采用分子探針檢測細胞內(nèi)特定mRNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種檢測細胞內(nèi)特定mRNA的方法，特別涉及一種通過分子探針熒光壽命成像來檢測細胞內(nèi)特定mRNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是全世界人類死亡的重要病因，因此癌癥的早期檢測和治療成為醫(yī)學和生物研究領(lǐng)域的一個重要挑戰(zhàn)。研究者已經(jīng)證明，內(nèi)生性癌癥相關(guān)的mRNA是患癌的重要指標，而且他們的表達水平能夠揭示癌癥進程與預(yù)后信息。因此，對細胞內(nèi)癌癥相關(guān)的mRNA的識別和鑒定能夠為癌癥的早期診斷和治療提供重要的信息。目前，已經(jīng)有很多方法來識別和鑒定mRNA，比如Northern印跡，微陣列分析技術(shù)，以及RT-PCR技術(shù)。但是，這些方法步驟繁瑣，對檢測的細胞的量要求很大，不能很好地對單個細胞進行實時檢測。
[0003]目前，一些基于熒光強度的測量方法也已經(jīng)被發(fā)展起來用于檢測活細胞內(nèi)的mRNA。其中一種方法就是納米信標(nanoflares)。這種方法在2007年被首次提出，用于細胞內(nèi)mRNA的檢測，并且現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛用于細胞內(nèi)其他分子的鑒定標識以及鑒定特異性的細胞。然而，盡管熒光強度能夠區(qū)分出樣品的熒光基團濃度的差別，但是靈敏度有限，不能區(qū)分出熒光強度差別小的樣品。與此同時，熒光強度的檢測方法還會受到例如激發(fā)光強度、檢測器增益、光路和樣品的光損失，樣品熒光基團濃度、光漂白等因素的影響，造成檢測誤差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，確有必要提供一種檢測穩(wěn)定，不受多種因素干擾的檢測方法。
[0005]—種采用分子探針檢測細胞內(nèi)特定mRNA的方法，其包括以下步驟:提供一摻有分子探針的第一培養(yǎng)基，所述分子探針包括修飾有熒光分子的報告DNA;將細胞置入含有第二培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng);在細胞占所述培養(yǎng)皿底部的60%-80%時，將該培養(yǎng)皿中的第二培養(yǎng)基吸掉，再把所述第一培養(yǎng)基放入該培養(yǎng)皿中，細胞繼續(xù)培養(yǎng)2-6個小時后，再將該第一培養(yǎng)基吸掉;采用激光共聚焦顯微鏡對細胞成像，并采用單光子計數(shù)器測量并計算細胞內(nèi)熒光分子的熒光壽命，得到熒光壽命成像圖，根據(jù)該熒光壽命成像圖檢測細胞中的特定mRNA是否存在的ig息。
[0006]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的采用分子探針檢測細胞內(nèi)特定mRNA的方法具有以下優(yōu)點:通過采用檢測細胞的熒光壽命的方法檢測細胞內(nèi)mRNA的信息是否存在，測量穩(wěn)定性強、準確度高;細胞無需特殊處理，操作簡便。
【附圖說明】
[0007]圖1是分子探針的結(jié)構(gòu)示意圖及遇到革ElmRNA后的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0008]圖2是分子探針、報告DNA鏈和對照組探針進入細胞后的熒光壽命成像圖。
[0009 ]圖3是分子探針和對照組探針進入細胞后的熒光壽命衰減曲線。
[0010]如下具體實施例將結(jié)合上述附圖進一步說明本發(fā)明。
【具體實施方式】
[0011 ]下面將結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明提供的采用分子探針檢測細胞內(nèi)mRNA的方法作進一步說明。
[0012]本發(fā)明提供一種采用分子探針檢測細胞內(nèi)特定mRNA的方法，其包括以下步驟:
Si，提供一摻有分子探針的第一培養(yǎng)基，所述分子探針包括修飾有熒光分子的報告
DNA；
