一種利用重組嗜乙酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]—種利用重組嗜乙酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]反式-4-羥脯氨酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、動(dòng)物飼料和美容業(yè)等方面。在醫(yī)藥方面，反式-4-羥脯氨酸作為原料可用于合成消炎藥、碳青霉烯類。在化工上，反式-4-羥脯氨酸可作為手性原料合成多種聚合物。在動(dòng)物飼料應(yīng)用上，添加反式-4-羥脯氨酸可防止因甘氨酸合成不足而導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)不良現(xiàn)象。反式-4-羥脯氨酸用于高級(jí)化妝品中，可消除氧化劑和調(diào)整細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的主要方法是生物提取法，利用動(dòng)物蛋白來(lái)源，如明膠、豬皮為原料，經(jīng)酸、堿水解后提取反式-4-羥脯氨酸。該方法純化步驟長(zhǎng)，成本高，且廢棄物污染嚴(yán)重；而化學(xué)合成方法合成成本高，也不適合工業(yè)生產(chǎn)。隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展以及微生物資源的發(fā)現(xiàn)，生物合成酶法生產(chǎn)羥脯氨酸成為工業(yè)上很有前景的生產(chǎn)方法。
[0004]生物合成法能將游離的L-脯氨酸通過(guò)脯氨酸羥化酶的催化，轉(zhuǎn)化為羥基-L-脯氨酸，但在生物細(xì)胞中，游離的脯氨酸也是一種可以被利用的碳源，其積累量比較有限，選用能夠大量生產(chǎn)L-脯氨酸的菌株作為羥基-L-脯氨酸生產(chǎn)菌株是非常重要的。
[0005]1956年Kinoshita等最先從土壤中分離到可以積累谷氨酸的微生物Micrococcusglutamicus N0.534，自此之后產(chǎn)谷氨酸菌種被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，目前根據(jù)生理生化等特征將這類產(chǎn)谷氨酸細(xì)菌統(tǒng)稱為C.glutamicum。本研究所用的嗜乙酰乙酸棒桿菌C.acetoacidophilum也是其中的一種。谷氨酸棒桿菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，是一般公認(rèn)安全物質(zhì)(GRAS)，是工業(yè)生產(chǎn)氨基酸的重要菌種。且此菌無(wú)致病性、不產(chǎn)孢子、自身胞外蛋白酶分泌缺失，食品安全性好。
[0006]實(shí)驗(yàn)室保藏菌種嗜醋酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)N0.45是一株兩抗型【磺胺胍(SG)和硫代脯氨酸(L-S-Pro)有抗性】菌株，該菌株經(jīng)由硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍(NTG)逐級(jí)誘變處理得到。此菌L-脯氨酸產(chǎn)量較高，可用作羥基-L-脯氨酸生廣囷O
[0007]本發(fā)明所提供的利用重組嗜乙酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對(duì)生物合成法生產(chǎn)羥基-L-脯氨酸時(shí)，需外源添加L-脯氨酸導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的是選擇高產(chǎn)L-脯氨酸的嗜醋酸棒桿菌(Corynebacterium8061:03(^(1(^11；[111111)勵(lì).45作為生產(chǎn)菌株進(jìn)行菌株構(gòu)造，獲得重組的嗜乙酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-輕基-L-脯氨酸。
[0009]本發(fā)明是一種通過(guò)選用高產(chǎn)L-脯氨酸的嗜醋酸棒桿菌(Corynebacter iumacetoacidophilum)N0.45以達(dá)到高產(chǎn)反式-4-輕基-L-脯氨酸的生物合成方法。其特征是:選擇高產(chǎn)L-腦氨酸的嗜醋酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)N0.45作為生產(chǎn)菌株，具有多克隆位點(diǎn)、可存在于多種宿主菌的pkl9mobSacB作為表達(dá)載體進(jìn)行菌株構(gòu)造，使得生物體可以獲得大量的L-脯氨酸，達(dá)到高產(chǎn)羥基-L-脯氨酸的目的。
[0010]本發(fā)明中的脯氨酸羥化酶基因(P4H)含有獨(dú)立的高效啟動(dòng)子-色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子(Ptrp2)，從已有的重組載體上酶切獲得。
