蛋 白質(zhì)可W是流感表面蛋白質(zhì)。可從完整病毒中分離流感表面蛋白質(zhì)或者其可W表面蛋白質(zhì) 的形式作為完整流感病毒的部分原位存在。流感病毒可W是甲型流感病毒或乙型流感病 毒。當(dāng)是甲型流感病毒時，其可W是甲型流感病毒HA亞型刖、肥、冊、擬、冊、冊、^、冊、冊、 H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16中的任意一種，或者甲型流感病毒NA亞型N1、N2、N3、N4、 N5、N6、N7、N8或N9中的任意一種。當(dāng)是乙型流感病毒時，其可W是B/Victoria/2/87樣或B/ Yamaga1:a/l6/88 樣毒株。
[0054] 通常使用細胞系擴增流感病毒，但原代細胞可用作替代。該細胞通常為哺乳動物 細胞，但也可使用禽類或昆蟲細胞。合適的哺乳動物細胞包括但不限于人、倉鼠、牛、靈長類 和犬細胞。在一些實施方式中，該細胞是人非腎細胞或非人細胞。可W使用多種細胞，如腎 細胞、成纖維細胞、視網(wǎng)膜細胞、肺細胞等。合適的倉鼠細胞的示例是名為BHK21或HKCC的細 胞系。合適的猴細胞是例如非洲綠猴細胞，如Vero細胞系中腎細胞。合適的犬細胞是(例如） 腎細胞，例如CLDK和MDCK細胞系中。合適的禽類細胞包括衍生自雞胚胎干細胞的EBx細胞 系、EB45、邸 14 和邸 14-074。
[0055] 如US1498261中所述，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的流感病毒可在雞蛋中培養(yǎng)?；?上，收集含病毒的尿囊液并且通過憐酸鹽緩沖鹽水中的薦糖梯度離屯、濃縮并純化病毒。病 毒還通過在憐酸鹽緩沖鹽水中透析來濃縮并且滅活。通過與CTAB反應(yīng)從病毒上裂解HA和NA 蛋白質(zhì)，然后通過梯度離屯、或分子篩色譜W從蛋白質(zhì)中分離病毒殘留顆粒。因此，本發(fā)明的 一部分是制備流感疫苗的過程，其中進行W下步驟：（1)在雞蛋中培養(yǎng)病毒；（2)收獲含病毒 的尿囊液；（3)濃縮并純化病毒；（4)滅活病毒；（5)病毒過濾通過用去污劑預(yù)處理的膜；（6) 通過用CTAB處理裂解病毒；（7)純化感興趣的病毒蛋白質(zhì)；和(8)任選地將病毒蛋白質(zhì)配制 成疫苗。
[0056] US20110243987提供了病毒蛋白質(zhì)的合適制備物的詳細描述?；旧?，制造過程可 分為4個主要部分：1)使工作種株在受精雞蛋中增殖，收獲并收集受感染的尿囊液W得到 "粗制單價完整病毒體"。2)純化各病毒毒株產(chǎn)生"純化的單價完整病毒體"。3)用脫氧膽酸 鋼來裂解純化的單價完整病毒體，產(chǎn)生"純化的單價裂解病毒體"。4)通過用脫氧膽酸鋼和 甲醒解育，之后超濾并無菌過濾來2步滅活純化的單價裂解病毒體，W得到"純化的單價滅 活裂解病毒體"或"單價體"。
[0057] 純化的單價完整病毒體的生產(chǎn)如下:通過連續(xù)中速離屯、來凈化收獲的尿囊液。該 步驟去除了可能已經(jīng)在尿囊液收獲期間收集的大顆粒(例如，雞蛋殼的部分）。吸附步驟:該 步驟允許通過病毒材料的沉淀，通過吸附至二元憐酸氨巧凝膠來進一步進化尿囊液。在持 續(xù)至少8小時至最大36小時的沉降之后，去除上清液并且在8.7%抓TA二鋼溶液中重溶含流 感病毒的沉降物。過濾:重懸的流感沉降物過濾通過6-WI1濾膜W去除潛在剩余的團塊。
