一種金魚(yú)藻組織培養(yǎng)與快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及沉水植物金魚(yú)藻的組培和快速繁殖 方法，該方法是利用完全無(wú)菌和嚴(yán)格的控溫措施，實(shí)現(xiàn)了沉水植物金魚(yú)藻在實(shí)驗(yàn)室大量生 產(chǎn)，并可以推廣到生態(tài)環(huán)境修復(fù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 金魚(yú)藻屬于金魚(yú)藻科金魚(yú)藻屬，在湖泊生態(tài)修復(fù)工程中作為凈水工具種和植被恢 復(fù)先鋒物種、魚(yú)蝦蟹塘養(yǎng)殖過(guò)程中作為餌料、避難和產(chǎn)卵場(chǎng)所，以及室內(nèi)觀(guān)賞水族養(yǎng)殖過(guò)程 中作為布景材料。目前尚缺乏成熟技術(shù)，可以大規(guī)模擴(kuò)繁金魚(yú)藻優(yōu)質(zhì)工程苗，同時(shí)克服該物 種在自然環(huán)境中種源有限且污染嚴(yán)重的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供了一種金魚(yú)藻組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，該方法是在無(wú)菌條件下，采 取控溫措施，給予固定光照，培養(yǎng)無(wú)菌苗體系，可常年提供大量無(wú)菌幼苗。方法易行，操作方 便，產(chǎn)量高。
[0004] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種金魚(yú)藻組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，包括以下步驟： A、 外植體選擇與預(yù)處理:選擇生長(zhǎng)健壯，顏色鮮綠，無(wú)病蟲(chóng)害的可萌發(fā)腋芽的金魚(yú)藻莖 段作為外植體，然后用洗滌劑浸泡，無(wú)菌水清洗進(jìn)行預(yù)處理； B、 外植體滅菌： 用酒精和植物組織抗菌劑處理外植體，制備無(wú)菌外植體； C、 芽誘導(dǎo):選擇0.50 mg/L 6-BA和1.30mg/L IAA的MS固體培養(yǎng)基，蔗糖質(zhì)量體積濃度 為3%，pH調(diào)至5.8-6.0，固體培養(yǎng)基裝于50毫升三角瓶中，每瓶20毫升；固體培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)120 °(：滅菌處理20min，冷卻后，接入滅菌處理后的1-1.5cm的金魚(yú)藻外植體，于光照培養(yǎng)箱中靜 置培養(yǎng)，待幼芽長(zhǎng)至1.0-1.5cm進(jìn)行增殖培養(yǎng)； D、 增殖培養(yǎng):選擇蔗糖質(zhì)量體積濃度1.5%的1/2 MS液體培養(yǎng)基，添加0.5-2.00 mg/L 6-BA和0.01-1.00 mg/L IAA的激素;液體培養(yǎng)基分裝于200毫升三角瓶中，每瓶100毫升，培 養(yǎng)基滅菌方式與芽誘導(dǎo)相同，接入長(zhǎng)1.0-1.5cm的幼芽置于光照培養(yǎng)箱中靜置，進(jìn)行增殖培 養(yǎng)； E、 煉苗和移栽:待金魚(yú)藻無(wú)菌苗長(zhǎng)至4. Ocm即可煉苗，打開(kāi)瓶蓋，室溫下煉苗l-2d后洗 凈培養(yǎng)基，取出試管苗，移栽至自然水體中； 所述的步驟C，D，E均采用無(wú)菌環(huán)境，光照60-70μΕ/(πι2 · s)，光照周期為12h/d，室內(nèi)溫 度（25±2)°C。
[0005] 所述步驟A中，預(yù)處理的具體步驟如下：用堿性洗滌劑浸泡30min，再用自來(lái)水沖洗 1小時(shí)，用蒸餾水反復(fù)沖洗4-5次，用無(wú)菌水再反復(fù)清洗4-5次，置于無(wú)菌操作臺(tái)。
[0006] 所述步驟B中，在無(wú)菌操作臺(tái)上首先用75%乙醇浸泡15秒，用無(wú)菌水沖洗4-5次，再 用5%植物組培抗菌劑PPM進(jìn)行表面消毒5min，無(wú)菌水沖洗4-5次，在無(wú)菌濾紙上將水吸干，待 用。