[0011 ] 作為表達(dá)載體，要能夠在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制，例如有pkl9mobsacB、pkl8mobsacB等。
[0012]作為宿主細(xì)胞，要能夠表達(dá)目的基因，除了使用棒狀桿菌屬、大腸桿菌屬、假單胞菌、芽孢桿菌、酵母菌等菌株，也可以使用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主。
[0013]本發(fā)明可以應(yīng)用于反式-4-羥脯氨酸的生產(chǎn)中，培養(yǎng)重組菌的培養(yǎng)基要含有微生物可以利用的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等，可以是天然培養(yǎng)基，也可以是合成培養(yǎng)基。
[0014]作為微生物可以利用的氮源，可以是硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等銨鹽類或其他含氮化合物，還可以有玉米漿、酵母提取物、蛋白胨、豆柏等有機(jī)氮源。
[0015]作為微生物可以利用的無(wú)機(jī)鹽，有磷酸二氫鉀、氯化鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣等。
[0016]重組菌的培養(yǎng)需要震蕩或攪拌以維持菌體生長(zhǎng)所需的氧氣量。培養(yǎng)溫度在20-37°C，培養(yǎng)時(shí)間12-72小時(shí)。
[0017]本發(fā)明的方法是通過(guò)重組嗜乙酸棒桿菌發(fā)酵反式-4-羥脯氨酸，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是單一表達(dá)載體pkl9mobsacB-Ptrp2_HYP的構(gòu)建。
[0019]圖2是含單一表達(dá)載體菌株的獲得。
【具體實(shí)施方式】
[°02°] 一般性說(shuō)明:【具體實(shí)施方式】中所用到的酶全部從TaKaRa公司購(gòu)買，sanprep柱式質(zhì)粒DNA抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自上海生工，每個(gè)操作完全按照試劑盒的說(shuō)明。
[0021]種子培養(yǎng)基(％):葡萄糖3，牛肉膏1.2，蛋白胨1，尿素0.1，酵母膏0.5，他(:1 0.5，生物素200ug/L，pH 7.0-7.2。
[0022]Kan(Amp)抗性平板:I % (W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母抽提物，I % (W/V)NaCl，1.5% (W/V)瓊脂糖，硫酸卡那霉素(氨芐青霉素)50yg/mL。
[0023]5父1^1(電擊緩沖液):0.51 KC1，0.15M CaCl2,0.25M MgCl2o
[0024]反式-4-羥脯氨酸的定量測(cè)定:將發(fā)酵液離心后，取上清，稀釋到2.5mL后加于1mL試管中，之后加入ImL氯胺T(氯胺T溶液:將1.41g氯胺T溶于1mL水中，依次加入1mL正丙醇和80mL緩沖溶液，其中緩沖溶液配方為:將50g檸檬酸，26.3g NaOH和146.1g結(jié)晶乙酸鈉溶于水至1L，然后與200mL水以及300mL正丙醇混合)，搖勾后在室溫中放置20min，然后加入ImL顯色劑(顯色劑:稱取I Og對(duì)二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸溶解，緩慢加入65mL異丙醇)，搖勻后迅速將試管移至60°C水浴鍋中，保溫20min，再用冷水冷卻，最后用紫外分光光度計(jì)在560nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。
[0025]實(shí)施例1:含有H4P的重組質(zhì)粒(PUC19-Ptrp2-HYP)的獲得
[0026]取實(shí)驗(yàn)室保存的含有目的質(zhì)粒的菌株活化，于37°C，220rpm培養(yǎng)12-16小時(shí)。取培養(yǎng)后的菌液提取質(zhì)粒，所有操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。
[0027]實(shí)施例2:含有H4P基因的表達(dá)載體pkl9mobsacB的獲得
[0028]用EcoR1、BamHI兩種酶分別雙酶切處理PUC19-Ptrp2-HYP、pkl9mobsacB，酶切產(chǎn)物膠回收得到線性的Ptrp2-HYP以及pkl9mobsacB片段，用T4DNA連接酶將兩者置于16°C連接過(guò)夜后，將1yL的連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落培養(yǎng)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒即為pkl9mobsacB-Ptrp2_HYP。