[0058] 流出通過超速離屯、:流感病毒通過在線性薦糖梯度中的等密度超離屯、進一步純化 (去除蛋白質(zhì)和憐脂)和濃縮。含病毒的部分通過超濾進一步純化。純化的單價裂解病毒體 的生產(chǎn)如下:通過離屯、通過含I. 5%脫氧膽酸鋼的線性薦糖梯度來裂解和進一步純化流感 病毒。吐溫-80 W 0.1 %存在于梯度中。
[0059] 純化的最終單價裂解滅活病毒體的制備如下:純化的單價裂解病毒體逐漸向下過 濾至0.45WI1濾膜，簡單超聲處理（W促進過濾）并過濾通過0 .化m膜。在過濾結(jié)束時，用含 0.025%吐溫-80的憐酸鹽緩沖液沖洗濾器。脫氧膽酸鋼滅活:所得的溶液在22±2°C下解育 至少84小時。在完成第一滅活步驟之后，用憐酸鹽緩沖液稀釋材料W將總蛋白質(zhì)含量降低 至50化g/mL的計算濃度。
[0060] 甲醒滅活:加入甲醒至10化g/mL的計算最終濃度。滅活在20±2°C下單次使用低密 度聚乙締10化袋持續(xù)至少72小時下發(fā)生。滅活的裂解病毒材料超濾通過30000道爾頓的分 子量截止值的膜。在體積減少之后，通過加入含0.0 l %吐溫-80的憐酸鹽緩沖鹽水和憐酸鹽 緩沖液使體積在超濾(滲濾)期間保持恒定。在超濾期間，甲醒、NaDoc和薦糖的含量減少。材 料濃縮至15-25升并且立即轉(zhuǎn)移至最終過濾步驟。無菌過濾:在超濾之后，裂解滅活的材料 逐漸過濾降至0.2WI1膜。最終無菌過濾通過0.22WI1無菌級膜。
[0061 ] 在US20110243987中所述的過程期間，在不同步驟上應(yīng)用本發(fā)明。本發(fā)明的一個實 施方式是產(chǎn)生純化的單價完整病毒體的方法，其中進行W下步驟：（1)在雞蛋中培養(yǎng)流感病 毒；（2)收獲并凈化尿囊液；（3)收集含病毒的尿囊液；（3)通過吸附至二元憐酸氨巧凝膠來 沉淀病毒；（4)重懸病毒；（5)病毒過濾通過膜，其中膜已用去污劑預(yù)處理。
[0062] 另一個實施方式是產(chǎn)生純化的單價裂解病毒體，其中進行W下步驟：（1)裂解純化 的單價裂解病毒體(優(yōu)選用脫氧膽酸鋼）；（2)純化裂解的病毒(優(yōu)選通過離屯、）；（3)純化的 裂解病毒過濾通過已經(jīng)用去污劑預(yù)處理的濾膜。濾膜優(yōu)選是0.45WI1濾膜，之后是0.2WI1膜。
[0063] 本發(fā)明的另一個實施方式是產(chǎn)生滅活的純化的單價滅活裂解病毒體，其中進行W 下步驟：（1)滅活純化的單價裂解病毒體；（2)滅活的純化的單價體過濾通過已經(jīng)用去污劑 預(yù)處理的濾膜。在優(yōu)選的實施方式中，用脫氧膽酸鋼和甲醒進行滅活。
[0064] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明對聚山梨醋80和聚丙締濾器特別有效。該組合對含流感病毒和亞 病毒粒子顆粒的流體尤其有效。
[0065] 本發(fā)明的方法可包括將包含蛋白質(zhì)的流體通過超過一個濾器W獲得濾液。如果使 用超過一個濾器，則濾器中的至少一個是經(jīng)處理的濾器。優(yōu)選地，用于產(chǎn)生濾液的所有濾器 是經(jīng)處理的濾器。例如，流體可通過2個經(jīng)處理的濾器。該方法采用的各經(jīng)處理的濾器可具 有彼此相同的孔徑。作為一個替代，濾器中的一個或多個可具有與方法中采用的其他濾器 不同的孔徑。在一個可能的排列中，流體通過孔徑為扣m的經(jīng)處理的濾器，并且然后通過孔 徑為1.2皿的經(jīng)處理的濾器W產(chǎn)生濾液。
