一種豬偽狂犬病毒的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)方法，具體涉及一種豬偽狂犬病毒的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬偽狂犬病毒屬于豬皰疹病毒屬，在全世界廣泛分布。目前，各個研究機構(gòu)對經(jīng)典 毒株和臨床分離的豬偽狂犬病毒進行了體外細胞感染，并已研制出相關(guān)疫苗進入商品化銷 售。
[0003] 國內(nèi)外有多篇文獻報道指出，豬偽狂犬經(jīng)典株與臨床分離到的豬偽狂犬病毒可以 用多種細胞進行體外感染，如VER0細胞、ST細胞等，實驗室病毒培養(yǎng)滴度一般在10 7TCID50， 但對于疫苗生產(chǎn)企業(yè)來講，病毒的滴度越高，單位時間內(nèi)生產(chǎn)病毒的效率就越高，生產(chǎn)成本 也就越低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:對于疫苗生產(chǎn)企業(yè)而言，現(xiàn)有豬偽狂犬病毒的培 養(yǎng)方法培育得到的溶液的病毒滴度較低、生產(chǎn)成本較高；目的在于提供提高豬偽狂犬病毒 體外感染效率，有效提高培育后溶液病毒滴度的一種豬偽狂犬病毒的培養(yǎng)方法;本發(fā)明大 大提高工業(yè)化生產(chǎn)豬偽狂犬病毒效率，為生產(chǎn)企業(yè)提高豬偽狂犬疫苗質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本 提供方法和依據(jù)。
[0005] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0006] -種豬偽狂犬病毒的培養(yǎng)方法，包括：
[0007] (1)配置細胞親和劑，將細胞親和劑的各物質(zhì)溶于去離子水中并過濾；
[0008] 其中，細胞親和劑包括蘋果酸、草酸、山梨酸、磷酸、磷酸氫二鈉、氯化鉀和氯化鈉；
[0009] (2)配置適用于豬偽狂犬病毒培育的DMEM培養(yǎng)液；即將DMEM溶于去離子水中，攪拌 至完全溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.8~7.8，并用0.22um的無菌濾膜進行除菌過濾，放4 °C待用；
[0010] (3)培育單層細胞;即將胎牛血清加入DMEM培養(yǎng)液混合后制成溶液，血清加入體積 范圍為DMEM培養(yǎng)液體積的1 %~8%，將細胞加入到該溶液中進行單層培養(yǎng)，待培養(yǎng)好后棄 去溶液保留細胞，并用無血清液體清洗后獲得單層細胞；
[0011] (4)將單層細胞、DMEM培養(yǎng)液以及細胞親和劑混合均勻，然后放置細胞培養(yǎng)箱中靜 置1~30min;該細胞親和劑的質(zhì)量終濃度為0.01 %~1 % ;
[0012] (5)靜置完成后取出，并迅速加入豬偽狂犬病毒混合均勻，最后放置到細胞培養(yǎng)箱 進行培養(yǎng)，直至細胞病變脫落。
[0013] 本發(fā)明通過優(yōu)化復(fù)合酸與無機鹽的組成物質(zhì)的優(yōu)選配合，有效改變豬偽狂犬病毒 與細胞間的微環(huán)境，增加病毒與細胞接觸親和度，從而增加病毒對細胞的感染率，進而有效 增加豬偽狂犬病毒的滴度，降低生產(chǎn)成本。
[0014] 本發(fā)明通過優(yōu)化細胞親和劑的使用量，不僅僅能有效增加豬偽狂犬病毒的滴度， 而且還能有效減少培育時間，效果對比結(jié)果如表2所示，通過表2可知，細胞親和劑的使用量 的優(yōu)化使偽狂犬病毒的滴度增強數(shù)倍以上，且培育時間至少要節(jié)省四分之一，效果更加顯 著。
[0015] 優(yōu)選地，所述蘋果酸為1~10份，草酸為1~12份，山梨酸為1~10份，磷酸為0.1~1 份;所述磷酸氫二鈉為1~16份，氯化鉀為6~60份，氯化鈉為1~9份。
