高活性人細(xì)胞因子Eotaxin-2的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和食品醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高活性人細(xì)胞因子 Eotaxin-2的快速、大量制備方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 高活性細(xì)胞趨化因子Eotaxin-2屬于β趨化因子或CC化學(xué)趨化因子家族的成員，是 一種分子量多為8-10kDa的一種蛋白質(zhì)。以近Ν-端處有2個(gè)相鄰的半胱氨酸為特征。通過(guò)與 具有7個(gè)跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體即趨化因子受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì) 胞的迀移中發(fā)揮了重要作用。
[0003] 目前越來(lái)越多的研究表明Eotaxin-2的趨化因子受體CCR3在炎癥反應(yīng)、過(guò)敏性哮 喘等疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是重要的藥物靶點(diǎn)，通過(guò)阻斷CCR3的信號(hào)傳導(dǎo)途徑將有望大 大緩解或徹底治愈炎癥及過(guò)敏性哮喘等相關(guān)疾病。因此，Eotaxin-2作為趨化因子的重要的 組成部分，其研究受到了廣泛的關(guān)注。
[0004] 在1997年及1999年又分別發(fā)現(xiàn)了Eotaxin-2和Eotaxin-3,二者的基因都位于 7qll. 23,他們的生物學(xué)作用非常相似，Eotaxin-2的趨化活性與Eotaxin-Ι相似，但氨基酸 的同源序列只有39%，而Eotaxin-3與Eotaxin-Ι氨基酸的同源序列只有37 %，Eotaxin-3對(duì) 嗜酸性粒細(xì)胞的趨化活性是Eotaxin-2和Eotaxin-l的10%(李靜.趨化因子eotaxin及其受 體與支氣管哮喘[J].國(guó)際兒科學(xué)雜志，2006,33(3) :406-408)。
[0005] Eotaxin-2由78個(gè)氨基酸組成，其分子量為8.8X103，Eotaxin-2的結(jié)構(gòu)包括一個(gè) 螺旋，隨后是3個(gè)反向平行的β片層和一個(gè)α螺旋。N-loop通過(guò)兩個(gè)保守的二硫鍵將N-末端/ N-loop區(qū)域與β片層連接在一起。與CCR3的N-末端區(qū)域相對(duì)的線性肽與Eotaxin-2結(jié)合，誘 導(dǎo)許多氨基酸殘基濃度依賴(lài)的化學(xué)位移改變或線性增加。這些氨基酸殘基的移動(dòng)表明肽與 N-loop和β2_β3發(fā)卡結(jié)構(gòu)之間的表面的擴(kuò)展槽結(jié)合。受體肽也可能與趨化因子的N-端和α螺 旋的部分相互作用。Eo tax in-2的結(jié)構(gòu)與趨化因子結(jié)構(gòu)的不同之處，可能對(duì)其與受體結(jié)合的 特異性相關(guān)（Mayer K.L.，Stone M.J. .NMR solution structure and receptor peptide binding of the CC chemokine eotaxin-2[J].Biochemistry,2000,V39(29):8382-8395)。
[0006] 目前Eotaxin-2的獲得由兩種主要途徑:從活體中天然提取和用基因工程的方法 進(jìn)行基因克隆到原核細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)。第一種方法產(chǎn)量低，成本過(guò)高，不利于大規(guī)模生 產(chǎn)，第二種方法經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生過(guò)量表達(dá)，然而過(guò)量表達(dá)會(huì)產(chǎn)生不溶和無(wú)活性的多肽，不溶的聚 集物通常形成包涵體(劉華，李敏.基因重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)與分離純化研究進(jìn)展[J].福建 師范大學(xué)報(bào)，2007,23(1): 100-104;Proudfoot A.E.I.，Borlat F. .Chemokine Protocols [M].Humana Press,New York,2002,7587)。
[0007] 重組蛋白被包裹在包涵體中是不具有生物活性的，必須重新增溶、變性和復(fù)性以 促進(jìn)分子內(nèi)正確二硫鍵和自然構(gòu)象的形成，這個(gè)過(guò)程由于增加了許多色譜分離純化步驟而 比較費(fèi)時(shí)且復(fù)性效果不好。因此，需要建立一個(gè)更加快速、高效的趨化因子表達(dá)系統(tǒng)，不僅 可溶性蛋白表達(dá)量高，而且分離純化步驟簡(jiǎn)單。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于:提供了一種簡(jiǎn)便、快速、低成本、高產(chǎn)量、高純度 的細(xì)胞趨化因子Eotaxin-2的制備方法，并對(duì)其活性進(jìn)行了驗(yàn)證。
[0009] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種高活性細(xì)胞因子的制備方法，包括如下 步驟：