[0007]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)： 目前關(guān)于金魚(yú)藻組織培養(yǎng)的技術(shù)未見(jiàn)報(bào)道，也沒(méi)有系統(tǒng)的對(duì)金魚(yú)藻作出研究。但是金 魚(yú)藻是污染水體中最后堅(jiān)守的水生植物，水體污染的后期，幾乎只剩下金魚(yú)藻，可見(jiàn)金魚(yú)藻 的耐污能力較強(qiáng)，因此獲得足夠的金魚(yú)藻可以為水環(huán)境修復(fù)提供源源不斷的種苗。該技術(shù) 能直接誘導(dǎo)金魚(yú)藻幼芽的生長(zhǎng)，不斷產(chǎn)生叢生芽，而且在液體環(huán)境中才能更好實(shí)現(xiàn)金魚(yú)藻 無(wú)菌苗的增殖培養(yǎng)。金魚(yú)藻一年四季均可生長(zhǎng)，但是冬季生長(zhǎng)會(huì)變得遲緩，高溫也會(huì)導(dǎo)致生 長(zhǎng)緩慢，利用本發(fā)明可以不受季節(jié)、溫度、地域影響，獲得大量的無(wú)菌苗。一個(gè)為長(zhǎng)1.5cm的 外植體經(jīng)過(guò)一個(gè)月的培養(yǎng)可以繁殖出3-9cm長(zhǎng)的幼苗，30d的增殖系數(shù)最高可達(dá)到18倍，一 年一個(gè)芽理論上可繁殖十億棵以上幼苗，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)越于自然水體植物的繁殖速度。以一個(gè)芽 30 d繼代一次，每次的繁殖系數(shù)為18計(jì)算，預(yù)期結(jié)果如下表1所示。

【具體實(shí)施方式】
[0009] 本發(fā)明實(shí)施例所使用的試劑，如未特別說(shuō)明，市售的均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述技術(shù)方 案，如未特別說(shuō)明，均可采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。
[0010] 實(shí)施例1 A、 外植體選擇與預(yù)處理:選擇生長(zhǎng)健壯，顏色鮮綠，無(wú)病蟲(chóng)害的可萌發(fā)腋芽的莖段作為 外植體，用堿性洗滌劑浸泡30min，再在自來(lái)水下沖洗兩小時(shí)，用蒸餾水反復(fù)沖洗4-5次，用 無(wú)菌水再反復(fù)清洗4-5次，置于無(wú)菌操作臺(tái)； B、 外植體滅菌:在無(wú)菌操作臺(tái)上首先用75%乙醇浸泡15秒，用無(wú)菌水沖洗4-5次，再用5% 植物組培抗菌劑(PPM)進(jìn)行表面消毒5分鐘，無(wú)菌水沖洗4-5次，在無(wú)菌濾紙上將水吸干，待 用； C、 芽誘導(dǎo):選擇0.50 mg/L 6-BA和1.30 mg/L IAA的MS固體培養(yǎng)基，蔗糖濃度為3%(質(zhì) 量體積比），pH調(diào)至5.8,培養(yǎng)基裝于50毫升三角瓶中，每瓶20毫升。培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)120°C滅菌處 理20min，冷卻后，接入長(zhǎng)約1.5cm的金魚(yú)藻外植體。置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待芽長(zhǎng)至 1 · 5cm可進(jìn)行增殖培養(yǎng)； D、 增殖培養(yǎng):選擇1.5%蔗糖濃度(質(zhì)量體積比）的1/2MS液體培養(yǎng)基，添加0.50mg/L 6-BA和0.01mg/L IAA激素。液體培養(yǎng)基裝于200毫升三角瓶中，每瓶100毫升，培養(yǎng)基滅菌方式 與芽誘導(dǎo)相同，每瓶接入6棵，放入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行增殖培養(yǎng)； E、 煉苗和移栽:金魚(yú)藻為不定根水生植物，不需根也可以生長(zhǎng)，待無(wú)菌苗長(zhǎng)至4. Ocm即 可煉苗，打開(kāi)瓶蓋，室溫下煉苗1 -2d后(打開(kāi)瓶蓋，靜置在培養(yǎng)箱內(nèi)即可），洗凈培養(yǎng)基，取出 試管苗，移栽至自然水體中。