S2，將細胞置入含有第二培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；
S3，在培養(yǎng)生長的細胞占所述培養(yǎng)皿底部面積的60%-80%時，將該培養(yǎng)皿中的第二培養(yǎng)基吸掉；
S4，把所述第一培養(yǎng)基放入該培養(yǎng)皿中，細胞繼續(xù)培養(yǎng)2-6個小時后，再將該第一培養(yǎng)基吸掉；
S5，采用激光共聚焦顯微鏡對細胞成像，利用單光子計數(shù)器測量并計算細胞內(nèi)顯示的熒光壽命，得到熒光壽命成像圖，根據(jù)該熒光壽命成像圖檢測細胞中的特定mRNA是否存在的信息。
[0013]在步驟SI中，所述分子探針包含一納米金、識別DNA及修飾有熒光分子的報告DNA組成。具體地，所述識別DNA包覆于所述納米金的表面，并通過識別DNA末端的巰基與納米金相連，所述修飾有熒光分子的報告DNA與該識別DNA通過堿基互補雜交。所述第一培養(yǎng)基還包含L-15培養(yǎng)基與10%胎牛血清(FBS)的混合物。該分子探針在第一培養(yǎng)基中的濃度為0.5nM-2 nM。進一步，所述含有分子探針的第一培養(yǎng)基可通過0.2μπι的無菌醋酸過濾器過濾，以去除雜質(zhì)和細菌。本實施例中，采用的識別DNA為5’-TCAAT TCAAT GTAGA CAGAC GTCTTTTGAG GTTTT TT-th1l-3’，3’端修飾巰基，用于與金連接;所采用的報告DNA為5 ’-cy5-CCTCA AAAGA CGTCT G-3’，5’端修飾cy5熒光分子;所述第一培養(yǎng)基為10%FBS+90%L_15，所述分子探針在第一培養(yǎng)基中的濃度為InM。
[0014]在步驟S2中，所述細胞為用于待檢測的試驗細胞，所述第二培養(yǎng)基為10%的胎牛血清與90%的L-15的混合物。該細胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的氣相條件為100%的空氣，培養(yǎng)溫度為37°，本實施例中，所采用的細胞為乳腺癌細胞MDA-MB-231。
[0015]在步驟S3中，所述細胞在培養(yǎng)皿中生長，當細胞生長鋪張至培養(yǎng)皿底部面積的60%-80%時，可利用移液槍將培養(yǎng)皿中的第二培養(yǎng)基吸掉。
[0016]在步驟S4中，當細胞在第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，分子探針會不斷被細胞內(nèi)吞進入細胞。在一段時間內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間的延長，進入細胞的分子探針的數(shù)量越多，后續(xù)檢測熒光壽命成像時也越容易觀察。當細胞在第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)束后，利用移液槍將培養(yǎng)皿中的第一培養(yǎng)基吸掉。
[0017]進一步，在第一培養(yǎng)基被吸掉后，還可包括一清洗細胞的步驟。在第一培養(yǎng)基被吸掉后，在細胞的膜表面可能會吸附殘余的培養(yǎng)基和分子探針成分，為了去除殘余成分，可采用緩沖液對細胞進行清洗。本實施例中，清洗細胞采用的緩沖液為0.0lM的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)0
[0018]進一步，還可包括對細胞內(nèi)細胞核進行染色的步驟。對細胞核進行染色后，可利用激光共聚焦顯微鏡發(fā)射405nm的激發(fā)光激發(fā)DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)染料有利于在后續(xù)測量熒光壽命分布時對細胞定位和聚焦。待細胞染色后可進一步對所述細胞進行清洗，以去除雜色。本實施例中，采用DAPI染料對細胞核染色，染色時間為15分鐘，并采用
0.0lM的PBS對染色后的細胞進行清洗。
[0019]在步驟S5中，在測量及計算細胞內(nèi)顯示的熒光壽命時，采用激發(fā)光激發(fā)細胞內(nèi)報告DNA上修飾的熒光分子，并收集熒光分子發(fā)射光，根據(jù)光子的能量衰減計算熒光壽命，得到熒光壽命成像圖，并根據(jù)該熒光壽命成像圖得到檢測細胞內(nèi)的mRN