的肺炎病毒屬，病毒顆粒呈不規(guī)則的表面粗 糙的球形或絲狀，直徑約300_500mn，表面有脂蛋自組成的包膜，包膜內(nèi)有直徑13.5nm的螺 旋樣核衣殼，螺距6.5MURSV是2歲以下嬰幼兒細(xì)支氣管炎和病毒性肺炎的主要病原之一， 并可誘發(fā)哮喘或使哮喘病情加重，也是老年慢性支氣管炎病情加重和免疫功能低下者下呼 吸道感染的重要病因。我國北方多見于冬春季，南方多見于夏秋季，常同氣溫驟降有聯(lián)系， 一旦氣溫上升，發(fā)病率即見下降。每年流行季節(jié)往往與嬰幼兒下呼吸道感染發(fā)病率驟增的 時(shí)間一致，當(dāng)流行時(shí)，毛細(xì)支氣管炎和肺炎在嬰幼兒中的發(fā)病率也增高。我國RSV感染有以 下特點(diǎn)：主要在嬰兒中流行，1歲以下的嬰兒發(fā)病率最高，隨著年齡增大發(fā)病率下降，常出現(xiàn) 流行性喘憋性肺炎，發(fā)病急、喘憋重;醫(yī)源性感染增多。嚴(yán)重感染與宿主有關(guān)的危險(xiǎn)因素有 早產(chǎn)、年齡6個(gè)月以下、慢性肺疾患、先天性心臟病;環(huán)境因素有貧窮、人□密集、營養(yǎng)差、吸 煙環(huán)境;增加感染頻率的因素有年齡小、多胎、特應(yīng)性家族史、父母缺乏教育、住房擁擠、同 胞中有較大學(xué)齡兒、缺乏母乳喂養(yǎng)、日間托送、被動(dòng)吸煙、9-12月份從新生兒重癥監(jiān)護(hù)室出 院等。RSV感染病死率為1 %，伴先天性心臟病、慢性肺疾患時(shí)病死率分別升至3.4%、3.5%。 但是到目前為止，國內(nèi)對(duì)RSV感染的預(yù)防和治療既沒有安全有效的疫苗，也沒有特效藥，國 外治療RSV感染常用RSV特異性免疫球蛋白（RSV-IVIG)和RSV單克隆抗體Palivizmuab。由于 進(jìn)口RSV-IVIG及Palivizmuab價(jià)格昂貴，因此研制國產(chǎn)RSV-IVIG有極大的實(shí)用價(jià)值和臨床 意義。
[0003] 但是由于人免疫球蛋白制備過程中對(duì)于原料選擇以及制備條件的要求比較苛刻， 所以目前的人免疫球蛋白普遍存在效率低、性質(zhì)不穩(wěn)定等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種有效治療呼吸道合胞病毒重癥感染的人免 疫球蛋白及其制備方法，使其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，且產(chǎn)品高效、安全、可靠。
[0005] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
[0006] 本發(fā)明提供一種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白，呼吸道合胞病毒中和抗體效價(jià) 大于等于1:900。
[0007] 所述免疫球蛋白與正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀線為IgG。免疫球蛋白的 純度為總蛋白的99%~99.8%。所述免疫球蛋白的單體和二聚體之和達(dá)到99%~99.8%， PKA<30IU/mL，ACA<45%。
[0008] 其中，PKA指激肽釋放酶原激活劑，ACA指抗補(bǔ)體活性。
[0009] 在制備該抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白時(shí)，原料血漿為呼吸道合胞病毒抗體效 價(jià)不低于1:200的血漿。
[0010] 本發(fā)明所述抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白可以制成任意劑型，優(yōu)選的劑型為液 體制劑或凍干制劑。
[0011] 本發(fā)明抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白可以用于治療呼吸道合胞病毒重癥感染， 特異性好、高效、穩(wěn)定、安全、可靠、保質(zhì)期長等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0012] 本發(fā)明還提供一種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白制備方法，包括以下步驟：
[0013] 1)用中和試驗(yàn)法篩選出呼吸道合胞病毒不低于1:200的中和抗體效價(jià)滴度的原料 血漿；
[0014] 2)以篩選后的所述血漿原料制備混合血漿供試品，所述混合血漿中呼吸道合胞病 毒中和抗體效價(jià)滴度不低于1:500;
[0015] 3)將所述混合血漿供試品采用低溫乙醇?jí)簽V法分離結(jié)合層析法純化生產(chǎn)人免疫 球蛋白，生產(chǎn)操作壓力為0.1~0.2MPa，包括從血漿中分離組分II+III沉淀、從組分II+III 中分離組分II、層析、超濾、病毒滅活、配置、分裝得到成品。
[0016] 進(jìn)一步，步驟(1)所述中和試驗(yàn)法具體步驟包括如下：
[0017] ⑷樣品稀釋：
[0018] 血漿樣本用細(xì)胞維持液預(yù)先進(jìn)行1:4預(yù)稀釋后，56°C滅活30分鐘，后繼續(xù)10倍稀 釋，即最終1:40倍稀釋的樣品液；
[0019] 打開足夠量的96孔細(xì)胞板，標(biāo)明病毒回滴用板和樣品試驗(yàn)板，并在各樣品試驗(yàn)板 蓋上標(biāo)明該板試驗(yàn)樣本號(hào)、病毒性型號(hào)和代次；
[0020] 在樣品試驗(yàn)板的各樣品孔中加入4〇yL細(xì)胞維持液，病毒回滴孔與陰性對(duì)照孔加入 50yL細(xì)胞維持液；
[0021] 將預(yù)先滅活的樣品液分別加入到96孔細(xì)胞板的相應(yīng)位置，每孔加樣品10yL，每樣 品作豎向兩孔平行;所述細(xì)胞維持液為體積比為3%的胎牛血清的MEM液；
[0022] (B)攻擊病毒：