[0011] 步驟C，D，E均為無(wú)菌環(huán)境，光照60-70μΕ/(πι2 · s)，光照周期為12h/d，室內(nèi)溫度(25 ±2)°C。
[0012] 所述MS培養(yǎng)基配方如下:單位mg/L KNO3 1900 NH4NO3 1650 MgSO4·7Η20 370 KH2PO4 170 CaCl2·2Η20 440 MnSO4·4Η20 22.3 ZnS04-7H20 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 Na2MoO4-7Η20 0.25 CuSO4.5Η20 0.025 CoCL2.6Η20 0.025 Na2-EDTA 37.3 FeSO4-7 H2O 27.8 甘氨酸 2.0 鹽酸吡哆醇0.5 鹽酸硫銨素0.1 煙酸 0.5 肌酸 100。
[0013] 固體培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)配方中加入6g/L瓊脂。
[0014] 本方法可以由一個(gè)外植體直接誘導(dǎo)出幼芽，再不斷繁殖得到更多的叢芽，30 d的 增殖系數(shù)達(dá)到18，且獲得幼苗和自然環(huán)境中的金魚(yú)藻沒(méi)有差別。存活率大于90%。
[0015] 實(shí)施例2 A、 外植體選擇與預(yù)處理:選擇生長(zhǎng)健壯，顏色鮮綠，無(wú)病蟲(chóng)害的可萌發(fā)腋芽的莖段作為 外植體，用堿性洗滌劑浸泡30min，再在自來(lái)水下沖洗兩小時(shí)，用蒸餾水反復(fù)沖洗4-5次，用 無(wú)菌水再反復(fù)清洗4-5次，置于無(wú)菌操作臺(tái)； B、 外植體滅菌:在無(wú)菌操作臺(tái)上首先用75%乙醇浸泡15秒，用無(wú)菌水沖洗4-5次，再用5% 植物組培抗菌劑(PPM)進(jìn)行表面消毒5分鐘，無(wú)菌水沖洗4-5次，在無(wú)菌濾紙上將水吸干，待 用； C、 芽誘導(dǎo)：選擇0.50mg/L 6-BA和1.30/L IAA的MS固體培養(yǎng)基，蔗糖濃度為3%(質(zhì)量體 積比），pH調(diào)至6.0,培養(yǎng)基裝于50毫升三角瓶中，每瓶20毫升。培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)120°C滅菌處理 20min，冷卻后，接入長(zhǎng)約1.5cm的金魚(yú)藻外植體，置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待新芽長(zhǎng)至 1 · 5cm可進(jìn)行增殖培養(yǎng)； D、 增殖培養(yǎng):選擇1.5%蔗糖濃度(質(zhì)量體積比）的I/2MS液體培養(yǎng)基，添加2mg/L 6-BA和 lmg/L IAA激素。液體培養(yǎng)基裝于200毫升三角瓶中，每瓶100毫升，培養(yǎng)基滅菌方式與芽誘 導(dǎo)相同，每瓶接入6棵，置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)； E、 煉苗和移栽:金魚(yú)藻為不定根水生植物，不需要根也可以生長(zhǎng)，待無(wú)菌苗長(zhǎng)至4.Ocm 即可煉苗，打開(kāi)瓶蓋，室溫下煉苗l-2d后(打開(kāi)瓶蓋，靜置在培養(yǎng)箱內(nèi)即可），洗凈培養(yǎng)基，取 出試管苗，移栽至自然水體中。
[0016] C，D，E均為無(wú)菌環(huán)境，平均光照60-70μΕ八m2 · S)，光照周期為12h/d，室內(nèi)溫度(25 ±2)°C。
