用于催陳和澄清山西老陳醋的共固定化酶的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及山西老陳醋處理方法，具體涉及到共固定化酶的制備及應用其處理山 西老陳醋催陳及澄清的使用方法。
【背景技術】
[0002] 山西老陳醋的發(fā)展已有300多年的歷史，與鎮(zhèn)江香醋、保寧醋、永春老醋并稱為中 國四大名醋，且居四大名醋之首。在GBT 19777-2013中對山西老陳醋定義為："在標準規(guī)定 的原產地域保護范圍內，以高粱和麩皮為主要原料，稻殼、谷殼作為輔料，并以大麥和豌豆 為原料所制作的大曲為糖化發(fā)酵劑。經酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵，熏醅、陳釀等工藝所釀造出的 食醋統(tǒng)稱為山西老陳醋。"其顏色呈深褐色，香氣濃郁、醇厚，入口綿酸、柔和，越陳越香，過 夏不腐，入冬不凍。除了醋酸之外山西老陳醋中還含有乳酸、蘋果酸等多種有機酸和糖類、 酯類、氨基酸及維生素等多種營養(yǎng)成分。長期食用可增進食欲、有助于鈣的吸收、降低血糖 及血糖濃度、降低血壓等。
[0003] 山西老陳醋之所以風味獨特，很大原因在于其成分的復雜多樣性，目前人們發(fā)現(xiàn) 的成分有130余種。除了主要成分醋酸之外，還包括糖分、氨基酸、無機物在內的呈味物質和 酯、醛、醇、酚、酮類等在內的呈香物質，各類物質的含量和相互之間的比例關系奠定了山西 老陳醋的風味的基礎。而不同物質之間的相互作用以及在長期自然陳釀過程中受光照、溫 度、空氣的影響而發(fā)生的緩慢變化更是對老陳醋最后品質的形成起到很大影響。自然陳釀 是一個緩慢復雜的化學過程和物理過程，包括酯化反應、美拉德反應、氧化反應、縮合反應、 締合反應以及低沸點物質的揮發(fā)。山西老陳醋運用"夏伏曬，冬撈冰"的方式自然陳釀，傳統(tǒng) 工藝催陳老熟的陳釀期在十個月到一年，陳釀周期長導致庫房占用面積大、貯存設備投資 大、資金周轉慢等問題。
[0004] 發(fā)酵過程結束后的山西老陳醋醋液往往存在渾濁沉淀現(xiàn)象，使得陳醋的品質下 降。其主要形成因素為生物性和非生物性因素兩類。生物性因素主要由于生產環(huán)境的雜菌 污染，以及熱處理不徹底而造成的一些耐熱芽孢桿菌、酵母菌和耐酸菌繼續(xù)繁殖。非生物因 素主要是釀造過程中糖化發(fā)酵不完全，釀醋原輔料中的淀粉、蛋白質、脂肪、果膠等大分子 物質未完全降解或利用，鐵離子氧化蛋白、單寧后生成的不溶性絡合物等因素而引起的。這 些渾濁沉淀會影響山西老陳醋的外觀、品質以及保質期。
[0005]游離酶在實際應用時有較多的缺陷，如穩(wěn)定性差，蛋白質的化學本質決定了其催 化性能主要取決于酶蛋白的三維空間結構，因此酶活性易受外界因素影響引發(fā)酶蛋白變性 等;大多數(shù)酶都溶于水，與底物進行酶解反應后，存在于同一反應體系中，很難分離回收，限 制了其進一步的發(fā)展。因此，游離酶技術發(fā)展到一定程度后就提出了固定化酶的概念，以克 服游離酶應用的局限。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明目的是針對山西老陳醋存在的自然陳釀周期長以及醋液渾濁現(xiàn)象，提供一 種用于催陳和澄清山西老陳醋的共固定化酶的制備及使用方法，該共固定化酶具有增加山 西老陳醋香味及獨特風味和提高醋液澄清度的作用。
[0007] 本發(fā)明用于催陳和澄清山西老陳醋的共固定化酶的制備方法，其步驟如下： (1) 制備酯化酶酶液稱取一定質量的酯化酶酶粉，用酯化酶質量4-5倍、pH 3.6的乙 酸-乙酸鈉緩沖液將其溶解，將所得上清液倒入容量瓶，將剩余沉渣中再添入pH 3.6的乙 酸-乙酸鈉緩沖液搗研多次，直至全部溶解后將其移入容量瓶中，再用緩沖液稀釋到容量瓶 刻度，搖勻后多層紗布過濾，制備成濃度為3.5%的酯化酶酶液，備用； (2) 制備糖化酶酶液稱取一定質量的糖化酶酶粉，用糖化酶質量4-5倍、pH 4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液將其溶解，將所得上清液倒入容量瓶，將剩余沉渣中再添入pH 4.6乙酸-乙酸 鈉緩沖液搗研多次，直至全部溶解后將其移入容量瓶中，再用緩沖液稀釋到容量瓶刻度，搖 勻后多層紗布過濾，制備濃度為5%的糖化酶酶液，備用； (3) 稱取一定質量的載體材料，用載體材料質量55-60倍的50-60 °C水溶解，然后在常 溫下加入載體材料質量體積比為100:7的（1)制備的酯化酶液，充分攪拌均勻后靜置，待氣 泡完全消失后，在4-5 °C條件下，緩慢滴入2%的氯化鈣水溶液中，固化1 h后生成顆粒物，然 后在常溫下用兩層紗布濾出顆粒物，用pH 3.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液沖洗顆粒物3~5次，除 去表面的氯化鈣，吸干表面的水分，制成直徑2.0-2.3 mm的顆粒狀固定化酶，備用； (4) 稱取(3)制備的一定量固定化酶，按固定化酶與(2)制備的糖化酶液質量體積比為 1:1、將固定化酶放入糖化酶液中吸附6-7 h，然后用紗布濾出顆粒，再用pH 4.6乙酸-乙酸 鈉緩沖液沖洗顆粒3~5次，除去表面酶液，吸干表面水分，制得共固定化酶。