[0029]實(shí)施例3:含有H4P基因的重組菌株(pkl9mobsacB-Ptrp2-HYP)的獲得
[0030]將pkl9mobsacB-Ptrp2_HYP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化嗜乙酸棒桿菌C.acetoacidophi IumN0.45,獲得重組菌株C.acetoacidophiIum N0.45(pkl9mobsacB-Ptrp2-HYP)。
[0031]實(shí)施例4:重組菌株的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
[0032]搖瓶培養(yǎng):挑取重組大腸桿菌單菌落，接種到種子培養(yǎng)基(含硫酸卡那霉素50yg/mL)中，30°C、220rpm培養(yǎng)12h后，按5%(V/V)接種量接入含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基【14%(W/V)葡萄糖，1.5%(W/V)氯化銨，2%(W/V)玉米漿，3%(W/V)谷氨酸鈉，0.15%(W/V)磷酸氫二鉀，100yg/mL生物素，100yg/mL硫胺素，pH 7.0?7.2】的250mL搖瓶中，在旋轉(zhuǎn)式搖床中30°C、220rpm培養(yǎng)36h。取發(fā)酵液檢測(cè)反式-4-羥脯氨酸濃度。反式-4-羥脯氨酸的測(cè)定方法詳見實(shí)施方式一般性說(shuō)明。發(fā)酵結(jié)果顯不，C.acetoacidophiIum N0.45(pkl9mobsacB-Ptrp2-HYP)的反式-4-羥脯氨酸初步發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到106mg/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用重組嗜乙酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法，其中重組嗜乙酸棒桿菌攜帶的重組質(zhì)粒是將具有催化脯氨酸生成反式-4-羥脯氨酸的脯氨酸羥化酶基因(P4H)重組到質(zhì)粒pklQmobsacB上，得到具有合成反式-4-羥脯氨酸生物活性的重組微生物。2.如權(quán)利要求1所述，具有合成反式-4羥脯氨酸生物活性是指，生物細(xì)胞具有可以利用外源添加或者自身積累的脯氨酸，在脯氨酸羥化酶、α-酮戊二酸和亞鐵離子共同作用下，將游離的L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥基-L-脯氨酸的能力。3.權(quán)利要求1所述的載體、多拷貝質(zhì)粒包括但不局限于pkl9mobsacB，pkl8mobsacB，pET-28a、pUC19 等。4.反式-4-羥脯氨酸的生產(chǎn)方法，其特征是將權(quán)利要求1、2所述的重組微生物在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將得到的培養(yǎng)物、菌體或者它們的處理物作為酶源，在葡萄糖存在的條件下，于水性介質(zhì)中將葡萄糖轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-脯氨酸，再?gòu)腖-脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥脯氨酸，最后從該水性介質(zhì)中提取生成的反式-4-羥脯氨酸。5.如權(quán)利要求1和2所述，生物細(xì)胞包括任何能夠表達(dá)脯氨酸羥化酶，自主產(chǎn)生α-酮戊二酸，將脯氨酸轉(zhuǎn)化為羥基-L-脯氨酸的有機(jī)體，包括嗜乙酸棒桿菌、大腸桿菌、酵母、動(dòng)植物細(xì)胞等。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用重組嗜乙酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法。該重組嗜乙酸棒桿菌攜帶的重組質(zhì)粒具有催化脯氨酸生成反式-4-羥脯氨酸的脯氨酸羥化酶基因(P4H)。在重組嗜乙酸棒桿菌細(xì)胞內(nèi)，脯氨酸-4-羥化酶在α-酮戊二酸以及亞鐵離子存在的情況下，可以將游離的L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥基-L-脯氨酸。本發(fā)明還公開了所述在嗜乙酸棒桿菌反式-4-羥基-L-脯氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【IPC分類】C12N15/63, C12P13/24
【公開號(hào)】CN105603017
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610035787
【發(fā)明人】張震宇, 王曉姣, 姚動(dòng)邦, 魏照輝, 黃建華
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2016年5月25日
【申請(qǐng)日】2016年1月19日