[0066] 本發(fā)明的方法可包括至少一個其他純化步驟。在蛋白質(zhì)W完整病毒的部分存在的 情況中，本發(fā)明的方法還可包括滅活病毒的步驟。本發(fā)明的方法還可包括其他加工步驟，例 如，在滅活病毒的步驟之前或之后的至少一個進一步純化步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠應(yīng) 用蛋白質(zhì)和病毒純化所需的最優(yōu)加工步驟。
[0067] 在一個方面，本發(fā)明設(shè)及產(chǎn)生免疫原性組合物的方法，包括W下步驟:如本文所述 過濾流體和從濾液制備免疫原性組合物。免疫原性組合物優(yōu)選是流感疫苗，例如，=價疫 苗、單價疫苗、四價疫苗或屯價疫苗。
[0068] 疫苗(特別針對流感病毒)通?；诨畈《净驕缁畈《?。滅活疫苗可基于完整病毒 顆粒、"裂解"病毒顆?；蚧诩兓谋砻婵乖??？乖部蒞病毒體形式存在?？墒褂帽景l(fā)明 制造任意運些類型的疫苗。采用滅活病毒時，該疫苗可包含完整的病毒體、分裂病毒體或純 化的表面抗原(對于流感，包括血凝素，通常也包括神經(jīng)氨酸酶）。
[0069] 本發(fā)明的方法還可用于生產(chǎn)活疫苗。通常通過從含病毒的流體中純化病毒體來制 備運類疫苗。
[0070] 本發(fā)明的另一個方面設(shè)及使用通過本文所述的方法生產(chǎn)的濾液生產(chǎn)免疫原性組 合物的方法。
[0071] 本發(fā)明的一個方面設(shè)及通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的濾液。該濾液的特征在于在應(yīng)容 易地通過濾器的粒度范圍中有小量的蛋白質(zhì)損失。換而言之，當(dāng)與現(xiàn)有技術(shù)的濾液相比時， 本發(fā)明的濾液具有低得多的蛋白質(zhì)損失。
[0072] 預(yù)期通過濾器的濾液中存在的蛋白質(zhì)的量(取決于其相對于濾器孔徑的尺寸）可 能比預(yù)期通過濾器的過濾前流體中存在的蛋白質(zhì)的量(取決于其相對于濾器孔徑的尺寸） 低小于10%。可能低小于8%或優(yōu)選低小于5%，小于4%，小于3%，小于2%或低小于1 %。
[0073] 本發(fā)明的濾液相對于未處理的濾器的濾液中蛋白質(zhì)的產(chǎn)率的所得增加可W是多 10%或更多、多15%或更多、優(yōu)選多20%或更多、多30%或更多、多40%或更多、多50%或更 多、多60%或更多、多70%或更多、多80%或更多、多90%或更多。
[0074] 可使用本領(lǐng)域已知方法中的任一種來測量濾液中存在的蛋白質(zhì)的量，例如，可使 用蛋白質(zhì)的BCA試驗來測量存在的蛋白質(zhì)的量。如果蛋白質(zhì)是流感病毒形式，其可W通過對 流感病毒RNA特異性的定量PCR試驗測量。
[0075] 在另一個方面中，本發(fā)明設(shè)及用于本發(fā)明的方法的經(jīng)處理的濾器。具體地，本發(fā)明 設(shè)及在疫苗