[0010]步驟1:根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Eotaxin-2的氨基酸序列，對(duì)其密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，人工 合成目的基因；
[0011] 步驟2:通過(guò)設(shè)計(jì)引物在其N(xiāo)端引入一個(gè)或多個(gè)His標(biāo)簽、TEV酶切位點(diǎn)，并在N端和C 端分別引入限制性酶切位點(diǎn)EcoR I和Hind III;
[0012] 步驟3:利用PCR技術(shù)將目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，再將基因片段雙酶切后連接到用相同 酶切割后的載體上面，而后導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，生產(chǎn)Eotaxin-2蛋白。
[0013] 所述步驟1中，所得人工合成目的基因的核苷酸序列優(yōu)選為：GTT GTT ATT CCG TCA CCG TGC TGT ATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAA AAC CGC GTT GTT AGT TAT CAG CTG AGC TCT CGT TCC ACC TGC CTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAA GGC CAG CAA TTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATG AAA AAT CTG GAC GCG AAA CAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCA CGC GCA GTG GCA TAA。
[0014] 所述步驟2中，所得修飾后的人工合成目的基因的核苷酸序列優(yōu)選為：
[0015] EcoR I site 6XHis TEV cleavage site Hindlllsite
[0016] 5-tatagtgaattc|G\GG\ 丁 GATGAGGAGGX^gaaaacctgtattttcagggt- Eotaxin-2-TAAAAGCTTACT-3。
[0017]所述高活性細(xì)胞因子的制備方法，可以進(jìn)一步包括：
[0018] 步驟4:將誘導(dǎo)表達(dá)后的大腸桿菌收集、高壓破碎、離心、過(guò)濾、鎳柱親和層析、凝膠 過(guò)濾脫鹽、酶切除去His標(biāo)簽后得到純度很高的蛋白。
[0019] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種人工合成目的基因，所述基因是根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Eotaxin-2的氨基酸序列，對(duì)其密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，人工合成目的基因；
[0020] 所得人工合成目的基因的核苷酸序列為：GTT GTT ATT CCG TCA CCG TGC TGT ATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAA AAC CGC GTT GTT AGT TAT CAG CTG AGC TCT CGT TCC ACC TGC CTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAA GGC CAG CAA TTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATG AAA AAT CTG GAC GCG AAA CAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCA CGC GCA GTG GCA TAA〇
[0021] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明另提供了一種人工合成目的基因，所述基因是根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Eotaxin-2的氨基酸序列，對(duì)其密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，人工合成目的基因；并通 過(guò)設(shè)計(jì)引物在其N(xiāo)端引入一個(gè)或多個(gè)His標(biāo)簽、TEV酶切位點(diǎn)，并在N端和C端分別引入限制性 酶切位點(diǎn)EcoR I和Hind III;
[0022] 所得修飾后的人工合成目的基因的核苷酸序列為：
[0023] EcoR I site 6XHis TEV cleavage site Hindlllsite
[0024] S-TATAGTGAATTcICACCATCATCACCACCAliGAAAACCTGTATTTTCAGGGT-Eotaxin-2-TAAAAGCTTACT-3。
