利用包含含蛋白膜囊泡的抗原組合物制備多克隆抗體的方法
【專利說明】利用包含含蛋白膜囊泡的抗原組合物制備多克隆抗體的方法
【背景技術(shù)】
[0001] 在診斷學(xué)和治療學(xué)中抗體是強(qiáng)大和非常寶貴的工具。根據(jù)高特異性抗體的需求不 斷增長，隨著時(shí)間已開發(fā)許多不同策略W允許可靠地生產(chǎn)足量的抗體（參見例如， J. S.Haurum，Drug Discove巧 Today，2006.11 (13-14)，655-660)。在運(yùn)種背景下，1975年雜 交瘤技術(shù)的發(fā)現(xiàn)代表重大突破，因?yàn)樾∈箅s交瘤是單克隆抗體的第一種可靠來源。
[0002] 在理論上，可W針對選定的任何祀標(biāo)開發(fā)單克隆抗體。選定的祀標(biāo)的提供是絕對 必要的。即使在基因免疫的情況下，也需要抗原用于篩選和證實(shí)目的。不幸的是，在某些情 況下，如果在基于細(xì)胞的測定中抗原分離或制備均不成功，則抗原的提供可能成為問題。
[0003] 通常，抗原屬于蛋白和膚的類別，但是原則上其他物質(zhì)類別也可W用作免疫原，例 如多糖、脂質(zhì)和多核巧酸。在大多數(shù)情況下，應(yīng)當(dāng)針對天然抗原產(chǎn)生抗體。如果抗原是通過 重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的，則比較所得的重組蛋白或膚與其天然對應(yīng)物的特性是非常重要的，因 為蛋白結(jié)構(gòu)的差異可W導(dǎo)致免疫原性的差異。對于抗體制備，蛋白和膚是高度感興趣的祀 標(biāo)。鑒于免疫原性表位是線性的且不依賴于完整蛋白的=級結(jié)構(gòu)的事實(shí)，膚合成代表基于 細(xì)胞的表達(dá)的另一種選擇。在另一方面，膚合成具有其局限性，因?yàn)榈鞍缀湍w具有翻譯后修 飾(PTM)，運(yùn)是S維表位的部分。此外，使用膚和膚混合物作為抗原可W誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉反應(yīng) 性抗體。
[0004] 膜蛋白占所有測序的基因組的近=分之一。與它們在細(xì)胞過程如信號傳導(dǎo)、代謝、 轉(zhuǎn)運(yùn)和識別中的重要參與相反，關(guān)于膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能性可獲得的信息很少。在體內(nèi)它們 生物學(xué)活性的下調(diào)可W導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，使得它們成為高度感興趣的藥理學(xué)祀標(biāo)。運(yùn)種發(fā)展 引起對膜蛋白特異性抗體的需求增加。
[0005] 針對膜蛋白的特異性抗體的產(chǎn)生常受到不能制備或分離某種祀膜蛋白的限制。在 體內(nèi)過量表達(dá)膜蛋白常受到蛋白錯(cuò)誤折疊、不溶性、聚集、低產(chǎn)率和細(xì)胞毒性的妨礙。但是， 膜蛋白的無細(xì)胞表達(dá)可W克服運(yùn)些障礙。
[0006] 在過去的十年里，無細(xì)胞蛋白合成已成為制備包括膜蛋白、胞質(zhì)蛋白或甚至毒性 蛋白在內(nèi)的不同蛋白類別的有價(jià)值的工具（參見例如，Katzen etal. ,Trends Biotechnol. ,2005.23(3) ,150-156)。高效無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)是具翻譯活性的細(xì)胞提 取物，其包含翻譯的必要組分如核糖體、翻譯因子和酶。此外，細(xì)胞裂解物補(bǔ)充了氨基酸、 ATP和GTP和能量再生系統(tǒng)(例如肌酸-憐酸/肌酸-激酶能量-再生系統(tǒng)）。祀蛋白的合成通過 添加 DNA或mRNA形式的適當(dāng)模板來起始。到目前為止，已在原核和真核無細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)許 多不同類型的功能活性祀蛋白。與原核細(xì)胞提取物相比，真核細(xì)胞裂解物在表達(dá)需要翻譯 后修飾的復(fù)雜蛋白中提供幾個(gè)優(yōu)勢。
[0007] 然而，使用通過原核和真核細(xì)胞裂解物合成的蛋白根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法制備 特異性抗體仍設(shè)及額外的費(fèi)力的純化和/或分離步驟，W便提供合適形式的期望祀蛋白用 作免疫原性物質(zhì)。
[000引鑒于現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的主要目的是提供改進(jìn)的方法和手段用于制備針對 特定祀蛋白的多克隆抗體。
[0009] 運(yùn)個(gè)目的已通過提供制備針對特定祀蛋白的多克隆抗體的新方法實(shí)現(xiàn)，所述方法 利用包含權(quán)利要求1和2的含蛋白膜囊泡的抗原組合物進(jìn)行制備。本發(fā)明的其他方面和更多 具體實(shí)施方案是其他權(quán)利要求的主題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 根據(jù)權(quán)利要求1制備針對抗原祀蛋白的多克隆抗體的方法包括通過向宿主施用包 含滲有所述抗原祀蛋白的膜囊泡的免疫原性組合物來在所述宿主中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，W及從 所述宿主血清獲得針對所述祀蛋白的抗體。
[0011] 根據(jù)權(quán)利要求2的更具體的方法至少包括W下步驟：
[0012] a)通過體外翻譯反應(yīng)在反應(yīng)介質(zhì)中合成所述祀蛋白，所述反應(yīng)介質(zhì)包含編碼所述 祀蛋白的核酸模板和含有膜囊泡的細(xì)胞裂解物；