[0016] 優(yōu)選地，所述蘋果酸為1~10份，草酸為1.2~12份，山梨酸為1~10份，磷酸為0.1 ~1份;所述磷酸氫二鈉為5~7份，氯化鉀為6~10份，氯化鈉為3~8份。
[0017]通過采用上述優(yōu)選組成和配比的細胞親和劑，并將其使用到病毒生產(chǎn)后，不僅僅 使病毒滴度從原先的l〇〃TCID5()每毫升增加至109'2TCID 5Q每毫升，病毒滴度比原先提高近 100 倍。
[0018]而且病毒感染細胞后，通常至少需要48h以上才能達到細胞病變脫落的目的，而加 入本發(fā)明優(yōu)化組分和配比的細胞親和劑后，僅僅只需要不到36h即可使細胞病變脫落，細胞 病變速度顯著加快，節(jié)省培育時間。
[0019] 優(yōu)選地，所述細胞包括Vero細胞、293細胞、ST細胞、BHK細胞中的一種或多種;所述 無血清液體為無菌去離子水、無菌PBS、無菌無血清DMEM培養(yǎng)液;所述無血清液體的清洗次 數(shù)為2~3次。
[0020] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：
[0021] 1、本發(fā)明通過優(yōu)化復(fù)合酸和無機鹽的組成物質(zhì)，有效改變豬偽狂犬病毒與細胞間 的微環(huán)境，增加病毒與細胞接觸親和度，從而增加病毒對細胞的感染率，進而有效增加豬偽 狂犬病毒的滴度，降低生產(chǎn)成本；
[0022] 2、本發(fā)明通過采用上述組成和配比的細胞親和劑，并將其使用到病毒生產(chǎn)后，不 僅僅使病毒滴度比原先不使用細胞親和劑時提高近1〇〇倍，而且還能使細胞病變速度顯著 加快，從原先的48h縮短到36h，顯著節(jié)省培育時間。
【具體實施方式】
[0023]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作 進一步的詳細說明，本發(fā)明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對本 發(fā)明的限定。
[0024] 實施例
[0025] -種豬偽狂犬病毒的培養(yǎng)方法，包括：
[0026] (1)配置細胞親和劑，將細胞親和劑的各物質(zhì)溶于去離子水中并過濾；
[0027] 其中，細胞親和劑包括蘋果酸、草酸、山梨酸、磷酸、磷酸氫二鈉、氯化鉀和氯化鈉。
[0028] 本發(fā)明細胞親和劑的具體組成成份如表1所示。
[0029] 表 1
[0030]
[0031] 上述表1中各組成成份的單位均為重量份，細胞親和劑的終濃度以質(zhì)量計。
[0032] (2)配置適用于豬偽狂犬病毒培育的DMEM培養(yǎng)液；即將DMEM溶于去離子水中，攪拌 至完全溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.8~7.8，并用0.22um的無菌濾膜進行除菌過濾，放4 °C待用。
[0033] (3)培育單層細胞;即將胎牛血清加入DMEM培養(yǎng)液混合后制成溶液，血清加入體積 范圍為DMEM培養(yǎng)液體積的1 %~8%，將細胞加入到該溶液中進行單層培養(yǎng)，待培養(yǎng)好后棄 去溶液保留細胞，并用無血清液體清洗后獲得單層細胞。
[0034] 所述細胞包括Vero細胞、293細胞、ST細胞、BHK細胞中的一種或多種;所述無血清 液體為無菌去離子水、無菌PBS、無菌無血清DMEM培養(yǎng)液;所述無血清液體的清洗次數(shù)為2~ 3次。
[0035] (4)將單層細胞、DMEM培養(yǎng)液以及細胞親和劑混合均勻，然后放置細胞培養(yǎng)箱中靜 置1~30min;該細胞親和劑的質(zhì)量終濃度為0.01 %~1 %。
[0036] (5)靜置完成后取出，并迅速加入豬偽狂犬病毒混合均勻，最后放置到