[0025] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明又提供了一種如前述任一項(xiàng)所述高活性細(xì)胞因子的 制備方法在制備治療變應(yīng)性鼻炎、哮喘、結(jié)直腸腫瘤、鼻息肉、艾滋病(HIV)、過(guò)敏性疾病、寄 生蟲(chóng)感染、系統(tǒng)性疾病、和/或炎癥及免疫相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0026] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明再提供了一種如前述任一項(xiàng)所述人工合成基因在制 備治療變應(yīng)性鼻炎、哮喘、結(jié)直腸腫瘤、鼻息肉、艾滋病(HIV)、過(guò)敏性疾病、寄生蟲(chóng)感染、系 統(tǒng)性疾病、和/或炎癥及免疫相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0027] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明另提供了一種如前述任一項(xiàng)所述高活性細(xì)胞因子的 制備方法和/或所述人工合成基因，在治療變應(yīng)性鼻炎、哮喘、結(jié)直腸腫瘤、鼻息肉、艾滋病 (HIV)、過(guò)敏性疾病、寄生蟲(chóng)感染、系統(tǒng)性疾病、和/或炎癥及免疫相關(guān)疾病的藥物設(shè)計(jì)方面 的應(yīng)用。
[0028] 所述的表達(dá)載體為普通大腸桿菌表達(dá)載體，優(yōu)選質(zhì)粒pET28a、pET32a、pMAL-p4X， 分別對(duì)應(yīng)于大腸桿菌宿主菌BL21 (DE3)、0rigami、TB1。
[0029] 本發(fā)明還進(jìn)一步對(duì)所用表達(dá)載體、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度和時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，最終優(yōu) 化的表達(dá)條件為:表達(dá)載體選用pET28a、0D 6(x) = 1.0~1.2、誘導(dǎo)時(shí)間為8h、誘導(dǎo)溫度為25°C。
[0030] 本發(fā)明方法還可以用SDS-PAGE、質(zhì)譜方法對(duì)制備得到的蛋白的純度和分子量進(jìn)行 了分析和驗(yàn)證，用表面等離子共振技術(shù)(SPR)對(duì)制備得到的Eotaxin-2的生物活性進(jìn)行了表 征。
[0031 ]本發(fā)明制備得到的Eotaxin-2純度很高且有生物活性，在相關(guān)疾病的治療和藥物 的設(shè)計(jì)方面顯示了很大的應(yīng)用前景。
[0032]本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0033] 1.本發(fā)明為運(yùn)用基因工程技術(shù)，將Eotaxin-2基因進(jìn)行了優(yōu)化，并在其N(xiāo)端加入了 能與Ni柱特異性結(jié)合的His標(biāo)簽以及后續(xù)可以去除標(biāo)簽的TEV酶切位點(diǎn)，在N端和C端分別加 入限制性酶切位點(diǎn)EcoR I和Hind III，連接到表達(dá)載體上然后轉(zhuǎn)入相應(yīng)的大腸桿菌表達(dá)體 系中，在菌體〇D6Q()= 1.0~1.2時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。這一生產(chǎn)過(guò)程生產(chǎn)周期為12個(gè)小 時(shí)，同時(shí)大腸桿菌易于實(shí)現(xiàn)高密度大規(guī)模培養(yǎng)，從而大大縮短了培養(yǎng)時(shí)間，降低生產(chǎn)成本。 [0034] 2.大腸桿菌細(xì)胞容易破碎，且含雜蛋白比較少，因?yàn)槭钦T導(dǎo)型表達(dá)，有利于目的蛋 白的富集和反應(yīng)過(guò)程的調(diào)控，使得下游純化過(guò)程變得更加簡(jiǎn)單，容易獲得低成本、高產(chǎn)量、 高純度的Eotaxin-2蛋白。
[0035] 3、本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化最終選擇表達(dá)菌株pET28a/BL21(DE3)，使Eotaxin-2水溶性表 達(dá)量高，包涵體形成較少，所得蛋白結(jié)構(gòu)折疊正確，具有生物活性。培養(yǎng)1L大腸桿菌可以獲 得3.87mg左右的蛋白，和傳統(tǒng)提取方法相比產(chǎn)量提高很多倍。
[0036] 4、本發(fā)明Eotaxin-2的分離純化過(guò)程簡(jiǎn)單，只經(jīng)過(guò)鎳柱親和層析和凝膠層析兩步， 減少了過(guò)多的分離純化步驟對(duì)蛋白活性和產(chǎn)量的影響。
[0037] 5、在蛋白的純化過(guò)程中雜蛋白組氨基酸的含量比較少，在與目的蛋白進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性 結(jié)合Ni柱時(shí)，由于結(jié)合力較弱非常容易就被少量的咪唑洗脫下來(lái)，而目的蛋白用500mM的咪 唑洗脫，從而得到純度很高的蛋白。
[0038] 6、本發(fā)明中通過(guò)Eotaxin-2表達(dá)體系的選擇、表達(dá)條件的優(yōu)化和表達(dá)過(guò)程的調(diào)控， 進(jìn)一步提高了蛋白的產(chǎn)量，并且獲得的蛋白中單體比較多，二聚體和寡聚體很少。
[0039] 7、本發(fā)明用表面等離子共振技術(shù)（SPR)對(duì)制備得到的Eotaxin-2的生物活性進(jìn)行 了驗(yàn)證，通過(guò)活性實(shí)驗(yàn)可以看出本實(shí)驗(yàn)室制備的Eotaxin-2比商業(yè)化的Eotaxin-2與CCR3的 結(jié)合親和力高10倍左右，因此在相關(guān)疾病的治療和藥物的設(shè)計(jì)方面顯示了更大的應(yīng)用前 景。
【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1為本發(fā)明細(xì)胞因子Eotaxin-2表達(dá)載體PET28a-Eotaxin-2基因的構(gòu)建圖。<