[0013] b)從所述介質(zhì)分離包含所合成的祀蛋白的膜囊泡；
[0014] C)在生理上相容的介質(zhì)中提供包含所合成的祀蛋白的膜囊泡；
[0015] d)向宿主施用步驟C)的膜囊泡；
[0016] e)測試所述宿主的血清樣品針對所述祀蛋白的特異性免疫反應(yīng);W及
[0017] f)從表現(xiàn)出針對所述祀蛋白的特異性免疫反應(yīng)的宿主的血清獲得針對所述祀蛋 白的特異性抗體。
[0018] 本發(fā)明人的研究令人驚訝地證實(shí)可W使用滲有至少一種祀蛋白的膜囊泡的制品， 直接作為免疫原性組合物用于在宿主中產(chǎn)生針對祀蛋白的特異性抗體。運(yùn)樣的膜囊泡制品 對于宿主基本上是無毒的，并且可W用來有利地誘導(dǎo)強(qiáng)免疫反應(yīng)而不添加任何其他免疫刺 激劑。
[0019] 合適的膜囊泡制品是例如運(yùn)樣獲得的，在包含編碼祀蛋白的核酸模板和包含膜囊 泡的細(xì)胞裂解物的反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行無細(xì)胞翻譯反應(yīng)，并且在翻譯反應(yīng)之后從所述介質(zhì)分離 含蛋白的囊泡。
[0020] 優(yōu)選地，所述細(xì)胞裂解物為真核細(xì)胞裂解物。
[0021] 不特別限制所述真核細(xì)胞裂解物，原則上可W是任何細(xì)胞裂解物，其包含所使用 的核酸模板的體外翻譯W及任選地所合成祀蛋白的修飾所需要的所有組分。
[0022] 更具體地，所述真核細(xì)胞裂解物選自小麥胚芽裂解物，昆蟲細(xì)胞裂解物特別是 Sf 21細(xì)胞裂解物，網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物，角質(zhì)形成細(xì)胞裂解物，來自CHO細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、骨髓 瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞或培養(yǎng)的淋己瘤細(xì)胞的細(xì)胞提取物。
[0023] 運(yùn)些細(xì)胞裂解物可W W它們的天然形式使用，或者通過添加或去除特定組分進(jìn)行 修飾。
[0024] 下文實(shí)例中使用的無細(xì)胞系統(tǒng)是基于產(chǎn)生自培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞（草地夜蛾 (Spodoptera frugiperda)，Sf21)的具翻譯活性的裂解物。通過保留亞細(xì)胞組分完整性的 非常溫和的裂解物制備方法，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)化R)的重要部分可W保留在裂解物中作為功能活性膜 囊泡。利用含有囊泡類型的裂解物，可W對祀蛋白進(jìn)行翻譯后修飾(PTM)如糖基化、信號膚 切割、脂質(zhì)化、憐酸化和二硫鍵形成。
[0025] 如果獲得自特定細(xì)胞系的原始細(xì)胞裂解物不含膜囊泡(例如網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物）， 則可W添加來自不同來源的囊泡，例如來自不同細(xì)胞系的裂解物。
[0026] 優(yōu)選地，膜囊泡和細(xì)胞裂解物源自相同細(xì)胞系。
[0027] 此外，還可W使用其中一種或多種組分已合成制備的人工細(xì)胞裂解物。
[0028] 用于體外翻譯反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)包含所述裂解物，所述裂解物包含翻譯的必要組分 如核糖體、翻譯因子和酶。此外，所述介質(zhì)或細(xì)胞裂解物補(bǔ)充了氨基酸、ATP和GTP和能量再 生系統(tǒng)(例如肌酸-憐酸/肌酸-激酶能量-再生系統(tǒng)）。祀蛋白的合成通過添加 DNA或mRNA形 式的祀蛋白的適當(dāng)核酸模板來起始。
[0029] 包含合成的祀蛋白的膜囊泡可W通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法自反應(yīng)介質(zhì) 分離，特別是通過離屯、或過濾的方式。
[0030] 在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟a)的體外翻譯反應(yīng)在促進(jìn)膜囊泡中合成祀蛋 白的富集的條件下發(fā)生。
[0031] 獲得運(yùn)樣的膜囊泡中合成祀蛋白的富集的一種示例性方法包括權(quán)利要求2的方法 的修改，其中權(quán)利要求2的步驟b)之后是額外的步驟b')，其包括將分離的膜囊泡轉(zhuǎn)移入第 二反應(yīng)介質(zhì)，所述第二反應(yīng)介質(zhì)包含編碼祀蛋白的核酸模板和不含膜囊泡的細(xì)胞裂解物， 在所述第二反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行體外翻譯反應(yīng)，W及從第二介質(zhì)分離包含增加量的合成祀蛋白 的膜囊泡，其中步驟b'可W重復(fù)一次或多次。
[0032] 在一可選實(shí)施方式中，步驟a)中的體外翻譯反應(yīng)是通過基于連續(xù)透析的方法進(jìn)行 的，所述方法包括在翻譯反應(yīng)的過程中添加和/或排出反應(yīng)物或產(chǎn)物。運(yùn)種反應(yīng)形式延長反 應(yīng)時(shí)間，因此增加總蛋白產(chǎn)率。
[0033] 通常，運(yùn)個(gè)實(shí)施方式在包含至少2個(gè)通過透析膜分隔的隔室的裝置中實(shí)現(xiàn)，其中翻 譯反應(yīng)在至少一個(gè)第一隔室，反應(yīng)隔室中發(fā)生，并且在翻