[0008] 所述的載體材料是用海藻酸鈉與黃原膠質量比為5:1配制而成。
[0009] 本發(fā)明的共固定化酶的使用方法是:將山西老陳醋質量〇.8%-1.2%的共固化酶放 入陳醋中，在40-45 °C條件下用超聲波振蕩24-26h，然后過濾，去除共固定化酶。
[0010]本發(fā)明共固定化酶的特點 1、共固定化酶的最適作用溫度 酶的最適溫度與它的反應條件有關。如表1所示，山西老陳醋中經固定后的酶最適溫度 分別與游離酶相同。當催化溫度升高時，酶活力會隨之增加，但是溫度的不斷升高亦會使酶 蛋白逐漸變性，導致酶活力下降。糖化酶最適溫度為45 °C，酯化酶最適溫度為40 °C。
[0011] 2、共固定化酶的熱穩(wěn)定性 由表2可知，游離酶和固定化酶的相對活力在不同的溫度下具有差異性，當溫度在30~ 35 °C時，其相對活力基本相當；大于35 °C時，固定化酶的相對酶活相對較高，固定化酶的 高溫穩(wěn)定性開始凸顯，說明固定化酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶。
[0012] 3、共固定化酶的米氏常數(shù) 分別以乙酸乙酯和可溶性淀粉為底物，考察了酯化酶、糖化酶和共固定化酶的米氏常 數(shù)，采用雙倒數(shù)作圖法計算其米氏常數(shù)Km值。實驗結果如表3、4所示，經計算可得酯化酶Km= 6.74X10-2mL/100 mL，共固定化酯化酶Km=8.82X10-2 mL /100 mL;糖化酶Km=3.63X10-2 g/100 mL，共固定化糖化酶Km=2.16Xl(T2 g/100 mL。說明經共固定化處理后的酯化酶對底 物的親和力有些許降低，而糖化酶對底物的親和力有所提高。
[0013]
4、共固定化酶的操作穩(wěn)定性 由表5可知，隨著反應批次的增加共固定化酶酶活力有所降低，固定化糖化酶在反應4 次后酶活力降到原活力的50%，固定化酯化酶在反應5次后降到原活力50%。證明共固定化酶 可進行反復使用，具有操作穩(wěn)定性。
[0014] 本發(fā)明的有益效果 (1)本發(fā)明通過對酶進行共固定化處理最大限度地保持了游離酶的活力，提高酶的酶 學性質。試驗證明，共固定化處理后酯化酶與糖化酶的最適反應溫度均與游離酶相同，兩酶 的熱穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶，糖化酶對底物的親和力有所提高;共固定化酶可反復操作5次相比 游離酶只能操作一次，其操作穩(wěn)定性有明顯提高，同時可減少反應時間和步驟，節(jié)約成本， 便于連續(xù)生產，克服了游離酶穩(wěn)定性差、易失活、不能重復使用、并且與產品反應后混入產 品、難以在工業(yè)中更為廣泛的應用的缺陷。與普通的固定化酶相比，共固定化酶的優(yōu)勢在于 可以充分發(fā)揮各酶的特點，將其催化特性相結合，充分利用協(xié)同作用，提高催化效率。
[0015] (2)采用本發(fā)明共固定化酶處理后醋液中總酯含量提高了五個百分點以上，數(shù)量 也由原先的10種增加到了 13種;雜環(huán)類化合物的總量提高了五個百分點以上，香氣成分總 量提高了六個百分點以上，醋液透光率提高了三個百分點以上。
【附圖說明】
[0016] 圖1為處理前醋液香氣成分總離子流色譜圖。
[0017] 圖2為用本發(fā)明的共固定化酶處理后醋液香氣成分總離子流色譜圖。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1 用本發(fā)明方法制備共固定化酶，包括如下步驟： (1) 制備pH 3.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液、pH 4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液、2%的氯化鈣水溶 液； (2) 制備載體材料用海藻酸鈉與黃原膠質量比為5:1配制成載體材料； (3) 制備酯化酶酶液準確稱取一定質量的酯化酶酶粉，用酯化酶質量4倍、pH 3.6的 乙酸-乙酸鈉緩沖液將其溶解，將所得上清液倒入容量瓶，將剩余沉渣中再添入pH 3.6的乙 酸-乙酸鈉緩沖液搗研多次，直至全部溶解后將其移入容量瓶中，再用緩沖液稀釋到容量瓶 刻度，搖勻后多層紗布過濾，制備成濃度為3.5%的酯化酶酶液，備用； (4) 制備糖化酶酶液準確稱取一定質量的糖化酶酶粉，用糖化酶質量4倍、pH 4.6乙 酸-乙酸鈉緩沖液將其溶解，將所得上清液倒入容量瓶，將剩余沉渣中再添入pH 4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液搗研多次，直至全部溶解后將其移入容量瓶中，再用緩沖液稀釋到容量瓶