[0023] 攻擊病毒液制備:根據(jù)試驗(yàn)的標(biāo)本數(shù)用維持液制備足量的攻擊病毒液，將病毒稀 釋到100(^105〇/0.0511^ ;除病毒回滴孔與陰性對(duì)照孔外，其余各孔中均加入5(^1^含 100CCID5Q的攻擊病毒液；
[0024] 回滴100CCID5Q攻擊病毒液：用細(xì)胞維持液將攻擊病毒液作ιο'ιοΛπτ3稀釋，將 攻擊病毒液10* 3與其10 \ 10 2、10 3稀釋度的病毒液加入到相應(yīng)的病毒回滴用96孔細(xì)胞板孔 中，每個(gè)稀釋度加10孔，50μLν孔；
[0025]陰性對(duì)照：向陰性對(duì)照各孔中再加入50yL細(xì)胞維持液;將所有96孔細(xì)胞板放入37 °C、含有C〇2體積百分?jǐn)?shù)為5 %的培養(yǎng)箱中和培養(yǎng)2小時(shí)；
[0026] (C)細(xì)胞懸液的配制與添加：
[0027]細(xì)胞懸液的配制：取足夠量的Vero細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，稀釋至試驗(yàn)所需的細(xì)胞液 量，試驗(yàn)用細(xì)胞懸液濃度應(yīng)為1 X 1〇5個(gè)/mL，配好的細(xì)胞液立即使用；
[0028]細(xì)胞懸加：中和培養(yǎng)后每孔加細(xì)胞懸液100yL，約1 X104個(gè)/孔；
[0029] (D)培養(yǎng)及觀察統(tǒng)計(jì)：
[0030] 將完成以上操作的96孔細(xì)胞板放置37°C、含有C02體積百分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)7天，病毒接種后的第5天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，第7天最終判定結(jié)果，并記錄統(tǒng)計(jì)。
[0031] 進(jìn)一步，步驟(3)所述免疫球蛋白制備具體步驟包括如下：
[0032] (A)從血漿中分離組分II+III:將冷凍血漿在溫度在1~4°C之間融化，離心去冷沉 淀，用pH值為4.0的醋酸緩沖液調(diào)節(jié)血漿pH值到7.0~7.4，加入濃度為54 %的乙醇，使血漿 中乙醇的最終濃度為7 %~11 %，使反應(yīng)液的最終溫度為-1~-3°C，離心分離組分I，用pH值 為4.0的醋酸緩沖液調(diào)節(jié)組分I上清液的pH到5.9~6.0，加入濃度為95 %的乙醇，使血漿中 乙醇的濃度從8%達(dá)到20%，使反應(yīng)液的最終溫度控制在-2.0°C~-4.0°C，用壓濾機(jī)進(jìn)行加 壓過濾，過濾后的清液入另一個(gè)反應(yīng)罐，過濾完成時(shí)用壓縮空氣將壓濾機(jī)吹干，打開壓濾 機(jī)，收取組分Π +ΙΙΙ沉淀；
[0033] (B)將上一步加壓過濾后的組分II + III沉淀用加入4~6倍量預(yù)冷的注射用水溶 解，使反應(yīng)溫度控制在0~2.0 °C。用pH值為4.0的醋酸緩沖液調(diào)節(jié)制品的pH值為5.10~ 5.20，加入濃度為95%的乙醇，使血漿中乙醇的濃度達(dá)到18%，反應(yīng)液溫度最終控制在-4.5 °C~_5.5°C，用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過濾分離組分III上清液；
[0034]向組分III上清液中加入1M碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.3~7.5,每升溶液補(bǔ)加 2.8g氯化鈉以提高反應(yīng)液離子強(qiáng)度;加入95%的乙醇，使反應(yīng)液乙醇的最終濃度為25%，在 加入乙醇過程中，冷卻反應(yīng)液，使其最終溫度為-9.0°C~-11.0°C，繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)，靜置1 小時(shí)后用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過濾，過濾后的清液做回收乙醇處理，過濾完成時(shí)用壓縮空氣將 壓濾機(jī)吹干，打開壓濾機(jī)，收取組分II沉淀，組分II沉淀即為呼吸道合胞病人免疫球蛋白的 粗制品；
[0035] (C)將上一步加壓過濾后的組分II用0~2°C注射用水溶解5~8小時(shí)，溶解溫度控 制在0°C~2.0°C;
[0036] 將充分溶解的組分II過濾澄清，加入3 %鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至6.40~6.80之間， 用5 %氯化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)為1.30~1.50ms/m;
[0037] 采用陰離子交換層析介質(zhì)二乙氨乙基交聯(lián)葡聚糖凝膠裝填層析柱；用AKTA-process層析系統(tǒng)控制進(jìn)液流速，將層析柱用pH值為6.40~6.80的0.03M磷酸鹽緩沖液平衡 至出液的pH值為6.40~6.80后上樣，上樣壓力不超過1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上樣結(jié) 束后，用pH值為6.40~6.80的磷酸鹽緩沖液沖洗凝膠上的殘余蛋白，合并濾過液和后頂液 稱重，用3%鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至3.70~4.00,將調(diào)整好的蛋白液通過轉(zhuǎn)接管道抽至清潔的反 應(yīng)罐中；
[0038] (D)啟動(dòng)超濾器，開始初濃縮，控制溫度在2°C~6.0 °C之間，蛋白濃度達(dá)到5 %~ 8% (g/mL)時(shí)，加入2.0°C~6.0°C注射用水，使液蛋白濃度在2%~5 %并進(jìn)行恒體積超濾透 析脫鹽，超濾透析過