[0017] 本方法由一個(gè)外植體直接誘導(dǎo)出幼苗，30 d的增殖系數(shù)可以達(dá)到8倍，存活率大于 85%〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種金魚(yú)藻組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步驟： A、 外植體選擇與預(yù)處理:選擇生長(zhǎng)健壯，顏色鮮綠，無(wú)病蟲(chóng)害的可萌發(fā)腋芽的金魚(yú)藻莖 段作為外植體，然后用洗滌劑浸泡，無(wú)菌水清洗進(jìn)行預(yù)處理； B、 外植體滅菌： 用酒精和植物組織抗菌劑處理外植體，制備無(wú)菌外植體； C、 芽誘導(dǎo)：選擇0.50 mg/L 6-BA和1.30mg/L IAA的MS固體培養(yǎng)基，蔗糖質(zhì)量體積濃度 為3%，pH調(diào)至5.8-6.0，固體培養(yǎng)基裝于50毫升三角瓶中，每瓶20毫升；固體培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)120 °(：滅菌處理20min，冷卻后，接入滅菌處理后的1-1.5cm的金魚(yú)藻外植體，于光照培養(yǎng)箱中靜 置培養(yǎng)，待幼芽長(zhǎng)至1.0-1.5cm進(jìn)行增殖培養(yǎng)； D、 增殖培養(yǎng):選擇蔗糖質(zhì)量體積濃度1.5%的1/2 MS液體培養(yǎng)基，添加0.5-2.00 mg/L 6-BA和0.01-1.00 mg/L IAA的激素;液體培養(yǎng)基分裝于200毫升三角瓶中，每瓶100毫升，培 養(yǎng)基滅菌方式與芽誘導(dǎo)相同，接入長(zhǎng)1.0-1.5cm的幼芽置于光照培養(yǎng)箱中靜置，進(jìn)行增殖培 養(yǎng)； E、 煉苗和移栽:待金魚(yú)藻無(wú)菌苗長(zhǎng)至4.0cm即可煉苗，打開(kāi)瓶蓋，室溫下煉苗l-2d后洗 凈培養(yǎng)基，取出試管苗，移栽至自然水體中； 所述的步驟C，D，E均采用無(wú)菌環(huán)境，光照60-70μΕ八m2 · s)，光照周期為12h/d，室內(nèi)溫度 (25±2)°C。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A中，預(yù)處理的具體步驟如下：用 堿性洗滌劑浸泡30min，再用自來(lái)水沖洗1小時(shí)，用蒸餾水反復(fù)沖洗4-5次，用無(wú)菌水再反復(fù) 清洗4-5次，置于無(wú)菌操作臺(tái)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟B中，在無(wú)菌操作臺(tái)上首先用75% 乙醇浸泡15秒，用無(wú)菌水沖洗4-5次，再用5%植物組培抗菌劑PPM進(jìn)行表面消毒5min，無(wú)菌水 沖洗4-5次，在無(wú)菌濾紙上將水吸干，待用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種金魚(yú)藻組織培養(yǎng)與快速繁殖方法。A、外植體選擇：選擇生長(zhǎng)健壯，顏色鮮綠，無(wú)病蟲(chóng)害的植物莖段作為外植體。B、外植體滅菌：用酒精和植物組織抗菌劑處理外植體，制備無(wú)菌外植體。C、芽誘導(dǎo)：選擇激素種類(lèi)和濃度配比組合誘導(dǎo)芽生長(zhǎng)。D、增殖培養(yǎng)：調(diào)整激素配比進(jìn)行增殖培養(yǎng)？E、煉苗和移栽：在培養(yǎng)箱中打開(kāi)瓶口培養(yǎng)兩天，在轉(zhuǎn)入自然水體中培養(yǎng)。該方法可以不受季節(jié)環(huán)境限制，培養(yǎng)出大量無(wú)菌苗，供水生生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)之用。
【IPC分類(lèi)】A01H4/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105638481
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】水生藻安生物科技（武漢）有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年3月6日